全 文 ：［收稿日期］ 20131023(012)
［第一作者］ 黄振青，学士学位，讲师，从事中药抗乙肝及肝纤维化的研究，Tel:0771-2214279，E-mail:huangzhenqing@ 126. com
［通讯作者］ * 赵铁建，教授，从事中医药、民族药对肝纤维化的逆转机制研究及应用，Tel:0771-2214279，E-mail:lzt-jnanning@ 163. com
穗花杉双黄酮对急性肝损伤大鼠炎症相关因子的影响
黄振青，韦燕飞，刘雪梅，段雪琳，赵铁建*
( 广西中医药大学，南宁 530001)
［摘要］ 目的:研究穗花杉双黄酮(ATF)对四氯化碳(CCl4)诱导急性肝损伤大鼠炎症相关因子的影响。方法:将健康雄
性 SD大鼠随机分为正常对照组，损伤模型组，阳性对照组，穗花杉双黄酮低、中、高剂量组(15，30，60 mg·kg －1)，连续给药 7
d，末次灌胃给药 1 h后，腹腔注射 CCl4 原液建立急性肝损伤大鼠模型，采用 ELISA法分别检测各组大鼠血清肿瘤坏死因子-α
(TNF-α)，转化生长因子 β1(TGF-β1)，白介素 1β(IL-1β)，白细胞介素 6(IL-6)的含量和肝组织核因子-κB (NF-κB)，磷酸化抑
制蛋白(nuclear factor kappa B inhibitor protein，IκB-α)的水平，采用鲎试剂终点显色法检测大鼠血浆内毒素(LPS)水平，Ｒeal
time PCＲ法检测肝组织 TNF-α和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达。结果:与正常组比较，模型组大鼠血清 TNF-α，
TGF-β1，IL-1β，IL-6 的含量显著升高(P ＜ 0. 01)，大鼠血浆内毒素水平明显提高(P ＜ 0. 01)，肝组织 NF-kB 和磷酸化 IκB-α 的
水平也明显升高(P ＜ 0. 01)，肝组织 TNF-α和 iNOS基因的表达也显著上调(P ＜ 0. 01)。与模型组比较，ATF能显著降低血清
TNF-α，TGF-β1，IL-1β，IL-6 的含量(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)，降低肝组织 NF-κB 和磷酸化 IκB-α 的水平，且能显著降低 LPS 水
平，下调肝组织 TNF-α和 iNOS基因的表达(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)。结论:穗花杉双黄酮对四氯化碳致急性肝损伤大鼠具有明
显的保护作用，其机制可能通过抑制内毒素引起的 Kupffer细胞激活，进而抑制下游核因子 NF-κB的激活，减少炎症细胞因子
的释放。
［关键词］ 穗花杉双黄酮;四氯化碳;急性肝损伤;炎症因子
［中图分类号］ Ｒ285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)11-0147-04
［doi］ 10． 13422 / j． cnki． syfjx． 2014110147
Effect of Amentoflavone on Inflammatory Factors in
Ｒats with Acute Liver Injury
HUANG Zhen-qing，WEI Yan-fei，LIU Xue-mei，DUAN Xue-lin，ZHAO Tie-jian*
(Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China)
［Abstract］ Objective:To investigate the effects of amentoflavone (ATF)on inflammatory factors in rats
with acute liver injury． Method:The healthy adult male Sprague-Dawley (SD)rats were randomly divided into
six groups，control group，model group，positive control group，ATF low-dose，middle-dose and high-dose group
(15，30，60 mg·kg －1)，respectively． The experimental rats were administrated with drugs by ig for 7 days，one
