全 文 ：收稿日期:2010-08-14; 修订日期:2010-11-01
基金项目:国家自然科学基金(No． 30860365) ;
大理学院药物研究所基金(No． 2008YY003)
作者简介:张 桢(1976-) ，男(彝族) ，云南凤庆人，现任大理学院药学院
副教授，硕士学位，主要从事抗病毒天然药物有效成分分离与分析研究工
作．
* 通讯作者简介:刘光明(1953-) ，男(汉族) ，云南泸西人，现任大理学院
药学院教授，硕士学位，主要从事抗病毒天然药物研究工作．
高速逆流色谱法分离纯化松塔中的化学成分研究
张 桢1，肖 怀1，晋晓峰2，杨永寿1，刘光明1*
(1．大理学院·药学院，云南 大理 671000; 2．上海同田生物技术有限公司，上海 201203)
摘要:目的 为了寻找抗 HIV活性单体化合物，研究华山松 Pinus armandii Franch．松塔的化学成分。方法 应用高速逆流
色谱仪，以正己烷 －正丁醇 － 甲醇 －水 －乙酸(1∶ 7∶ 1∶ 7∶ 0． 15，V / V)上相为固定相，下相为流动相，组成溶剂系统
对华山松松塔的提取物行分离纯化。结果 分离到两个化合物，根据理化性质和波谱数据，鉴定了它们的化学结构:4 －
(1，2 －二羟基异丙基)环己烯甲酸(Ⅰ) ;4 －羟基苯甲酸甲酯(Ⅱ)。结论 首次采用制备型高速逆流色谱仪 TBE2300A
对华山松松塔的成分进行分离纯化，并首次从该属植物中分离化合物Ⅰ和Ⅱ。
关键词:高速逆流色谱; 化学成分; 华山松
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 05． 002
中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2011)05-1040-02
Chemical Constituents from Pinus armandii Franch． by High － speed Counter － current
Chromatography
ZHANG Zhen1，XIAO Huai1，JIN Xiao-feng2，YANG Yong-shou1，LIU Guang-ming1*
(1． College of Pharmacology，Dali University，Dali，671000，China;2． Shanghai Tauto Biotech CO．，Ltd．，
Shanghai 201203，China)
Abstract:Objective To study the chemical constituents from Pinus armandii Franch． aiming at searching for anti － HIV com-
pounds． Methods High － speed counter － current chromatography (HSCCC)was employed first to separate and purify com-
pounds． A biphasic solvent system composed of n － hexane － n － butanol － methanol － water － acetic acid (1∶ 7∶ 1∶ 7∶ 0． 15，
volume ratio)was used． Results Two compounds were isolated and their structure were identified as:4 －(1，2 － dihydroxy iso
－ propyl)cyclohexene carboxylic acid(Ⅰ) ，methyl － p － hydroxybenzoate(Ⅱ)． Conclusion All these compounds were isolated
from this plant for the first time by HSCCC．
Key words:HSCCC; Chemical constituents; Pinus armandii Franch．
松塔中含有高效低毒且同时具有抗癌、抗 HIV 的活性成
分［1］。因此，我们对华山松的松塔进行初步研究，发现华山松松
塔提取物的抗 HIV 活性显著。华山松 Pinus armandii Franch． 系
