全 文 ：第 34 卷第 3 期 中南民族大学学报(自然科学版) Vol． 34 No． 3
2015 年 9 月 Journal of South-Central University for Nationalities(Nat． Sci． Edition) Sep． 2015
收稿日期 2015-06-30
作者简介 陈科力(1947-)，男，教授，博导，研究方向中药资源及其品质研究，E-mail:kelichen@ 126． com
基金项目 国家科技重大专项“中药新药安全性检测技术与标准研究”子课题(2014ZX09304307-001-021)
采用荧光猝灭法研究穗花杉双黄酮与
牛血清白蛋白的相互作用
陈科力，赵 平
(湖北中医药大学 教育部中药资源和中药复方重点实验室，武汉 430065)
摘 要 目的:运用荧光猝灭法研究不同温度下穗花杉双黄酮(AMF)与牛血清白蛋白 (BSA)的相互作用． 方法:
采用荧光光谱研究 AMF与 BSA之间的猝灭类型，计算二者之间的结合常数及结合位点数等． 结果:穗花衫双黄酮
能使 BSA发生内源性荧光猝灭，属静态猝灭机制．在 298，308，318 K下，AMF与 BSA结合常数分别为 6． 73，6． 38，
6． 17 L·mol-1，结合位点数 n近似为 1;热力学分析表明 AMF与 BSA之间结合力为静电力作用;同步荧光光谱表
明 AMF使 BSA构象发生改变，且色氨酸所处微环境的疏水性增强． 结论:荧光猝灭法可用于 AMF与 BSA之间结
合反应的研究，方法简便，灵敏度高．
关键词 穗花杉双黄酮;牛血清白蛋白;荧光猝灭
中图分类号 O657． 3 文献标识码 A 文章编号 1672-4321(2015)03-0045-05
Study on the Interaction between Amentoflavone and Bovine Serum
Albumin by Fluorescence Quenching Method
Chen Keli ，Zhao Ping
(Key Laboratory of Education Department on Traditional Chinese Medicine Ｒesource and Compound
Prescription，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China)
Abstract Objective:To study the mechanism of interaction between Amentoflavone (AMF)and Bovine Serum Albumin
(BSA)at different temperatures by fluorescence quenching method． Method:The quenching type，binding constant and
binding site was investigated by fluorescence spectrometry． Ｒesult:AMF could induce an endogenous fluorescence
quenching of BSA under a mechanism of static quenching． The binding constants were detected to be 6． 73(298 K)，6． 38
(308 K) ，6． 17(318 K)L·mol-1 and the binding site (n)was about 1，respectively． The thermodynamic parameters
suggested that the interaction force between AMF and BSA was electrostatic force． The results of synchronous fluorescence
spectra showed AMF can change the conformation of BSA， the hydrophobicity around the tryptophan residues was
increased． Conclusion:Fluorescence quenching method could be applied to study the interaction between AMF and BSA． It
is a convenient and delicate method．
Keywords Amentoflavone;bovine serum albumin;fluorescence quenching
血清蛋白是血清中含量最丰富的蛋白质，它能
与许多内源及外源性化合物结合，起到存储和转运
作用，是药物发挥药效的重要载体和靶分子． 药物
在体内的吸收分布、代谢及排泄等过程，直接影响到
药物在其作用部位的浓度和有效浓度的持续时间，
从而决定药物药理作用和毒性作用的发生、发展和
消除． 而影响药物在体内分布的因素很多，其中药
物与血清白蛋白的结合率是决定药物在体内分布的
重要因素，因此，研究药物与血清蛋白相互作用在药
理学、药效学、生物化学等方面都有重要作用［1］．