hours after the last administration，the experimental rats were injected carbon tetrachloride to copy the acute liver
injury model except control group． The contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α) ，transforming growth factor
beta (TGF-β1)，interleukin 1β (IL-1β) ，interleukin-6 (IL-6)were investigated by ELISA． The phosphor-IκB-α
level and nuclear factor κB (NF-κB)nuclear translocation in hepatic tissue were measured by ELISA． The plasma
endotoxin (LPS) level was measured by limulus amebocyte lysate (LAL) chromogenic endpoint assay． The
expression of TNF-α mＲNA and induced nitric oxide synthase (iNOS)mＲNA in hepatical tissues in rats were
detected by Ｒeal time PCＲ． Ｒesult:Compared with the normal control group，the contents of TNF-α，TGF-β1，
IL-1β and IL-6 in the serum of the model group rats were obviously increased (P ＜ 0. 01)，and the level of plasma
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Vol． 20，No． 11
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endotoxin was obviously increased (P ＜ 0. 01)，the phosphor-IκB-α level and NF-κB nuclear translocation were
obviously increased，the expression of TNF-α mＲNA and iNOS mＲNA were up-regulated (both P ＜ 0. 01)．
Compared with the model group，the contents of TNF-α，TGF-β1，IL-1β，IL-6 were obviously decreased (P ＜
0. 05 or P ＜ 0. 01)，The phosphor-IκB-α level and NF-κB nuclear translocation were decreased (P ＜ 0. 05 or P ＜
0. 01) ，and the level of plasma endotoxin was obviously decreased，the expression of TNF-α mＲNA and iNOS
mＲNA in hepatical tissues in rats were down-regulated (P ＜ 0. 05 or P ＜ 0. 01)． Conclusion:ATF could protect
the acute hepatic injury induced by CCl4 in rats，the mechanism may be related to decreasing endotoxin level and
NF-κB nuclear translocation and attenuating the trigger of inflammation-related cascade amplification．
［Key words］ amentoflavone;CCl4;acute hepatic injury;inflammatory factors
急性肝损伤是大多数肝脏疾病共有的一种病理
状态，是慢性肝炎，肝纤维化，肝硬化，甚至肝癌发生
发展中最重要的因素，其发生发展是一个复杂的病
理生理过程，其中与 Kupffer细胞、中性粒细胞、上皮
细胞等多种细胞有关，并且与多种有害因素如内毒
素、氧化应激、炎症细胞因子有密切联系［1-2］。因
