全 文 ：※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.04 109
响应面法优化纤维素酶提取山核桃蒲多酚类物质
董 旭1，杜先锋2,*
(1.安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，农业部农产品质量安全风险评估实验室(合肥)，安徽 合肥 230022；
2.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036)
摘 要：利用纤维素酶法提取山核桃蒲多酚，在单因素试验的基础上，通过SAS统计分析软件，运用四因素三水平
的响应面设计方法，建立纤维素酶法提取山核桃蒲多酚的二次多项数学模型，以提取率为响应值作响应面和等高
线，最优浸提条件为pH6、浸提温度70℃、加酶量4U/g底物、浸提时间70min，此时的提取率预测值为63.43%，实
际重复得出该条件下提取率为61.72%，相对偏差为2.77%。
关键词：山核桃蒲；纤维素酶；多酚；提取；响应面法
Optimization of Cellulase-Assisted Extraction of Polyphenols from Carya cathayensis Sarg Peels by
Response Surface Methodology
DONG Xu1，DU Xian-feng2,*
(1. Key Laboratory of Agro-Product Safety Risk Evaluation (Hefei), Ministry of Agricultrue, Institute of Plant Protection and
Agro-Products Safety, Anhui Academy of Agricultural Sciences, Hefei 230022, China；
2. College of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)
Abstract：Response surface methodology was employed to optimize the cellulase-assisted extraction of polyphenols
from Carya cathayensis Sarg peels. A regression model was established based on a four-variable, three-level quadratic
universal rotation combination design using SAS software. Response surface and contour plots were drawn for the extraction
efficiency of polyphenols as a function of four operating parameters. The optimum extraction conditions were found to be
pH 6, 70 ℃, 70 min and 4 U/g for enzyme loading. Under the optimized conditions, the maximum predicted extraction
efficiency of polyphenols was 63.43%, which was close to the actual average value of 61.72% with a relative error of 2.77%.
Key words：Carya cathayensis Sarg peels；cellulase；polyphenol；extraction；response surface methodology
中图分类号：TQ243.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)04-0109-05
收稿日期：2012-02-08
作者简介：董旭(1979—)，男，硕士，研究方向为农产品质量安全风险评估。E-mail：dongxu929@163.com
*通信作者：杜先锋(1963—)，男，教授，博士，研究方向为食品生物技术及农副产品深加工。E-mail：dxf@ahau.edu.cn
山核桃(Carya cathayensis Sarg.)，又名“小胡桃”、
山核桃楸，主要产于皖南山区海拔300～900m及大别山
区海拔800～1200m的针阔叶混交林中。浙江省天目山区
也有分布，其中临安县西部昌化地区和淳安县北部有大
面积的人工林[1]。山核桃果皮由外果皮、中果皮和内果皮
三层结构组成，含叶绿体的表皮细胞紧密排列形成薄壁
组织层，外表面有角质层，构成外果皮即为山核桃蒲，
是山核桃加工过程中的废弃物。山核桃蒲壳与山核桃干
子数量的比例约是4.5:1～5.5:1，据此可知每年的山核