松科(Pinaceae)松属(Pinus)植物，在云南，每年均有上万吨华山
松松塔被农民作为燃料。对其深入研究，可研发成高效低毒的治
疗艾滋病新药，同时还可变废为宝，为农民致富及为云南的经济
发展开拓一个新增长点。
高速逆流色谱(High － speed Counter － current Chromatogra-
phy，HSCCC)是一种以液体作为固定相的新型液相色谱技术，
适用于制备分离，因此该技术被广泛用于天然产物中有效成分的
提取和中药的分析鉴定［2 ～ 5］。本文首次运用了 HSCCC方法对华
山松松塔进行了研究，从中分离纯化了两个化合物，并进行了结
构鉴定。
1 仪器与材料
1． 1 仪器与试剂 TBE － 20A 和 TBE300A 高速逆流色谱仪(上
海同田生化技术有限公司) ;AKTA prime 泵及检测系统(瑞士安
玛西亚生物有限公司) ;安捷伦 1100 型液相色谱仪;MCI GEL 来
自三菱化学公司;Pharmadex LH － 20 来自于安玛西亚生物技术
(上海)有限公司;EI － MS 用 VG AutoSpec － 3000 型质谱仪测
定;NMR用 Bruker DRX － 500 超导核磁共振仪测定，TMS 为内
标。薄层层析板和各种规格的柱层析硅胶均来自于青岛海洋化
工厂。
1． 2 样品准备 样品采集于云南省大理州巍山县，标本由大理学
院马晓匡教授鉴定。华山松干燥的松塔 10kg，粉碎后经 95%乙
醇冷浸提取 3 次，合并提取液减压回收溶剂得到浸膏，将浓缩后
的提取物加适量的水悬浮，分别用石油醚、氯仿、醋酸乙酯和正丁
醇萃取。醋酸乙酯萃取物用 MCI GEL 柱色谱法分离，水和甲醇
梯度洗脱(7∶ 3，5∶ 5，3∶ 7，每一梯度 5L) ，5∶ 5 梯度洗脱流分
用 TLC检测，合并相同部分，得样品 A ～ F。B 经 sephadex LH －
20柱层析(甲醇为洗脱剂) ，得样品 B1(为本次 HSCCC 分离样
品)。
2 方法
2． 1 HPLC 检测色谱条件 水和甲醇梯度洗脱(90 /20;70 /30;
50 /50;30 /70;0 /100，每 5 分钟一个梯度) ;柱温 30℃，流速为 1． 0
ml / min ，紫外 280 和 254 nm波长检测。色谱柱为 Agilent ZOR-
BAX SB － 18 (4． 6 mm × 150 mm，5． 0 μm)。
2． 2 两相溶剂系统及样品溶液的制备 HSCCC 溶剂系统为正己
烷 －正丁醇 － 甲醇 －水 －乙酸 (1∶ 7∶ 1∶ 7∶ 0． 15 ，V / V) ，
按其比例分别将各种溶剂加入分液漏斗中，剧烈振荡使溶液充分
混合，分相平衡后分出上相和下相，使用前分别用超声脱气 30
min 。取约 500 mg 样品，溶于 10 ml下相中，振荡使之完全溶解，
以备 HSCCC 进样。
2． 3 HSCCC 分离过程 用 AKTA prime 系统将上相(固定相)泵
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时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 5 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL． 22 NO． 5
入 HSCCC 螺旋管，待螺旋管完全充满后，调整螺旋管转速为 850
r / min(正转) ，同时以 3 ml / min的流速泵入流动相。待下相流
出螺旋管后，测量上相体积，计算保留率。将样品通过进样阀注
入分离螺旋管。分离温度 25 ℃，紫外检测器检测柱后流出物，检
测波长为 280 nm，进样时开始记录色谱图，并根据色谱图手动收
集各色谱峰组分(分别在 210 ～ 225 min和 240 ～ 247 min)。
3 结果
3． 1 HSCCC操作条件的优化 样品 B1 按“2． 1”项色谱条件，进
行 HPLC分析。分析 HPLC谱图，发现样品 B1 中化合物极性比较
大，主要集中 5 ～ 10min出峰，故用分析型 TBE － 20A 高速逆流色
谱仪进行分析时，采用强极性的溶剂系统(正己烷 －正丁醇 －
甲醇 －水 －乙酸) ，流速 0． 5 ml / min，850 r /min(正转)。当正
己烷 －正丁醇 － 甲醇 －水 －乙酸体积比为 1∶ 6 ∶ 1 ∶ 6 ∶ 0．