此，抑制内毒素引起的 Kupffer 细胞激活，进而抑制
下游核因子 NF-κB的激活，减少炎症细胞因子的释
放是保肝的有效措施之一。穗花杉双黄酮是从中药
卷柏中提取分离的单体活性成分，分子式为
C30H18O10，相对分子质量为 538，其具有舒张血管、抗
肿瘤、抗炎、抗病毒、抗疟、降低血糖等多种作用［3-4］。
本实验拟通过腹腔注射 CCl4 原液建立急性肝损伤大
鼠模型，探讨穗花杉双黄酮对急性肝损伤大鼠的保护
作用，为更深入研究开发应用提供实验依据。
1 材料
1. 1 动物 SPF 级健康雄性 SD 大鼠，体重 180 ～
220 g，广西医科大学实验动物中心提供，质量合格
证号 0001110。动物使用许可证 SYXK(桂)2009-
0004，生产许可证 SCXK(桂)2009-0002。饲养环境
为 SPF级动物实验室。
1. 2 药物与试剂 穗花杉双黄酮由本实验室自行
提取、分离、鉴定，纯度 99. 0%，临用前用 2% CMC-
Na溶解成混悬液。水飞蓟宾胶囊，天津天士力制药
股份有限公司，批号 130311，四氯化碳(CCl4)，广东
合山化工厂产品，分析纯，批号 20111109，肿瘤坏死
因子-α(TNF-α)，转化生长因子 β1(TGF-β1)，白介
素 1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)ELISA 试剂盒
(均购自南京建成生物工程研究所，批号分别为
20120116，20120311，20120605，20120605)，核因子-
κB (NF-κB)和磷酸化抑制蛋白(Nuclear factor
kappa B inhibitor protein，IκB-α)试剂盒(购自上海
研谨生物科技有限公司，批号分别为 20121011，
20121108)，内毒素定量检测试剂盒(上海伊华临床
医学科技公司)，ＲNA 逆转录聚合酶链反应试剂盒
和实时定量 PCＲ(real-time PCＲ)试剂盒［宝生物工
程(大连)有限公司］。
1. 3 仪器 722S型可见分光光度计(上海精密科学
仪器有限公司)，日立 7070 型自动生化分析仪(日本
日立公司株氏会社生产)，TDL-5 型台式低速大容量
离心机(上海安亭科学仪器厂)，SHH． W21. Cr600 型
三用电热恒温水箱(北京长源实验设备厂)，BP190S
型电子天平(Startorius 公司)，TGL-16G-A 型高速冷
冻离心机(上海安亭科学仪器厂)，Model 450 自动酶
标仪(美国 Bio-Ｒad 公司)，DG5031 型酶联免疫检测
仪(华东电子股份有限公司)。
2 方法
2. 1 分组与造模给药［5］ 将健康雄性 SD 大鼠 60
只，随机分为 6 组，每组 10 只，即为正常对照组，
CCl4 损伤模型组，阳性对照组(水飞蓟宾胶囊
50 mg·kg －1)，穗花杉双黄酮低、中、高剂量组(15，
30，60 mg·kg －1)，每日 ig给药 1次，连续给药 7 d，正
常组与模型组每天 ig等体积的蒸馏水，末次 ig给药 1
h 后，除 空 白 对 照 组 外，大 鼠 ip CCl4 原 液
(1 mL·kg －1)建立急性肝损伤大鼠模型，空白对照组
腹腔注射等剂量的生理盐水。禁食不禁水，24 h后麻
醉大鼠，腹主动脉取血，分离血清血浆备用，并快速摘
取肝脏用生理盐水洗净表面，再用滤纸吸净肝脏表面
水分和血液后快速冷冻于液氮中备用。
2. 2 检测血清 TNF-α，TGF-β1，IL-1β和 IL-6 的含量
采用 ELISA 法分别检测各组大鼠血清 TNF-α，
TGF-β1，IL-1β和 IL-6 的含量，严格按照试剂盒说明
书进行操作。
2. 3 肝组织 NF-κB 和磷酸化 IκB-α 的测定 严格
按照试剂盒说明书进行操作，取肝组织精密称定，提
取细胞核蛋白，并测定蛋白含量，采用双抗体夹心法
测定 NF-κB p65 的水平，用酶标仪在 450 nm波长下
测定吸光度(A)，通过标准曲线计算样品中 NF-κB
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p65 和磷酸化 IκB-α的浓度。
2. 4 血浆内毒素水平的测定［6］ 采用鲎试剂终点
显色法检测大鼠血浆内毒素(LPS)水平，用无热原
肝素抗凝管收集血液，迅速低温离心 10 min 后收集
血浆(1 000 r·min －1)，取离心后血浆 0. 1 mL，加入
0. 2 mL无热原生理盐水，0. 2 mL Tris-HCl缓冲液混
匀，置于 100 ℃水浴加热 10 min，3 000 r·min －1离心
10 min，取上清液检测。检测步骤严格按照试剂盒