穗花杉双黄酮(AMF)是中药卷柏的主要活性
成分之一，它是一种双黄酮类化合物，具有抗炎、抗
氧化、抗病毒、抗肿瘤［2］、降血糖和扩张血管等多种
生物活性，目前对其与血清白蛋白相互作用的的研
究尚不多见［3，4］．
荧光光谱法因其仪器常见、方法简单、操作方
便、灵敏度高且样品用量小等优点，而成为研究生物
大分子特别是蛋白质与各种小分子相互作用的重要
手段［5-10］． 本实验采用荧光猝灭法研究了 AMF与牛
血清白蛋白(BSA)的相互作用，得到了二者之间反
应的猝灭常数、结合常数、结合位点数等，根据热力
学参数探讨了它们之间的作用力类型，为进一步阐
明在 AMF人体内的储存方式、传输机制及药理作用
等提供了重要信息．
1 仪器与试剂
F-4600 型荧光分光光度计(日本日立公司)，
HB-1000 型杂交炉(基因有限公司)．
磷酸盐缓冲液(PBS，上海捷瑞生物工程有限公
司)，BSA(上海捷瑞生物工程有限公司)用水配置
成浓度为 2． 00 × 10 －5 mol·L －1的溶液，AMF(中国
食品药品检定研究所)用乙醇配置成浓度为 5． 00 ×
10 －5 mol·L －1的溶液，实验用水为二次蒸馏水，乙
醇等其他试剂均为分析纯，上述溶液均置于 1 ～ 4
℃冰箱中保存．
2 试验方法
在 8 支试管中分别加入 1． 0 mL 的 PBS 缓冲溶
液，200 μL BSA 溶液，再分别加入 0，20，30，40，50，
60，70 μL的浓度为 5． 00 × 10 －5 mol·L －1穗花杉双
黄酮溶液，然后分别用水稀释至 2． 0 mL，混合均匀
后，在一定温度下恒温反应 30 min． 以激发波长为
280 nm，激发和发射狭缝为 5 nm 条件下，扫描 300
～ 450 nm范围内的荧光发射光谱．
3 结果与讨论
3． 1 AMF对 BSA的荧光猝灭光谱
固定 BSA的量，改变 AMF 在体系中的浓度，图
1 是不同浓度的 AMF 存在条件下体系的荧光发射
光谱，如图所示，BSA在 338 nm处有最大吸收峰，随
着 AMF 浓度的增加，BSA 荧光逐渐被猝灭，表明
AMF与 BSA发生较强的相互作用．
(a)2． 00 ×10 －6L mol·L －1 BSA;(b)to (g):2． 00 ×10 －6 L mol·
L －1 BSA in the presence of 5． 00 × 10 －7，7． 50 × 10 －7，1． 00 × 10 －6，
1． 25 ×10 －6，1． 50 ×10 －6，1． 75 ×10 －6 mol·L －1 AMF，respectively
图 1 荧光发射光谱图
Fig． 1 Fluorescence emission spectra
引起蛋白荧光猝灭的原因有动态和静态猝灭两
种．动态猝灭是一种电子或能量转移过程，是猝灭剂
与荧光物质在激发态的相互作用，其扩散系数与双
分子猝灭常数随温度的升高而增大． 静态猝灭过程
一般在基态生成不发荧光的复合物，且复合物的稳
定性与静态猝灭常数随温度的增加而减小［11］． 动
态猝灭过程符合 Stern-Volmer方程［12］:
F0 /F = 1 + Ksv［Q］= 1 + Kqτ0［Q］． (1)
F0，F分别为加入 BSA 前后的荧光强度，Ksv为
猝灭速率常数，Kq 为双分子猝灭反应速率常数，τ0
为猝灭剂不存在时生物大分子的平均寿命，约为
10 －8 s［13］，［Q］为猝灭剂 AMF．先假定该反应过程为
动态猝灭，根据 Stern-Volmer 方程，F0 /F 与药物的
浓度［Q］呈线性关系，由 F0 /F 对［Q］作图，所得直
线的斜率即为 Ksv(如图 2)．
分别测定 298，308，318 K 条件下的 AMF 对
BSA的荧光猝灭影响，结果表明猝灭常数随着温度
的增加而减小(见表 1)，且求得的猝灭速率常数 Kq
远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大猝灭常数
2． 00 × 1010 L·moL －1·s － 1，不符合动态猝灭规律，
由此可推断，AMF 对 BSA 的猝灭过程属于静态
猝灭．
表 1 不同温度下 AMF对 BSA的猝灭常数
Tab． 1 The quenching rate constants of BSA-AMF at different temperatures
T /K Ksv /(L·mol － 1) Kq /(L·mol － 1) Ｒ
298 8． 9 × 105 8． 1 × 1013 0． 9884
308 8． 1 × 105 8． 9 × 1013 0． 9937
318 7． 2 × 105 8． 1 × 1013 0． 9952
64 中南民族大学学报(自然科学版) 第 34 卷
图2 不同温度下穗花衫双黄酮对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer 曲线
Fig．2 Stern-Volmer of fluorescence of BSA quenching by AMF at
different temperatures(λex =280 nm，λem =338nm，pH =7．4)
3． 2 结合常数、结合位点的确定
对于静态猝灭，结合常数、荧光强度与猝灭剂浓
