全 文 ：2013 年 10 月 陕西理工学院学报( 自然科学版) Oct． 2013
第 29 卷第 5 期 Journal of Shaanxi University of Technology (Natural Science Edition)
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Vol． 29 No． 5
［文章编号］1673 － 2944(2013)05 － 0064 － 07
苯酚-硫酸法测定石参多糖工艺条件的优化
马 宁1，2， 杨培君1
(1．陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000;2．渭南高级中学，陕西 渭南 714000)
［摘 要］ 石参为百合科独尾草属独尾草( Eremurus chinensis Fedtsch． ) 肉质根加工的稀有山
野菜，主产于秦岭南坡局地。通过单因素和正交试验，研究了苯酚-硫酸法测定石参多糖含量
时各因素对结果的影响，并对这些因素进行了优化和方法学验证。研究结果表明，苯酚用量
1． 6 mL、浓硫酸用量 7． 0 mL、显色时间 30 min、显色温度 80 ℃为苯酚-硫酸法测定石参多糖的
最佳工艺条件，在此条件下平均回收率为 98． 64%，相对标准偏差( ＲSD) 为 1． 40% ;优化后的
苯酚-硫酸法测定石参多糖准确性和稳定性高。比较分析表明，不同植物多糖的苯酚-硫酸法
检测工艺有一定的差异，浓硫酸的加入方式对测定结果有较大影响。
［关 键 词］ 石参; 多糖; 苯酚-硫酸法; 条件优化
［中图分类号］ Ｒ284． 1 ［文献标识码］ A
收稿日期:2013-05-22
基金项目:陕西省教育厅科研计划项目(12JS026)
作者简介:马宁(1984—) ，男，陕西省延安市人，渭南高级中学教师，陕西理工学院硕士研究生，主要研究方向为植物次生
代谢产物;［通讯作者］杨培君(1960—) ，男，陕西省洋县人，陕西理工学院教授，硕士研究生导师，主要研究方向为植物
次生代谢产物。
0 引 言
石参为百合科独尾草属独尾草(Eremurus chinensis Fedtsch．)肉质根加工的一种稀有山野菜。独尾
草属有 20 多种，我国有 4 种，1 种产于西南，3 种产于新疆［1］。陕西省略阳县有独尾草分布，属陕西分布
新记录属植物［2］。石参又名石蒜苔、崖参(陕西略阳) ，是陕南山区稀见的一种山野菜［3］。独尾草属植
物活性成分的研究主要为蒽醌和多糖类物质的提取和测定，如新疆地区分布的异翅独尾草(E． ani-
sopterus Kar． et Kir．)和粗柄独尾草(E． inderiensis M． Bieb．)等研究已有报道［4-6］。多糖是许多中药材
所含的一类大分子化合物，药理作用研究表明，植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和防衰
老等作用［7-12］，其含量是评价中药材质量的一个重要指标，也是目前生命科学研究中最活跃的领域之一。
迄今，多糖含量的测定方法尚无统一标准，主要有蒽酮-硫酸和苯酚-硫酸比色法。文献报道大多采
用 Dubois等［13］提出的苯酚-硫酸法。其原理是:多糖被浓硫酸在适当的高温下水解，产生单糖，并脱水
成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，约在波长 490 nm 处，其吸
光度值与糖质量浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。传统的苯酚-硫酸法存在平行样品间吸
光度相差较大以及空白对照管出现干扰颜色等缺点，使检测的准确性和稳定性较差［14］。本研究以陕西
略阳产石参提取的多糖为供试品，通过单因素和正交试验，对苯酚-硫酸法测定石参多糖含量的显色条
件进行了优化和方法学验证，为评价以多糖为指标的石参产品提供科学依据，从而更好地开发利用其资
源的经济价值。
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1 材料与方法
1． 1 材料、试剂与仪器
供试材料石参购于陕西省汉中市略阳县产地加工产品。烘干，粉碎，过孔径 0． 300 mm筛，备用。
