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高效液相色谱法快速测定卷柏药材中穗花杉双黄酮含量
张建华1 , 杨帆2 , 申健2 , 李福双2 , 刘建锋2 , 谭桂山2 , 徐康平2＊(1.湖南省东安县疾病预防控制中心 , 湖南永
州　425900;2.中南大学药学院 , 长沙　410013)
摘要:目的　建立中药卷柏中特征性成分穗花杉双黄酮的快速含量分析方法 , 比较其在不同卷柏药材中的含量差
异。方法　采用岛津 VP-ODS 色谱柱 (4.6 mm×250 mm , 5 μm), 流动相为乙腈-0.2%醋酸水溶液 , 梯度洗脱 , 流
速为 1.2 mL·min-1 , 检测波长为 338 nm , 柱温为 30 ℃, 进样量 10 μL 。结果　穗花杉双黄酮在 0.295 ～ 8.853 μg
线性关系良好(r=0.999 99 ), 平均加样回收率为 99.34%, RSD 为 0.94% (n=6), 其在卷柏药材中的含量为
2.176～ 8.186 mg · g -1 。结论　穗花杉双黄酮在不同产地 、 不同品种卷柏中差异较大 , 本试验为卷柏药材质量评价
和优良品种筛选提供简便快捷的方法。
关键词:卷柏;穗花杉双黄酮;高效液相色谱法
中图分类号:R927.2 , R284.1　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1672-2981 (2009)07-0487-03
Rapid detemination of amentoflavone in Selagingella by HPLC
ZH ANG Jian-hua1 , YANG Fan2 , S HEN Jian2 , L I Fu-shuang 2 , LIU Jian-feng2 , TAN Gui-shan2 , XU Kang-ping 2＊
(1.Center for Disease Control and Prevention of Dong an County , Yongzhou H unan 425900;2.School of Phar-
maceutica l S ciences , Central South Univ ersity , Changsha 410013)
Abstract:Objective　 To establish a rapid HPLC me thod for the determination of amentoflavone in 4 he rbs of Selagin-
gella Spring.Methods　HPLC analy sis wa s carried out on SH IMADZU VP-ODS (4.6 mm × 250 mm , 5 μm )at
30 ℃.The mobile phase w as ACN-0.2%HAc.The flow rate w as 1.2 mL ·min-1 .The de tection waveleng th was
338 nm.Results　The linear range o f amentof lavone w as 0.295 ～ 8.853 μg (r= 0.999 99 ), the average recovery of
this method w as 99.34%, and the RSD was 0.94%(n=6).The content of amento flavone in different samples was
at 2.176～ 8.186 mg· g -1 .Conclusion　The contents of amentoflavone are obviouslly diffe rent in he rbs of S elaginella
with diffe rent localitie s and species.This quantitative mea surement method pro vides a simple and rapid way for the
quality contr ol and species selection.
Key words:Selaginge lla;amento flav one;HPLC
　　卷柏属植物分布广泛 , 全世界共有 700 余种 , 我国有 70
余种。中国药典 2005 年版一部收载了卷柏 S elaginella tam-
ariscina (Beauv.)Spring 和垫状卷柏 S.pulv inata(Hook.
Et Grev.)Maxim 2 个品种[ 1] 。现代药理研究表明 , 卷柏属
植物不仅具有传统的消炎解毒作用 , 而且具有降血压 、 降血
糖 、 抗菌 、 抗病毒 、 增强免疫功能和抑制氧化应激等作
用[ 2-5] 。卷柏属化学成分主要为以穗花杉双黄酮 (ament-
o flav one)为主的双黄酮类化合物 , 自 1971 年 Masayo shi
Okig aw a[ 6] 等从卷柏中分出穗花杉双黄酮以来 , 相继有 50 余
种双黄酮类成分从本属分离得到 , 其中均含有穗花杉双黄
酮 , 且含量最高。穗花杉双黄酮具有抗肿瘤 、 抗炎 、 抗菌 、
血管舒张作用等生理活性[ 7-10] , 是卷柏类药材的特征性成
分 , 本文建立一种快速有效的穗花杉双黄酮分析方法 , 比较
不同产地 、 不同品种卷柏药材的含量分布 , 从而为卷柏药材
的质量控制提供理论依据 , 并为优良品种的筛选奠定基础 。
1　仪器与试药
Ag ilent 1100型高效液相色谱仪(配备低压四元泵 、 自
动进样器 、 柱温箱 、 DAD 检测器 、 ChemStations 色谱工作
站 , 美国安捷伦科技有限公司);UVProbe-2450 紫外可见
分光光度仪(日本岛津公司);BP211D 电子天平(0.000 01 g ,
德国塞多利斯公司)。
穗花杉双黄酮 (amentoflavone)对照品 (自制 , UV 、
IR、 H1NMR、 C13NM R鉴定结构 , 经 H PLC 检测 , 归一化
法计算纯度>99.0%)。乙腈为色谱纯 , 水为纯净水并经
0.45 μm 水系滤膜过滤 , 其余试剂均为分析纯。
　　垫状卷柏药材 (2004 年购于湖南邵阳廉桥药材市场),
卷柏药材 (湖南省九芝堂药材公司 , 详见表 2), 经本院李劲
平副教授分别鉴定为 S.pulvinata(Hook.et G rev.)Maxim.