度之间的关系可用下式［14］表示:
lg［(F0 － F)/F］= lgKA + nlg［Q］．
利用 lg［(F0 － F)/F］对 lg［Q］作图可得线性关
系，如图 3 所示，根据线性拟合的斜率和截距可算出
结合常数 KA 和结合位点数 n(见表 2)．从表 2 可以
看出 AMF与 BSA 的结合常数较大，随温度升高而
降低，即所形成的复合物稳定性降低［15］，但温度对
结合位点数 n的影响较小，n约为 1．
图 3 BSA与 AMF相互作用位点结合模型图
Fig． 3 The binding sites number of BSA-AMF at
298，308，318 K，respectively
表 2 不同温度下 AMF与 BSA的结合常数和结合位点数
Tab． 2 The binding sites number and association constants of
BSA-AMF at different temperatures
T /K KA(L·mol － 1) n Ｒ
298 6． 73 1． 13 0． 9703
308 6． 38 1． 08 0． 9948
318 6． 17 1． 05 0． 9932
3． 3 AMF与 BSA之间作用力类型的确定
有机小分子与生物大分子之间的结合作用力包
括氢键作用、范德华力、静电作用、疏水作用力［16］．
当温度变化不大时反应的焓变 ΔH可以看作一个常
数．根据公式 Vant Hoff方程［17］:
lnK = ΔS /Ｒ － ΔH /TＲ．
其中 K 为猝灭常数，T 为温度(298，308，318
K)，以 lnK对 1000 /T作图得到直线(如图 4)，通过
直线截距和斜率求得 ΔS和 ΔH(见表 3)． 不同温度
下吉布斯自由能 ΔG由下式计算:
ΔG = ΔH － TΔS．
图 4 Vant Hoff 曲线
Fig． 4 Vant Hoff plot
根据反应前后热力学焓变 ΔH、熵变 ΔS 的相对
大小可判断药物与蛋白质之间的主要作用力类
型［18］． 从表 3 可以看出 ΔG ＜ 0，说明反应是自发进
行的;ΔH ＜ 0，ΔS ＞ 0，根据 Ｒoss和 Subramanian［18］两
位学者判断小分子与生物大分子作用力类型的规
律，AMF 与 BSA 形成复合物的作用力主要为静
电力．
表 3 AMF与 BSA相互作用的热力学参数
Tab． 3 Thermodynamic parameters for the binding of AMF to BSA
T / K Ksv /(L·mol － 1) ΔG / (kJ·mol － 1) Ｒ ΔS /(J·mol － 1·K －1) ΔH /(kJ·mol － 1)
298 8． 9 × 105 － 33． 956
308 8． 1 × 105 － 34． 816 0． 9859 85． 96 － 8． 34
318 7． 2 × 105 － 35． 675
74第 3 期 陈科力，等:采用荧光猝灭法研究穗花杉双黄酮与牛血清白蛋白的相互作用
3． 4 AMF对 BSA构象的影响
同步荧光光谱可以反映药物分子对蛋白质构象
变化的影响．由 Δλ = 15 nm和 Δλ = 60 nm所得同步
荧光光谱分别显示酪氨酸(Tyr)残基和色氨酸
(Trp)残基的光谱特征［19-21］． 因芳香氨酸残基的最
大发射波长与其所处环境的极性有关，根据最大荧
光发射波长的变化可判断残基所处微环境的变
化［22］． 如图 5 中(a)、(b)分别为 Δλ = 15 nm 和 Δλ
= 60 nm 时 AMF 与 BSA 作用的同步荧光光谱． 图
中显示，在 BSA 浓度一定时，随着 AMF 浓度的增
加，BSA的荧光强度被猝灭，酪氨酸的最大发射峰
基本保持不变，而色氨酸的最大发射峰略微蓝移，表
明 AMF的加入使 BSA的构象发生改变［23］． 在反应
过程中酪氨酸残基所处微环境基本没有变化，而色
氨酸所处微环境的疏水性增强，亲水性下降，表明
AMF与 BSA的结合位点更接近色氨酸残基．
CBSA =2． 00 ×10 －6 mol·L －1，from 1 to 9 the CAMF:0，0． 25 ×10 －6，0． 50 ×10 －6，0． 75 ×10 －6，1． 00 ×10 －6，1． 25 ×10 －6，1． 50 ×10 －6，
1． 75 ×10 －6，2． 00 ×10 －6mol·L －1 respectively． (a)Δλ =15 nm，(b)Δλ =60 nm
图 5 AMF与 BSA作用的同步荧光光谱图
Fig． 5 The synchronous fluorescence spectra of BSA in the present of AMF (T = 298 K，pH = 7． 4)
4 结论
经实验及理论计算表明，AMF对 BSA的荧光猝
灭机理为静态猝灭，与 BSA相互作用时具有一个结
合位点，且它们反应为自发过程．由于二者的结合常
数较大，易与白蛋白结合形成复合物，因此能够明显
影响 AMF在血浆内的游离药物浓度，从而影响其在
体内的转运过程及药物代谢、药理作用等，因此研究
AMF与白蛋白的相互作用对指导临床用药具有重
要意义．
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