桃蒲壳的量至少可达30000t以上。每年山核桃采收的季
节，大量的山核桃蒲壳废弃物堆积如山或直接倾倒在河
里，对山区的自然环境造成了极大的污染[2-6]。
本研究在超细粉碎的基础上采用纤维素酶破坏其细
胞壁[7]，使山核桃蒲壳中的多酚类物质充分释放，结合二
次通用旋转设计方法，建立以多酚提取率为目标函数的
数学模型，重点考察温度、时间、pH值和加酶量对多酚
提取率的影响，为山核桃蒲的综合利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
山核桃蒲采自安徽省宁国市；没食子酸对照品 中
国食品药品检定研究院；氢氧化钠、盐酸、碳酸钠 上
海中试化工总公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠 西陇化
工股份有限公司；纤维素酶 湖南尤特尔生化有限公
司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DK-8D型电热恒温水槽 上海恒科科技有限公司；
B-290型喷雾干燥机 瑞士Büchi公司；FS-450型超声
处理器 上海生析超声波仪器有限公司；UV-2102C型
110 2013, Vol.34, No.04 食品科学 ※工艺技术
紫外-可见光分光光度计 美国尤尼柯仪器有限公司；
OPD-8型喷雾干燥机 上海大川原喷雾干燥设备有限
公司；U-3010紫外-可见扫描仪 日本日立公司；HX-
200A型高速中药粉碎机 浙江省永康市溪岸五金药具
厂；RE-522AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 原料预处理
山核桃蒲洗净、烘干、经中药粉碎机粉碎后、过
筛、密封备用。
1.3.2 山核桃蒲浸提液多酚成分的定性鉴定[8-9]
利用植物多酚的定性鉴定方法鉴定山核桃蒲浸提液
中的多酚成分。
1.3.3 多酚含量的测定
采用Folin-Ciocalteu(FC)法[10-11]，以没食子酸为标准
品，将100mg没食子酸对照品置于100mL容量瓶中，加蒸
馏水定容至刻度，配制质量浓度1mg/mL的没食子酸对照
品溶液。取1mL标准品溶液定容至100mL，后分别配制
质量浓度为10、20、30、40、50μg/mL的没食子酸对照
品溶液，按Folin-Ciocalteu法分别取上述溶液1mL，加入
1mL磷钼钨酸试剂(现配)，加入8mL 7.5g/100mL的碳酸钠
溶液混匀，40℃保持20min，在765nm[12]处分别测定吸光
度并绘制标准曲线，以没食子酸标准溶液质量浓度为横
坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线方程
为Y=4.44X + 0.0038，R2=0.9994。
1.3.4 纤维素酶酶活的测定[13]
1.3.4.1 原理
纤维素酶水解羧甲基纤维素分子中的β-1,4葡萄糖苷
键，释放出还原糖(以葡萄糖计)，与3,5-二硝基水杨酸(DNS)
反应产生颜色变化，颜色的变化程度与释放还原糖的量呈
正比，在550nm测得的吸光度对照标准曲线(以葡萄糖为标
准物)确定释放还原糖的量，从而计算出纤维素酶活力。
1.3.4.2 纤维素酶活力单位定义
1g酶粉(1mL酶液)于50℃、pH4.8条件下，每分钟水
解1% CMC溶液产生1μmol还原糖的酶量定义为一个纤维
素酶活力单位。
1.3.4.3 酶活计算公式
㑸㓈㋴䝊⌏࡯/(U/g) =
AhDh1000
thMhV
式中：A为在标准曲线上对应的葡萄糖量/(mg/mL)；
D为酶液稀释倍数；t为反应时间/min；M为葡萄糖相对分
子质量(180.2)；V为测定用酶液体积/mL。
1.3.5 多酚提取率计算公式
ᦤপ⥛/% = h100mM
式中：m为每克原料中提取的多酚量/g；M为每克原
料中的多酚含量/g。
1.3.6 单因素试验
考察了温度、时间、pH值、加酶量以及料液比对多
酚提取率的影响，初步确定适宜的浸提条件。
1.3.7 浸提条件的探讨
在单因素试验所确定的适宜条件范围内，采用四因
素二次通用旋转设计，以多酚提取率为响应值，通过考
察上述4因素对多酚得率的协同影响来确定最优浸提条
件，该设计采用SAS数据处理中的响应面进行分析。
2 结果与分析
2.1 山核桃蒲浸提液多酚成分的定性鉴定[14-15]
利用多酚类物质的理化性质，在山核桃蒲浸提液中
分别加入明胶、三氯化铁、甲醛-浓盐酸、醋酸铅试剂，
根据加入不同试剂所产生的试验现象判定浸提液中是否
含有多酚类物质。
表 1 定性分析试验结果
Table 1 Qualitative analysis of peel extract of Carya cathayensis Sarg
编号 方法 现象 结果
1 加入明胶 沉淀 +
2 加入三氯化铁 蓝黑沉淀 +
3 与甲醛-浓盐酸共沸 絮状沉淀且不溶稀酸 +
4 加入醋酸铅 红棕色沉淀 +
5 溶液酸碱性 pH5.6 +
注：“+”表示阳性。
如表1所示，5组实验均呈阳性结果，可以判定山核
桃蒲浸提液中含有多酚类物质。
2.2 山核桃蒲原料中多酚类物质的含量测定