说明书进行，最后在 545 nm 波长处测定吸光度
(A)，每次试验均制备标准曲线，建立回归方程求标
本中内毒素浓度。
2. 5 检测肝组织 TNF-α 和 iNOS 基因的表达 称
取 100 mg肝组织，采用 Trizol 法提取大鼠肝组织总
ＲNA，紫外分光光度计测 ＲNA 浓度及纯度后，用提
取的 ＲNA 进行逆转录合成 cDNA，按 ＲevertAidTM
First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书操作。从
Gene Bank查找 TNF-α和 iNOS及内参 GAPDH的基
因全序列，再根据荧光定量 PCＲ引物设计的基本原
则，设计引物序列如下:TNF-α 上游引物为 5-
AGGCAACCTGACCACTCTCC-3，下游引物为 5-
CACCACCATCAAGGACTCAA-3;iNOS 上游引物为
5-GACAGCACAGAATGTTCCAG-3下游引物为 5-
TGGCCAGATGTTCCTCTATT-3，GAPDH上游引物为
5-ATGATTCTACCCACGGCAAG-3，下游引物为 5-
CTGGAAGATGGTGATGGGTT-3，Ｒeal-time PCＲ 总
反应体系为 20 μL，其中 1 μL cDNA，10 μL 2 ×
SYBＲ Green qPCＲ mix，0. 5 μL上游引物，0. 5 μL下
游引物，8 μL ddH2O，扩增程序为 95 ℃预变性 5
min，95 ℃变性 10 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 15 s，
共反应 45 个循环。72 ℃延伸，5 min。结果采用比
较 2 － ΔΔCT法分析各基因在组织中的相对含量。
2. 6 统计学处理 应用 SPSS 19. 0 软件进行统计学
处理，数据采用珋x ± s表示，组间比较采用 t检验，多组
均数比较采用方差分析，P ＜0. 05有统计学意义。
3 结果
3. 1 对大鼠血清 TNF-α，TGF-β1，IL-1β 和 IL-6 水平
的影响 模型组大鼠血清 TNF-α，TGF-β1，IL-1β 和
IL-6水平显著升高，治疗后，阳性组和穗花杉双黄酮
组大鼠血清 TNF-α，TGF-β1，IL-1β和 IL-6水平显著降
低，与模型组比较差别有统计意义(P ＜ 0. 05 或
P ＜0. 01)。并呈现出一定的剂量依赖性。见表 1。
3. 2 对大鼠肝组织 NF-κB、磷酸化 IκB-α的含量和
血浆内毒素水平的影响 模型组大鼠肝组织 NF-kB
和磷酸化 IκB-α的含量显著升高，大鼠血浆内毒素
水平显著升高，给药治疗后，阳性组和穗花杉双黄酮
组大鼠肝组织 NF-κB 和磷酸化 IκB-α 的含量显著
降低，血浆内毒素水平也显著降低，与模型组比较有
显著性差异(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)。见表 2。
表 1 穗花杉双黄酮对大鼠血清 TNF-α，TGF-β1，IL-1β和 IL-6 水平的影响(珋x ± s，n = 10) μg·L －1
组别 剂量 /mg·kg －1 TNF-α TGF-β1 IL-1β IL-6
空白对照 － 36． 57 ± 3． 82 458． 83 ± 55． 67 30． 88 ± 3． 14 49． 82 ± 5． 07
模型 － 162． 43 ± 15． 972) 890． 56 ± 92． 462) 72． 53 ± 8． 072) 99． 54 ± 10． 282)
水飞蓟宾 50 55． 08 ± 6． 344) 484． 65 ± 51． 724) 39． 24 ± 2． 994) 55． 81 ± 6． 034)
ATF 60 58． 27 ± 6． 054) 501． 26 ± 60． 174) 35． 46 ± 3． 204) 60． 13 ± 7． 244)
30 74． 71 ± 8． 134) 611． 33 ± 60． 284) 48． 27 ± 5． 714) 71． 28 ± 6． 514)
15 95． 68 ± 10． 243) 774． 29 ± 84． 353) 59． 34 ± 6． 313) 77． 06 ± 8． 023)
注:与空白组比较1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01;与模型组比较3)P ＜ 0. 05，4)P ＜ 0. 01(表 2 ～ 3 同)。
表 2 穗花杉双黄酮对大鼠肝组织 NF-kB和磷酸化 IκB-α含量及血浆内毒素水平的影响(珋x ± s，n = 10)