　　基金项目:国家自然科学基金资助项目 (编号:30873149), 中南大学贵重仪器共享基金资助项目 (编号:ZKJ2008046)。
作者简介:张建华 , 男 , 副主任药师 , 主要从事医院临床药学工作 , Tel:13607464583 , E-mai l:838357619@qq.com 　　＊通讯作者:
徐康平 , 男 , 讲师 , 主要从事天然药物物质基础研究和药物分析工作 , Tel:(0731) 82650449 , E-mail:xu kp376@yah oo.com.cn
中南药学 2009年 July 月第 7卷第 7期　Cen t ral South Pharmacy.July 2009, Vol.7 No.7
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和 S.tamariscina(Beauv.)Spring;卷柏和垫状卷柏对照
药材 (中国药品生物制品检定所 , 批号分别为 121116-
200503 、 121104-100301)。
2　方法与结果
2.1　色谱条件
本实验采用色谱柱为日本岛津公司 VP -ODS 柱
(4.6 mm×250 mm , 5 μm), 流动相为乙腈-0.2%醋酸水溶
液 , 梯度洗脱(ACN%:0 min 25%, 20 min 30%), 流速为
1.2 m L·min -1 , 检测波长为 338 nm , 柱温为 30 ℃, 进样
10 μL。
2.2　系统适应性试验
在上述色谱条件下 , 穗花杉双黄酮色谱峰理论塔板数>
105 , 对称因子为 1.10 , 与相邻杂质峰的分离度>1.5。对照
品穗花杉双黄酮以及供试品色谱图见图 1。
图 1　对照品 (A)与供试品 (B 、 C)色谱图
Fig 1　Ch rom atogram of references(A )and samples (B , C)
A.穗花杉双黄酮色谱图 (chromatogram of amen tof lavone);B.卷
柏对照药材供试品色谱图 (ch romatogram of S.tamariscina);C.
垫状卷柏对照药材供试品色谱图 (ch romatogram of S.pulvinata)
2.3　对照品溶液的制备
精密称取穗花杉双黄酮约 30.00 mg , 置 100 mL 容量瓶
中 , 甲醇超声溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 经 0.45 μm 微孔滤
膜滤过 , 即得。
2.4　供试品溶液的制备
精密称取药材粗粉 (过 20 目筛)约 20.0 g , 加甲醇 160
mL· 次-1 , 回流提取 3 次 , 60 min· 次-1 , 合并提取液 , 趁
热过滤 , 减压浓缩 , 转移至 50 m L容量瓶中 , 甲醇稀释至刻
度 , 摇匀 , 经 0.45 μm 微孔滤膜滤过 , 即得。
2.5　线性关系的考察与检测限
分别精密量取 “ 2.3” 项下的对照品溶液 1、 2、 5 、 10 、
20 、 30 μL注入到液相色谱仪 , 以进样量 X (μg)对色谱峰
面积 Y 进行线性回归求得线性方程为:Y =3 102X +16.50
(r=0.999 99), 线性范围为 0.295 ～ 8.853 μg。 以 3 倍信噪
比 (S/ N ≈ 3)求得穗花杉双黄酮的检测限为 2 ng 。结果
表明:线性范围较宽 , 检测限低。
2.6　精密度 、 稳定性及重复性试验　在 “ 2.1” 项色谱条件
下 , 对同一份供试品溶液重复进样 6 次 , 测得穗花杉双黄酮
的峰面积 , 计算 RSD 为 0.82 %, 表明仪器精密度良好。
取同一份供试品溶液依次在 0、 2 、 4、 8 、 12、 24、 48 h
测定穗花杉双黄酮的峰面积 , 计算 RSD 为 0.91 %, 表明供
试品溶液在室温下 48 h 内稳定。
取同一批垫状卷柏药材 , 按 “ 2.4” 项下方法平行制备 6
份 , 测定穗花杉双黄酮的含量并计算 RSD 为 1.15 %, 表明
该方法的重复性符合含量测定要求。
2.7　回收率试验　取穗花杉双黄酮对照品适量 , 精密称定 ,
加甲醇制成浓度为 0.423 mg· mL-1的溶液 , 作为回收率试
验的对照品添加溶液。取同一批已知含量的垫状卷柏药材
(amentoflav one:2.176 mg · g-1)约 10.0 g , 精密称定 , 定
量加入上述对照品添加溶液 50 mL , 按 “2.4” 项下制备方
法 , 平行制备 6 份 , 测定并计算加样回收率和 RSD , 结果见
表 1。
表 1　加样回收率试验结果 (n=6)
Tab 1　Recovery test (n=6)
样品含量
(content)
/mg
加入量
(added)
/mg
测得量
(determined)
/mg
回收率
(recovery)
/ %
平均回收率
(average
recovery)
/ %
RSD
/ %
21.873 21.150 40.076 98.94
21.919 21.150 42.399 100.47
21.895 21.150 41.951 98.35
21.880 21.150 41.963 98.41 99.34 0.94
21.821 21.150 42.382 100.39
21.814 21.150 42.186 99.46
2.8　样品分析　取药材各 2 份 , 按 “ 2.4” 项下方法和
“ 2.1” 项下色谱条件测定峰面积积分值 , 外标标准曲线法计
算含量 , 结果见表 2。
表 2　样品测定结果
Tab 2　Content determination of samples
样品
(sample)
批号
(lot No.)