试验中所用乙醇、浓硫酸、苯酚等试剂均为分析纯。
所用仪器为梅特勒 AL204 电子天平(精密度 0． 000 1 g) ，日本岛津 UV-2550 紫外分光光度计，德国
IKA ＲV10 型旋转蒸发仪，超纯水机(成都超纯科技有限公司)等。
6%苯酚溶液的配制:取苯酚 150． 0 g，加 0． 2 g 锌粉和 0． 1 g 无水碳酸钠，蒸馏收集 182 ℃馏分，称
取此馏分 60． 0 g置于 1 000 mL容量瓶中，加水溶解定容，摇匀后置于棕色瓶中，放入冰箱避光保存，备用。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 粗多糖的制备
取一定量石参粉末，置于索氏提取装置中，加入乙醚，45 ℃回流浸提，以脱去表面脂肪，挥干乙醚，
然后加入体积分数 80%乙醇，热回流去杂 3 次，每次 2 h，抽滤。滤渣在 90 ℃、料液比 1 ∶ 50条件下浸提
2 次，每次 3 h。滤液定溶于 250 mL容量瓶中，摇匀，从中取 2． 0 mL 至 50 mL 容量瓶，纯水定容后，摇
匀，即得供试样品溶液。
1． 2． 2 最大吸收波长的确定
取一定量的标准品葡萄糖和供试样品溶液，经苯酚-硫酸显色后，用 UV-2550 紫外-可见分光光度计
于 300 ～ 600 nm波长范围内扫描。
1． 2． 3 单因素实验设计
1． 2． 3． 1 苯酚用量
准确吸取 7 份供试样品溶液 2． 0 mL于试管中，分别加入 6%苯酚溶液 0． 8，1． 0，1． 2，1． 4，1． 6，1． 8
和 2． 0 mL，将试管放入冰水中，沿试管壁缓慢加入浓硫酸 7． 0 mL，待冷却后，在冰水中将其摇匀(以下
均用此方法加入浓硫酸) ，然后在 60 ℃水浴中反应 30 min，取出后冷却到室温，在 1． 2． 2 项确定的波长
处测定吸光度值。
1． 2． 3． 2 浓硫酸用量
准确吸取 7 份供试样品溶液 2． 0 mL 于试管中，分别加入 6%苯酚溶液 1． 6 mL，摇匀，再分别加入
4． 5，5． 0，5． 5，6． 0，6． 5，7． 0 和 7． 5 mL浓硫酸，其它操作同 1． 2． 3． 1 项。
1． 2． 3． 3 显色温度
准确吸取 7 份供试样品溶液 2． 0 mL于试管中，依次加入 6%苯酚溶液 1． 6 mL，浓硫酸 7． 0 mL，摇
匀，分别在 30，40，50，60，70，80 和 90 ℃下加热 30 min，其它操作同 1． 2． 3． 1 项。
1． 2． 3． 4 显色时间
准确吸取 7 份供试样品溶液 2． 0 mL于试管中，依次加入 6%苯酚溶液 1． 6 mL，浓硫酸 7． 0 mL，摇
匀，在 80 ℃下分别加热 5，10，20，30，40，50 和 60 min，其它操作同 1． 2． 3． 1 项。
1． 2． 4 正交试验设计
在上述单因素试验结果基础上进行正交试验，优化工艺。选用 4 因素 3 水平进行 L9(34)正交试
验，以吸光度值为指标，每组作 6 个平行试验，取平均值，得出苯酚-硫酸测定石参多糖含量的最佳方法。
因素水平设计见表 1。
表 1 因素水平表
水平
因素
苯酚量(A)
/mL
浓硫酸量(B)
/mL
显色时间(C)
/min
显色温度(D)
/℃
1 1． 4 6． 5 20 70
2 1． 6 7． 0 30 80
3 1． 8 7． 5 40 90
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第 5 期 马宁，杨培君 苯酚-硫酸法测定石参多糖工艺条件的优化
1． 2． 5 标准曲线的建立
称取 105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖 0． 100 0 g，用纯水定容至 100 mL，充分摇匀后，分别吸取 0． 5，
1． 0，1． 5，2． 0，2． 5，3． 0 mL置于 50 mL容量瓶中，稀释至刻度;分别取 2． 0 mL 于带塞试管中，再精确吸
取 2． 0 mL纯水做空白对照。依据 1． 2． 4 项确定的测定条件，于最大波长处测吸光度值。以质量百分数
为横坐标，吸光度值为纵坐标，得标准曲线和回归方程。
1． 2． 6 加样回收率实验