精确称取1.0g山核桃蒲原料，加入体积分数50%的丙
酮溶液50mL加热回流2h，过滤，将滤渣再加入50%的丙
酮溶液50mL加热回流2h，如此反复至滤液中无多酚物质
浸出，合并滤液，减压蒸馏除去丙酮后经Folin-Ciocalteu
法测定，滤液中的多酚类物质为81.1mg，即山核桃蒲原
料中多酚类物质的含量为8.1%。
2.3 纤维素酶活力测定
取3支25mL的刻度试管分别加入0.2mL的稀释酶液，
再分别加入1.8mL CMC溶液，50℃水浴加热30min后加入
DNS试剂2mL，摇匀后具塞，沸水水浴10min，冷却后于
550nm波长处测定吸光度，从葡萄糖标准曲线计算还原
糖的量[16]，带入纤维素酶活力计算公式，计算出纤维素
酶实测活力为1530U/g。
2.4 不同提取方式下提取效果的对比
精确称取10g已粉碎的山核桃蒲原料，在浸提温度
60℃、料液比1:10、浸提时间1h的基本条件下，分别考
察了超声波辅助浸提(超声波功率为450W，超声处理方
式为连续脉冲，处理时间1h)，酶法浸提(pH5.5；加酶量
※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.04 111
为：纤维素酶3U/g底物、果胶酶1U/g底物)及超声波辅助
酶法浸提等提取方式，按照1.3.2节的测定步骤以吸光度
为判定依据。见表2。
表 2 不同提取方式对多酚物质提取效果的影响
Table 2 Effect of extraction methods on the extraction effi ciency of
polyphenols
不同提取方式 纯水 超声波 纤维素酶 果胶酶 超声波辅助纤维素酶超声波辅助果胶酶
吸光度(A) 0.148 0.171 0.201 0.166 0.205 0.172
由表2可以得出，纤维素酶的使用可以大大提高多酚
物质的溶出量，在超声波辅助下的溶出量与单独使用纤
维素酶时基本相当，综合考虑本实验选用纤维素酶法进
行山核桃蒲多酚浸提。
2.5 单因素试验
以10g山核桃蒲为原料，考察温度、时间、pH值、加
酶量以及料液比这5个因素对试验结果的影响，通过只改
变一个因素，来比较各因素的浸提条件的范围。
2.5.1 浸提温度的选择
由于纤维素酶的适宜反应温度为40～70℃，因此选
择40～80℃为温度单因素考察的范围。由图1可知，在
60℃时多酚的提取率最高。在温度40℃～60℃时提取率
随温度的升高而逐渐提高，当温度高于60℃时提取率却
随温度的升高而逐渐下降，这说明随着温度的升高，酶
的活性降低，同时过高的温度也会对已溶出的多酚类物
质起到破坏的作用。
30
35
40
45
50
55
60
40 50 60 70 80
⍌ᦤ⏽ᑺ/ć
ᦤ
প
⥛
/%
图 1 浸提温度对多酚提取率的影响
Fig.1 Effect of temperature on the extraction effi ciency of polyphenols
2.5.2 浸提时间的选择
40
44
48
52
56
60
30 60 90 120 150
ᦤ
প
⥛
/%
⍌ᦤᯊ䯈/min
图 2 浸提时间对多酚提取率的影响
Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction effi ciency of
polyphenols
在确定了浸提温度60℃的基础上，考察5个时间点
对提取率的影响。由图2可知，多酚的提取率随时间的
延长而逐渐增加，在30～60min时间段内提取率的增速
极快，在60～120min时间段内提取率平稳增长，而从
120min后提取率的增长量基本不变。因此选择浸提时间
为120min。
2.5.3 pH值的选择
在确定了浸提温度60℃、浸提时间90min的基础上，
同时考虑到纤维素酶反应的适宜pH值，选择5个pH值，
考察5个不同pH值对提取率的影响。由图3可知，pH值为
5～5.5范围时，提取率达到最高值，pH＞5.5时，提取率
开始下降，到6.5时，趋于平稳，因此选择pH5.5作为较适
酸度。
55
56
57
58
59
60
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
ᦤ
প
⥛
/%
pH
图 3 pH值对多酚提取率的影响
Fig.3 Effect of hydrolysis pH on the extraction effi ciency of
polyphenols
2.5.4 加酶量对提取率的影响
在确定了浸提温度60℃、浸提时间90min、pH5.5的
基础上，考察5个不同加酶量对提取率的影响。由图4可
知，加酶量在3U/g底物时提取率最高，1～3U/g底物时反
应体系中底物充足，增长速度较快，4U/g底物以后提取
率有所下降，这时酶解反应饱和，反应速率将不再增加
反而会逐渐下降，使得酶有效利用率下降，所以选择纤
维素酶用量选择3U/g底物。
1 2 3 4 5
ᦤ
প
⥛
/%
ࡴ䝊䞣/(U/g)
50
52
54
56
58
60
62
64
图 4 加酶量对多酚提取率的影响