组别 剂量 /mg·kg －1
肝组织
NF-kB /μg·L －1 磷酸化 IκB-α /μg·L －1 血浆 LPS /EU·mL －1
空白对照 － 9. 56 ± 1. 23 4. 33 ± 0. 63 0. 22 ± 0. 02
模型 － 30. 45 ± 4. 062) 14. 27 ± 1. 222) 1. 52 ± 0. 252)
水飞蓟宾 50 11. 37 ± 1. 534) 5. 02 ± 0. 754) 0. 48 ± 0. 064)
ATF 60 12. 76 ± 1. 184) 4. 99 ± 0. 644) 0. 44 ± 0. 074)
30 16. 38 ± 2. 334) 8. 47 ± 0. 844) 0. 61 ± 0. 104)
15 23. 67 ± 3. 463) 12. 05 ± 1. 37 0. 84 ± 0. 113)
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黄振青，等:穗花杉双黄酮对急性肝损伤大鼠炎症相关因子的影响
3. 3 ATF 对大鼠肝组织 TNF-α 和 iNOS 基因相对
表达的影响 造模后，大鼠肝组织 TNF-α 和 iNOS
基因表达显著升高，给药治疗后，阳性组和 ATF 各
剂量组均显著降低肝组织 TNF-α 和 iNOS 基因表
达，与模型组比较差别有统计学意义(P ＜ 0. 05 或
P ＜ 0. 01)。见表 3。
表 3 ATF对大鼠肝组织 TNF-α和 iNOS
基因相对表达的影响(珋x ± s，n = 10)
组别 剂量 /mg·kg －1 TNF-α mＲNA iNOS mＲNA
空白对照 － 0. 55 ± 0. 09 0. 36 ± 0. 05
模型 － 1. 42 ± 0. 222) 0. 89 ± 0. 122)
水飞蓟宾 50 0. 88 ± 0. 134) 0. 45 ± 0. 074)
ATF 60 0. 67 ± 0. 104) 0. 41 ± 0. 044)
30 0. 96 ± 0. 144) 0. 59 ± 0. 054)
15 1. 14 ± 0. 163) 0. 71 ± 0. 103)
4 讨论
TNF-α的过度表达在炎症反应、肝损伤和肝纤
维化等过程中具有重要作用。TGF-β1 属于一种多
功能多肽家族，在抑制细胞增殖、调节细胞表型、抑
制肿瘤发生等方面发挥重要作用，其过度表达能抑
制肝细胞的再生，促进肝细胞凋亡。IL-1β是白细胞
或免疫细胞间相互作用的淋巴因子，其在传递信息，
激活与调节免疫细胞，介导 T，B 细胞活化、增殖与
分化及在炎症反应中起重要作用［8］;IL-6 是由单核
细胞、巨噬细胞及淋巴细胞等炎症细胞产生的促炎
症细胞因子可诱导中性粒细胞浸润到前列腺组织
内，使 T，B细胞及 NK细胞广泛激活，促使中性粒细
胞释放溶酶体酶，从而加剧局部炎症细胞浸润，促进
炎症的形成［7］。
NF-κB是细胞内最重要的核转录因子，存在于
多种细胞中，在许多细胞刺激介导的细胞信息的转
录调控中起核心作用，参与包括免疫反应、急性期反
应蛋白、炎症反应等多种基因表达的调控，通过影
响炎性因子如 TNF-α以及 iNOS 等基因表达在炎症
反应和细胞凋亡等病理过程中起着关键作用［9］。
在没有刺激的情况下，NF-κB与 IκB-α结合，形成复
合物存在于细胞浆中，当 IκB-α 磷酸化后，IκB-α 和
NF-κB分解，游离的 NF-κB进入细胞核内并与 DNA
上相应位点结合并激活转录和翻译，促进 iNOS 以
及 IL-6 等炎性因子的合成、释放［10］。
本实验研究了穗花杉双黄酮对四氯化碳诱导的
急性肝损伤大鼠炎症相关因子的影响及相关机制，
实验结果表明，四氯化碳诱导后大鼠肝组织 NF-κB
和磷酸化 IκB-α 的水平显著升高，表明 NF-κB 进入
细胞核内增多，诱导 TNF-α，TGF-β1，IL-6，iNOS 等相
关炎症因子的释放，给予穗花杉双黄酮治疗后，结果
表明，大鼠血清 TNF-α，TGF-β1，IL-1β，IL-6 的含量显
著降低，肝组织中NF-κB和磷酸化 IκB-α的水平明显
下降，大鼠血浆内毒素水平也显著降低，肝组织 TNF-
α和 iNOS基因的表达也显著下调。其机制可能通过
抑制内毒素引起的 Kupffer 细胞激活，进而抑制下游
核因子 NF-κB的激活，减少炎症细胞因子的释放。
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［责任编辑 聂淑琴］
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