准确吸取 3 份已知质量浓度(36． 13 μg /mL)的供试样品溶液 1． 0 mL 于带塞试管中，分别加入
20． 0，40． 0 和 60． 0 μg /mL的标准葡萄糖溶液 1． 0 mL，按照标准曲线建立方法测定吸光度值，计算回收
率［15］:
回收率 = 加标试样测定值 － 试样测定值
加标量
× 100%。
1． 2． 7 稳定性实验
按照标准曲线的建立方法，每隔 20 min准确吸取供试样品溶液 2． 0 mL于带塞试管中，分别测定吸
光度值。
1． 2． 8 精密度实验
分别准确吸取 40 μg /mL的葡萄糖标准溶液 2． 0 mL于 6 个带塞试管中，按照标准曲线的建立方法
测定吸光度值。
2 实验结果
2． 1 最大吸收波长
葡萄糖经苯酚-硫酸显色后，在 300 ～ 600 nm范围内扫描葡萄糖的吸收波长，由扫描图谱可看出，葡
萄糖在 490 nm处有最大吸收峰(图 1)。粗多糖经苯酚-硫酸显色后，在 350 ～ 550 nm 范围内扫描其吸
收波长，由图可看出，粗多糖在 490 nm处有最大吸收峰(图 2)。故将 490 nm作为石参粗多糖显色后的
特征吸收峰所在波长。
图 1 葡萄糖显色后紫外扫描图 图 2 石参多糖显色后紫外扫描图
2． 2 单因素实验结果
2． 2． 1 苯酚用量对吸光度值的影响
由图 3 可知，吸光度值随着 6%苯酚用量的增加而增大，苯酚加量为 1． 6 mL 时，吸光度值达到最
大，继续增大苯酚用量，吸光度值有明显的下降。故加入 6%苯酚 1． 6 mL为最佳。
2． 2． 2 浓硫酸用量对吸光度值的影响
随着浓硫酸用量的增加，吸光度值呈上升趋势，在浓硫酸加入量为 7． 0 mL时，吸光度值达到最大。
故选择 7． 0 mL为最佳浓硫酸用量(图 4)。
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陕西理工学院学报(自然科学版) 第 29 卷
图 3 6%苯酚用量对吸光度值的影响 图 4 浓硫酸用量对吸光度值的影响
2． 2． 3 显色时间对吸光度值的影响
由图 5 可知，显色时间 30 min时，吸光度值达到最大，故选择 30 mim为最佳显色时间。
2． 2． 4 显色温度对吸光度值的影响
由图 6 可知，不同显色温度对吸光度值有明显的影响。总体而言，吸光度值随着显色温度的升高而
增大，但温度升高到 80 ℃以后，吸光度值基本稳定。故选择 80 ℃为最佳显色温度。
图 5 显色时间对吸光度值的影响 图 6 显色温度对吸光度值的影响
2． 3 正交试验结果
正交试验结果见表 2，方差分析见表 3。
表 2 正交试验结果
实验号 6%苯酚量(A)/mL 浓硫酸量(B)/mL 显色时间(C)/min 显色温度(D)/℃ 吸光度值
1 1 1 1 1 0． 163
2 1 2 2 2 0． 405
3 1 3 3 3 0． 213
4 2 1 2 3 0． 381
5 2 2 3 1 0． 522
6 2 3 1 2 0． 425
7 3 1 3 2 0． 164
8 3 2 1 3 0． 251
9 3 3 2 1 0． 153
K1 0． 260 0． 236 0． 280 0． 279
K2 0． 443 0． 393 0． 313 0． 331
K3 0． 189 0． 264 0． 300 0． 282
Ｒ 0． 254 0． 157 0． 033 0． 052
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第 5 期 马宁，杨培君 苯酚-硫酸法测定石参多糖工艺条件的优化
表 3 方差分析结果
因素 离差平方和 自由度 方差 F 显著性
A 0． 102 2 0． 051 51． 000 P ＜ 0． 05
B 0． 042 2 0． 021 21． 000 P ＜ 0． 05
C 0． 002 2 0． 001 1． 000 P ＞ 0． 05
D 0． 005 2 0． 003 1． 500 P ＞ 0． 05
误差 0． 002 2 0． 001
注:F0． 05(2，2)= 19;F0． 01(2，2)= 99
由正交试验结果加方差分析可知，各因素对苯酚-硫酸法检测石参多糖吸光度值的影响主次顺序为