Fig.4 Effect of enzyme loading on the extraction effi ciency of
polyphenols
2.5.5 料液比对提取率的影响
在确定了浸提温度60℃、浸提时间90min、pH5.5、
加酶量3U/g底物的基础上，考察5个不同料液比对提取率
112 2013, Vol.34, No.04 食品科学 ※工艺技术
的影响。由图5可知，当料液比达到1:12时多酚的提取率
最大，且从1:12开始提取率基本趋于稳定，因此选择料
液比为1:12。
60
61
62
63
64
65
1:10 1:12 1:14 1:16 1:18
ᦤ
প
⥛
/%
᭭⎆↨
图 5 料液比对多酚提取率的影响
Fig.5 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction effi ciency of
polyphenols
2.6 试验设计及响应面分析
2.6.1 试验设计
表 3 二次通用旋转组合试验因素水平表
Table 3 Factors and levels for quadratic universal rotation
combination design
水平 X1 pH X2温度/℃ X3加酶量/U X4时间/min
－2 4.5 40 1 60
－1 5.0 50 2 90
0 5.5 60 3 120
1 6.0 70 4 150
2 6.5 80 5 180
表 4 响应面试验设计及结果
Table 4 Quadratic universal rotation combination design matrix and
results
试验号 X1 X2 X3 X4 Y提取率/%
1 －1 －1 －1 －1 57.45
2 －1 －1 －1 1 57.12
3 －1 －1 1 －1 56.57
4 －1 －1 1 1 54.13
5 －1 1 －1 －1 56.94
6 －1 1 －1 1 55.20
7 －1 1 1 －1 60.08
8 －1 1 1 1 59.4
9 1 －1 －1 －1 63.17
10 1 －1 －1 1 66.01
11 1 －1 1 －1 59.58
12 1 －1 1 1 57.56
13 1 1 －1 －1 68.14
14 1 1 －1 1 64.27
15 1 1 1 －1 64.11
16 1 1 1 1 60.86
17 －2 0 0 0 53.86
18 2 0 0 0 65.8
19 0 －2 0 0 55.20
20 0 2 0 0 60.93
21 0 0 －2 0 69.91
22 0 0 2 0 63.4
23 0 0 0 －2 64.9
24 0 0 0 2 60.1
25 0 0 0 0 62.56
26 0 0 0 0 62.26
27 0 0 0 0 64.56
28 0 0 0 0 64.87
29 0 0 0 0 63.56
30 0 0 0 0 63.57
31 0 0 0 0 62.58
依据单因素试验结果，综合考虑各因素对山核桃蒲
多酚提取率的影响，采用二次通用旋转组合设计法，以
多酚提取率为响应值，对pH值、温度、加酶量和时间这4
个因素优化设计，试验安排及结果如表3、4所示。
2.6.2 响应曲面法试验
表 5 提取率的回归数学模型
Table 5 Regression coeffi cients and statistical signifi cance of the fi tted
regression model
项 回归系数标准误差 系数标准误差 t值 P值
X1 2.4942 0.3197 9.2223 0.0001**
X2 1.2041 0.3197 3.7655 0.0017**
X3 －1.1983 0.3197 －3.7473 0.0017**
X4 －0.8666 0.3197 －2.7101 0.0154*
X1
2 －1.1780 0.2929 －4.0212 0.0009**
X1X2 0.2887 0.3917 0.7372 0.4716
X1X3 －1.4400 0.3917 －3.6766 0.0020**
X1X4 －0.0750 0.3917 －0.1914 0.8505
X2
2 －1.6343 0.2929 －5.5785 0.0001**
X2X3 0.9937 0.3917 2.5373 0.0219*
X2X4 －0.4687 0.3917 －1.1968 0.2488
X3
2 0.5281 0.2929 1.8028 0.0902
X3X4 －0.3250 0.3917 －0.8298 0.4189
X4
2 －0.5118 0.2929 －1.7470 0.0997
注：*.差异显著P＜ 0.05；**.差异极显著P＜ 0.01。下同。
表 6 模型方差分析
Table 6 Analysis of variance for the fi tted regression model
回归方差来源 自由度 平方和 均方和 F值 P值
回归 14 478.6587 34.18991 13.93054 0.0001**