10，虽然保留率为 55%，但只有一个大峰出现(25 min) ;故加大
溶剂系统的极性:正己烷 －正丁醇 － 甲醇 －水 －乙酸(1∶ 7∶
1∶ 7∶ 0． 15) ，尽管此溶剂系统保留率较低，仅为 35%，但在 35
～ 60 min之间有吸收峰，确定溶剂体系为正己烷 －正丁醇 － 甲
醇 －水 －乙酸(1∶ 7∶ 1∶ 7∶ 0． 15)。用制备型 TBE300A 高速
逆流色谱仪继续寻找进样量条件，进样量分别为 50，100，150 mg
逐渐加大，随进样量增大到 150 mg，出现分离度较差，故确定最
大进样量为 100 mg。
综上所述，优化后的实验参数为:正己烷 －正丁醇 － 甲醇
－水 －乙酸(1∶ 7∶ 1∶ 7∶ 0． 15) ，转速为 850 r / min(正转) ，流
速:3． 0 ml / min ;进样量为 100 mg，温度 25 ℃。图 1 为上述条件
下的 HSCCC图谱。从 100 mg样品中，分离得到两种化合物的量
分别是 27 和 33 mg，纯度分别达 97． 15%和 96． 7%。
图 1 在优化条件下 HSCCC图谱
尽管溶剂体系的选择和优化是一项复杂而艰巨的工作，但本
次实验首先用 HPLC扫描法对一个未知样品进行扫描，初步了解
样品的复杂程度及其组分的极性大小程度。然后再结合分析型
HSCCC法，来选择制备型分离时所用的溶剂体系。因分析型
HSCCC 具有体积小、速度快、溶剂消耗量小等特点，对溶剂体系
的初步筛选中进行快速实验和适当的比例调整，使本次实验达
到事半功倍的效果。
3． 2 结构鉴定
3． 2． 1 化合物Ⅰ［4 －(1，2 －二羟基异丙基)环己烯甲酸］白
色晶体，易溶于甲醇。EI － MS m/z:201 ［M + H］+;分子式为
C10H16O4;
1H － NMR (CD3OD，500 MHz)δ:7． 01 (1H，brs，H
－2) ，2． 03 (1H，brs，H － 3a) ，2． 04 (1H，brs，H － 3b) ，1． 74
(1H，m，H －4) ，1． 29 (1H，brs，H －5a) ，1． 75 (1H，brs，H －
5b) ，2． 11 (1H，brs，H － 6a) ，2． 05 (1H，brs，H － 6b) ，3． 44
(1H，d，J = 7． 36，H －1a) ，3． 88 (1H，d，J = 7． 36，H －1b) ，
1． 29 (1H，s，H － 3or － CH3) ;
13C － NMR (CD3OD，125 MHz)
δ:131． 7 (s，C － 1) ，140． 9 (d，C － 2) ，24． 6 (t，C － 3) ，40． 7
(d，C － 4) ，20． 4(t，C － 5) ，26． 4(t，C － 6) ，171(s，C － 7) ，
69． 1(t，C － 1) ，75(s，C － 2) ，10(q，C － 3)。以上数据与文
献［6］对照一致，故鉴定 4 －(1，2 －二羟基异丙基)环己烯甲
酸。
3． 2． 2 化合物Ⅱ (4 －羟基苯甲酸甲酯 )无色针状晶体，易溶
于甲醇，EI － MS m/z:153［M + H］+;分子式为 C8H8O3;
1H －
NMR (CD3OD，500 MHz)δ:7． 91 (2H，d，J = 8． 67，H －2，6) ，
6． 86 (2H，d，J = 8． 67，H －3，5) ，3． 67 (－ OCH3) ;
13C － NMR
(CD3OD，125 MHz)δ:127． 6 (s，C － 1) ，132． 4 (d，C － 2，6) ，
116． 3 (d，C － 3，5) ，164． 3 (s，C － 4) ，167 (－ COOCH3) ，
52． 2(－ OCH3)。以上数据与文献［7］对照一致，故鉴定为 4 －羟
基苯甲酸甲酯。
4 结论
本实验首次采用制备型高速逆流色谱仪 TBE2300A 对华山
松的成分进行分离纯化。实验过程中对溶剂系统和参数条件进
行系统的优化，在最佳分离条件下，分离获得 4 －(1，2 －二羟
基异丙基)环己烯甲酸(Ⅰ)和 4 － 羟基苯甲酸甲酯(Ⅱ)。和
HPLC的半制备方法相比，高速逆流色谱进样量更大，可分离纯
化更多的样品。
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