A ＞ B ＞ D ＞ C，即 6%苯酚用量 ＞浓硫酸用量 ＞显色温度 ＞显色时间。A，B 两个因素在统计学上均有显
著性差异(P ＜ 0． 05) ，但两者相比，A 因素(6%苯酚用量)对石参多糖苯酚-硫酸法检测的影响更显著，
C，D两个因素无显著性意义(P ＞ 0． 05)。单因素实验结果显示，加 6%苯酚用量1． 6 mL、浓硫酸用量
7． 0 mL时石参多糖含量达到最高值，结合正交试验结果，石参多糖采用苯酚-硫酸法检测的最佳工艺组
图 7 葡萄糖标准曲线和回归方程
合为 A2B2C2D2。
2． 4 标准曲线
葡萄糖标准曲线和回归方程见图 7。回归
方程为:y = 0． 010 6x + 0． 150 2，Ｒ2 = 0． 999 1。
表明多糖含量在 10 ～ 60 μg /mL 质量浓度范围
内线性关系良好。
2． 5 加样回收率实验
由表 4 可知，该试验方法的平均回收率为
98． 64%，ＲSD 为 1． 40%，表明方法的准确性较
高。
表 4 加样回收率测定结果
样品编号 原含量 /μg 加标量 /μg 测得量 /μg 回收率 平均回收率 ＲSD
1 20． 0 55． 92 98． 95%
2 36． 13 40． 0 74． 98 97． 13% 98． 64% 1． 40%
3 60． 0 96． 04 99． 85%
2． 6 稳定性实验
供试样品溶液每隔 20 min测定 1 次，重复测定 6 次，ＲSD 值为 0． 61%，表明石参多糖样品溶液在
2 h内稳定性良好(表 5)。
2． 7 精密度实验
由表 6 知，40 μg /mL标准葡萄糖溶液重复测定 6 次的 ＲSD值为 0． 25%，表明仪器的精密度良好。
表 5 稳定性实验结果
时间 /min 吸光度值 平均值 ＲSD
20 0． 539
40 0． 531
60 0． 535
80 0． 533
100 0． 532
120 0． 530
0． 533 0． 61%
表 6 精密度实验结果
次数 吸光度值 平均值 ＲSD
1 0． 579
2 0． 581
3 0． 577
4 0． 580
5 0． 578
6 0． 578
0． 579 0． 25%
3 分析与讨论
3． 1 不同因素对石参多糖苯酚-硫酸法检测的影响
苯酚用量单因素实验中，加 6%苯酚用量为 1． 6 mL时，吸光度值达到最大，说明此时样品多糖含量
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陕西理工学院学报(自然科学版) 第 29 卷
能被完全检出;若继续增大苯酚用量，吸光度值会有所下降，这是由于一部分苯酚没有参加显色反应，其
氧化产物影响了测定结果。综合考虑各方面因素，选择 1． 4，1． 6 和 1． 8 mL作为苯酚加量的 3 水平进行
正交试验。
据相关文献［16］可知，浓硫酸的添加量是检测多糖实验结果稳定性的一个重要影响因素。本实验
中，当浓硫酸加量达到 7． 0 mL时，吸光度值不再继续增大，且有所下降。由于浓硫酸添加量过多，会导
致显色反应不均匀，致使吸光度值有所波动。基于上述分析，选择 6． 5，7． 0 和 7． 5 mL 作为正交试验中
浓硫酸加量的 3 个水平。
分析显色时间单因素实验结果可知，显色时间过短，显色反应不能充分进行，吸光度值较小;当显色
时间达到 30 min时，吸光度值达到最大，且随着显色时间的延长，基本保持不变。为节约时间及降低能
耗，选择 20，30 和 40 min为显色时间的 3 个水平进行正交试验。
显色温度单因素实验结果显示，当显色温度达到 80 ℃以后，增加温度对吸光度值的影响不明显，温
度过高会使显色液水分蒸发，并且破坏石参多糖结构，从而影响检测结果。综合考虑，选择 70，80 和
90 ℃为显色温度的 3 个水平进行正交试验。
正交试验结果表明，苯酚-硫酸法测定石参多糖最佳显色条件为:6%苯酚加量 1． 6 mL、浓硫酸加量
7． 0 mL、显色时间 30 min、显色温度 80 ℃。方差分析表明，苯酚和浓硫酸用量对测定结果的影响显著，
显色温度和时间对测定结果的影响并无显著意义。实验中需要注意操作的准确性、仪器的精密度，以及
平行样的数目，即能得到良好的测定结果。
3． 2 不同植物多糖的苯酚-硫酸法检测工艺有一定的差异