一次项 4 296.0332 74.00829 30.15439 0.0001**
二次项 4 127.0176 31.75441 12.93821 0.0001**
交互项 6 55.60788 9.267979 3.776202 0.01555*
失拟项 10 33.01072 3.301072 0.829102 0.085784
纯误差 6 6.258286 1.043048
合计 30 517.9277
响应曲面法试验设计及结果见表4，运用SAS数据
统计分析软件对试验数据进行多元回归拟合，回归模型
系数及显著性检验结果见表5。得到pH值(X1)、浸提温度
(X2)、加酶量(X3)、浸提时间(X4)的二次多项回归模型：
Y=－203.014+63.50821X1＋1.653345X2＋6.81006X3＋
0.261345X4－4.712262X12＋0.05775X1X2－2.88X1X3－
0.005X1X4－0.016343X22＋0.099375X2X3－0.001562X2X4＋
0.528185X3
2－0.010833X3X4－0.000569X42
响应数据的方差分析结果见表6，分析结果显示模
型的F值=13.931＞F0.05(14,6)=2.85，P=0.0001＜0.01，表
明回归模型显著，故可用上述回归方程描述各因子与
响应值之间的关系(R2=92.42%)。由表5可知方程X1、
X2、X3影响极显著，X4影响显著，且由表6可知，二次
项极显著(P＜0.001)，说明响应面分析所选的主效应
都达到显著水平。其中，因素之间的交互作用也较大
(P＜0.05)。同时由F值和P值可以看出，在pH值、浸提
温度、加酶量、浸提时间这4个因素中，pH值、浸提温
度、加酶量对提取率影响最大，其次是浸提时间。失拟
项F=0.829＜F0.05(14,10)=2.60，P=0.0858＞0.05，不显著，
说明该模型拟合程度良好，试验误差小，可以用此模型
来分析和预测山核桃蒲多酚提取的工艺结果。模型的响
※工艺技术 食品科学 2013, Vol.34, No.04 113
应曲面及等高线见图6、7，两组图直观地反映了各因素
对响应值的影响。
4.5 4.8 5.1 5.4 5.7 6.0 6.3
1.2
1.8
2.4
3.0
3.6
4.2
4.8
ࡴ
䝊
䞣
/ U
56
52
52 56 60 64 68 72
pH
72
52
6.3
4.5 1.2
4.8
ᦤ
প
⥛
/%
pH ࡴ䝊
䞣/U
固定水平：温度60℃，时间120min。
图 6 pH值、加酶量对多酚提取率的响应面图和等高线图
Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of pH and
enzyme loading on the extraction effi ciency of polyphenols
42 48 54 60 66 72 78
1.2
1.8
2.4
3.0
3.6
4.2
4.8
ࡴ
䝊
䞣
/ U
51
54
57
60
63 66 66 63 60
⏽ᑺ/ć
66
51
4.8
1.2 42
78
ᦤ
প
⥛
/%
ࡴ䝊䞣/U ⏽ᑺ
/ć
固定水平：pH5.5，时间120min。
图 7 温度、加酶量对多酚提取率的响应面图和等高线图
Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of temperature
and enzyme loading on the extraction effi ciency of polyphenols
2.6.3 浸提最佳条件优化与验证
运用SAS软件的响应曲面优化设计对试验结果进
行优化，考虑到实际生产中的条件，选择最优浸提条
件为pH6、浸提温度70℃、加酶量4U/g底物、浸提时间
70min，预测山核桃蒲多酚的提取率为63.43%。
为检测响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述
优化条件进行重复实验，在上述条件下实际提取率为
61.72%。与预测值相比，其相对偏差约为2.77%，说明
可以利用上述回归方程对实际浸提进行预测和控制。因
此，基于响应曲面法所得的优化工艺参数准确可靠，具
有实用价值。
3 结 论
试验结果表明在单因素试验的基础上，采用SAS统计
分析中的二次通用旋转组合，进行响应面分析，建立了山
核桃蒲多酚提取工艺中pH值、温度、加酶量和浸提时间
对提取率的数学模型。通过方差和可信度分析表明，模型
拟合度较好。通过响应面优化分析，确定最优浸提条件为
pH6，浸提温度70℃、加酶量4U/g底物、浸提时间70min，
预测山核桃蒲多酚的提取率为63.43%。实际重复得出该条
件下实际提取率为61.72%。与预测值相比，其相对偏差约
为2.77%。在最优浸提条件下的验证试验表明，建立的数
学模型可以完全模拟山核桃蒲多酚的提取过程。
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