产地
(areas)
穗花杉双黄酮含量
(conten t)/mg· g -1
卷柏 060828 江西 6.231
卷柏 040428 湖北 7.522
卷柏 071516 中南 8.139
卷柏 121116-200503 对照药材 8.186
垫状卷柏 未知 湖南邵阳 2.176
垫状卷柏 121104-100301 对照药材 2.288
3　讨论
3.1　提取方法选择
在提取方法的考察试验中 , 分别考察了超声与加热回流
提取 , 提取 2、 3 、 4 次 , 提取 30、 60、 90 min , 结果表明回
流提取 3次 , 60 min·次-1可将穗花杉双黄酮提取完全。
3.2　检测波长选择
应用二极管阵列检测器在 200 ～ 400 nm 对穗花杉双黄酮
Cen t ral South Pharmacy.Ju ly 2009 , Vol.7 No.7　中南药学 2009年 7月第 7卷第 7期
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色谱峰进行扫描:穗花杉双黄酮在 338 nm 处有最大吸收 ,
亦为双黄酮类化合物的特征吸收 , 故选择 338 nm 作为检测
波长。
3.3　洗脱条件选择
在洗脱条件的摸索中, 首先考察乙腈-0.2%醋酸溶液等
度洗脱 , 结果表明 , 样品分离度低 , 峰形拖尾 , 分离效果不理
想。经过反复比较 , 选择乙腈-0.2%醋酸溶液梯度洗脱条件
(ACN%:0 min 25%, 20 min 30%), 达到较满意分离效果。
3.4　穗花杉双黄酮含量差异分析
由测定结果可以看出 , 穗花杉双黄酮在不同卷柏药材中
的含量存在较大差异 , 以卷柏含量最高 , 垫状卷柏含量最
低。说明穗花杉双黄酮在药材中的含量分布可能与种属及生
长环境有关 , 本分析方法有望为优良卷柏药材的培育及筛选
提供依据。
3.5　意义
中国药典 2005 年版中仅建立了以卷柏对照药材进行薄
层定性鉴别的方法 , 未进行定量控制[ 1] , 文献报道的含量测
定方法或测定非特征性成分如腺苷 、 纤维素酶 、 海藻糖
等[ 11-13] , 或在双黄酮类成分中分析 , 存在检测时间较长 、 与
相邻峰的分离度低的问题[14 ,15] , 为此作者建立了一种快速定
量分析卷柏属典型双黄酮类化合物穗花杉双黄酮的 H PLC
方法 , 并对不同产地 、 不同品种卷柏药材进行了测定。结果
表明 , 该方法操作简单 、 快速 、 准确 , 灵敏度高 , 重现性好 ,
可为卷柏药材的质量控制提供理论依据。
参考文献
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(收稿日期:2009-03-09;修回日期:2009-05-21)
超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法
研究辛伐他汀片的生物等效性
罗昭1 , 2 , 朱荣华1＊ , 彭文兴1 , 谭亲友1 , 赵瑞柯1 , 唐靖1 , 李焕德1 (1.中南大学湘雅二医院临床药学研究
室 , 长沙　410011;2.广东省东莞市厚街医院药剂科 , 广东东莞　523945)
摘要:目的　建立测定人血浆中辛伐他汀浓度的超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS)法 , 并将其应用于辛
伐他汀片的药物动力学和生物等效性研究。方法　生物等效性试验采用随机分组 , 两周期交叉设计 , 18 名健康男
性志愿者单剂量口服 40 mg 辛伐他汀受试制剂或参比制剂。血浆样品经液液萃取 , 其血药浓度采用所建立的 UP-
LC-MS/MS 测定。结果　本法测定血浆中辛伐他汀的线性范围为 0.134 ～ 17.920 ng ·m L-1 , 其日内及日间精密度
RSD均在 7.3%之内。志愿者单次服用 40 mg 辛伐他汀受试制剂和参比制剂后的药动学参数 AUC0 ～ 12分别为
(37.321±16.411)和 (36.213±15.374)ng · h·m L-1 , Cmax分别为 (9.585±5.225)和 (9.582 ±4.513)ng ·
mL-1 , tmax分别为 (1.86±0.56)和 (1.81±0.64)h。相对生物利用度为 103.02%±13.79%。 结论　所建立的
　　作者简介:罗昭 , 男 , 中南大学湘雅二医院进修生 , 主要从事临床药学工作。 　　＊通讯作者:朱荣华 , 男 , 主管药师, 主要从事药物
分析和新药评价工作 , Tel:(0731)85292099 , E-mail:zh urh0815@yahoo.com.cn
中南药学 2009年 July 月第 7卷第 7期　Cen t ral South Pharmacy.July 2009, Vol.7 No.7