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚-硫酸比色法［17］，该方法具有简单、便
捷、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性和非水溶性样品均可测定，但实验稳定性欠佳，通常需
要通过单因素或正交试验对检测条件进行优化。茆广华等［18］运用单因素和正交试验对银杏外种皮多
糖的苯酚-硫酸测定方法进行了优化，最佳条件为:5%苯酚 1． 2 mL，浓硫酸 4． 0 mL，30 ℃显色温度条件
下显色 20 min，其中浓硫酸用量是影响显色的重要因素。周跃斌等［19］运用单因素实验对毛竹叶多糖苯
酚-硫酸检测方法进行了优化，结果表明，5%苯酚用量 2． 0 mL、浓硫酸 7． 0 mL、室温下显色 20 min 为最
佳条件。郭金龙等［14］采用单因素实验对苯酚-硫酸法测定杏鲍菇多糖含量时的各因素进行了优化，实
验显示，5%苯酚用量 1． 4 mL、浓硫酸 6． 0 mL、反应温度 40 ℃、显色时间 15 min为最优工艺条件。
比较分析以上研究结果可知，使用苯酚-硫酸比色法检测不同材料的多糖含量时，要对方法进行优
化。由于多糖为大分子化合物，不同多糖的结构和组成有很大的差异，将其水解为单糖的难易程度也不
相同，导致检测工艺的差异。
3． 3 浓硫酸的加入方式对测定结果有较大影响
根据苯酚-硫酸比色法测定多糖含量原理可知，多糖是被浓硫酸在适当的高温下水解，产生单糖，从
而完成显色反应。目前，文献中关于水解多糖所需适当温度的观点不一致。裴瑾等［20］使用苯酚-硫酸
法测定远志及地上部分多糖含量时，选择快速加入浓硫酸 5 mL，室温放置 5 min 后，再进行水浴显色。
郭金龙等［14］认为加入浓硫酸时需要控制硫酸的加入方式、时间和体积，从而使测定结果更加稳定。本
实验是在冰浴中缓慢沿试管壁加入浓硫酸，并在冰浴中将显色液摇匀，这样一方面保证了空白管不会出
现颜色，也使得显色温度不受浓硫酸放热的影响，而完全依靠水浴温度达到显色需要的温度，实验结果
更准确。
优化后的苯酚-硫酸法测定石参多糖具有操作简便、无需多糖纯品、显色稳定、重现性好等特点，可
以在常规实验条件下完成石参多糖的检测。
［ 参 考 文 献 ］
［1］ 中国科学院中国植物志编委会．中国植物志:第 14 卷［M］．北京:科学出版社，1980:35-38．
［2］ 王勇，杨培君．陕西省百合科一新纪录属──独尾草属［J］．西北植物学报，2007，27(10) :2116-2117．
·96·
第 5 期 马宁，杨培君 苯酚-硫酸法测定石参多糖工艺条件的优化
［3］ 李新生，杨培君，李会宁，等．陕西地区石参资源的调查［J］．氨基酸和生物资源，2002，24(3) :1-2．
［4］ 刘金荣，江发寿，但建明，等．独尾草多糖的超声提取及含量测定［J］．中草药，2002，33(4) :322-323．
［5］ 相颖，刘金荣，李梅，等．异翅独尾草蒽醌类成分的提取工艺［J］．石河子大学学报，2007，25(2) :214-216．
［6］ 马淼，骆世洪．沙生异翅独尾草不同器官中蒽醌含量的消长规律［J］．时珍国医国药，2007，18(11) :2624-2626．
［7］ 成静，祝寿．大刺猴头多糖的免疫调节功能［J］．卫生毒理学杂质，2001，9(2) :165-166．
［8］ 蔡永春．中药多糖防治肿瘤研究进展［J］．中西医结合杂志，2001，21(12) :945-947．
［9］ 郑子瑞，戴玲，钟辉．多糖抗病毒活性的研究进展［J］．生物技术通讯，2008，19(5) :763-764．
［10］ 张莅峡，刘泓，常雅萍．红毛五加多糖抗病毒效应的实验研究［J］．中国中医基础医学杂志，1999，5(3) :25-27．
［11］ 辛晓林．中药多糖抗氧化作用研究进展［J］．中国中医药大学学报，2000，23(5) :45-46．
［12］ 郭景仙．重要多糖类成分抗衰老作用的现代研究与应用［J］．中国自然医学杂志，2000，2(3) :91-92．
［13］ Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K，et al． Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］．
Anal chem．，1956，28(3) :350-356．
［14］ 郭金龙，陈有君，孙国琴，等．苯酚-硫酸法测定杏鲍菇多糖方法的研究［J］．食品科学，2008，29(12) :555-558．
［15］ 任成忠，毛丽芬．加标回收实验的实施及回收率计算的研究［J］．工业安全与环保，2006，32(2) :9-11．
［16］ 于宙．猴头多糖的提取和分析［J］．安徽农业科学，1997，25(1) :51-53．
［17］ 张青，张天民．苯酚-硫酸比色法测定多糖含量［J］．山东食品科技，2004，25(7) :17-18．
［18］ 茆广华，吴向阳，仰榴青，等．苯酚-硫酸法测定银杏外种皮多糖的含量［J］．食品科技，2008，21(6) :197-199．
［19］ 周跃斌，王伟，周向荣，等．苯酚-硫酸比色法测定毛竹叶多糖的研究［J］．现代食品科技，2008，24(2) :180-183．
［20］ 裴瑾，万德光，杨林，等．苯酚-硫酸比色法测定远志及地上部分多糖的含量［J］．华西药学杂志，2005，20(4) :337-339．
［责任编辑:魏 强］
The optimization on phenol-sulfuric acid method for determination
of Shishen polysaccharide (Eremurus chinensis)
MA Ning1，2 YANG Pei-jun1
(1． School of Biological Sciences and Engineering，Shaanxi University of Technology，
Hanzhong 723000，China;
2． Weinan Senior Middle School，Weinan 714000，China)
Abstract: Shishen，a rare edible wild herb produced in Qinling Mountains，is the process fleshy roots
from Eremurus chinensis belonging to genus of Eremurus，Liliaceae． Through the single factor experiments and
orthogonal experiments，the factors affecting the determination of polysaccharide content in Shishen (E．
chinensis)with phenol-sulfuric acid method were optimized． The results showed that the optimum determina-
tion conditions were 1． 6 mL phenol，7． 0 mL sulphuric acid，80 ℃ reaction temperature and 30 min reaction
time． The average recovery was up to 98． 64%，and the ＲSD was 1． 40% ． The comparative analysis indicated
that the way used with phenol-sulfuric acid and how to add sulphuric acid maybe result in a great of influence
to the results for different polysaccharides test． In addition，the modified phenol-sulfuric acid method to deter-
minate polysaccharides is accurate and steady．
Key words: Shishen(Eremurus chinensis) ;polysaccharide; phenol-sulfuric acid method; process
optimization
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陕西理工学院学报(自然科学版) 第 29 卷