全 文 ：辽东楤木叶总皂苷(ETS)对裸鼠 A549体外移植
瘤抑制率及瘤体相关蛋白 COX-2
表达影响的实验研究
王丽岩 1 ,肖洪彬 2 , 张秀萍2 ,王鸣慧 2 ,李凌雁 1
(1.大庆医学高等专科学校 ,黑龙江 大庆 163312;2.黑龙江中医药大学 ,黑龙江 哈尔滨 150040)
摘　要:目的:探讨 ETS抗肿瘤作用及机制 ,为进一步将其开发成新靶点的抗肿瘤药物提供可靠的科学
依据。方法:建立 A549荷瘤裸鼠动物模型进行体内抑瘤实验 ,取瘤体 ,称瘤重 ,计算肿瘤抑制率;免疫
组化二步法检测瘤体内相关蛋白 COX-2 , CD31抗体检测瘤体微血管密度。结果:ETS能明显抑制裸
鼠 A549体外移植瘤生长 ,抑制 COX-2的表达 ,降低微血管密度。结论:研究结果为辽东楤木叶抗肿瘤
机理提供了实验依据 。
关键词:辽东楤木叶总皂苷;移植瘤抑制率;蛋白 COX-2;实验研究
中图分类号:R285.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2010)06-0030-03
收稿日期:2010-05-20　　修回日期:2010-09-20
基金项目:2008 -2010年国际科技合作与交流专项课题(编号:
20072315)
作者简介:王丽岩(1979-), 女 ,博士研究生 ,主要从事方剂药理学研
究 , E-mail:wly12188@sina.com
　　辽东楤木(Araliaelata)为五加科葱木属植物 ,别
名龙牙楤木 、刺老芽 ,祖国医学以根皮和树皮入药 ,其
性味苦 、辛 、平 ,有小毒 ,具有补气安神 、强精滋肾 、祛风
活血 、除湿止痛之功效 ,用于治疗神经衰弱 、风湿性关
节炎 、肝炎 、糖尿病等[ 1] 。本课题前期药效学和药理
学研究结果表明 ,辽东楤木叶的总皂苷部分为抗肿瘤
有效部位 ,并进行了半数致死量 、微核实验以及长期毒
性实验 [ 2, 3] 。为进一步探讨辽东楤木叶总皂苷(Aralia
elataSeemLeaves, ETS)抗肿瘤作用及机制在体外实验
基础上进行了如下体内实验。
1　实验材料
1.1　实验用药 ETS,黑龙江中医药大学中药化学教研
室提供;环磷酰胺 ,江苏恒瑞医药股份有限公司生产 ,
批号:08012221,规格:0.2g;注射用生理盐水 ,哈尔滨
三联药业有限公司生产 , 批号:081127B14, 规格:
500mL。
1.2　主要试剂　兔 PV-6001二步法免疫组化检测
试剂 、浓缩型 DAB试剂盒 ,中杉金桥生产;DEPC, Sig-
ma公司生产;RabbitAnti-PECAM-1(CD31 antigen)
北京博奥森生物技术有限公司产;CatalogNumber:bs
-0468R;RabbitAnti-COX-2,北京博奥森生物技术
有限公司生产。
1.3　实验仪器　电脑型正置显微镜 ,型号:DMM-
200C,上海光学仪器厂生产 。
1.4　实验动物　健康 nu/nu裸小鼠 , 18 ～ 22g,雌雄各
半 ,购于北京维通利华实验动物衣限公司 ,合格证号:
SCXK(京)2007-0001。
2　实验方法
2.1　动物分组　取 5周龄健康裸鼠雌雄各半制备体
外人 A549肺腺癌模型后按体重随机分为辽东楤木叶
总皂苷组 、环磷酰胺(Cytoxan, CTX)组 、空白模型组 。
2.2　实验药品制备 ETS以 0.9%生理盐水配成浓度
为 5mg·mL-1的混悬液 。 CTX以 0.9%生理盐水配成
浓度为 2.5mg·mL-1的混悬液。
2.3　实验动物给药 　体外移植人 A549肺腺癌模型
的裸鼠分组后 , ETS按小鼠 100mg·kg-1给予灌胃给
药 ,同时腹腔注射相同体积的生理盐水;CTX组小鼠
以 50mg·kg-1腹腔注射给药 ,间隔 1d给药 ,同时灌胃
给以相同体积的生理盐水;空白模型组给以相同体积
的生理盐水灌胃 ,同时腹腔注射相同体积生理盐水。
每周连续给药 6天 ,共给药 10周 ,末次给药后 24h取
材 。
2.4　取材 10周后用事先浸泡于 1‰　DEPC水过夜
后高压 3次的手术器械于冰上取出荷瘤鼠瘤体 ,称量
瘤体之重量 ,计算肿瘤抑制率 [肿瘤抑制率 =(对照组
平均瘤重 -给药组平均瘤重 )/对照组平均瘤重 ×
100%] 。切取部分瘤体置 10%的甲醛 -PBS溶液固
定 ,石蜡包埋切片 ,免疫组化法检测相关蛋白表达
情况。
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3　指标测定及方法
3.1　PV-6001免疫组化二步法检测瘤体相关蛋白
3.1.1　COX-2检测
切取移植瘤组织 ,经脱水 、透明 、石蜡包埋 ,制成
6μm厚的石蜡切片 。石蜡切片脱蜡和水化 , 经 3%
H2O2孵育 3min后 ,放入枸橼酸盐缓冲液中 ,放入微波
炉中抗原修复 3min,室温 30min,滴加特异性一抗兔抗
鼠 COX2多克隆抗体(稀释比例 1∶100),在 34℃冰箱
中过夜;PBS冲洗 4次 ,滴加二抗 ,在 37℃烘箱中孵育
30min, PBS冲洗 4次 , DAB显色 ,显微镜观察。结果参
照文献 [ 4]胞质内或核膜上呈棕黄色者为阳性 。分为:
阴性(-):无阳性着色或着色颗粒细微浅黄 ,或阳性
细胞数 <1%;弱阳性(+):浅黄色细颗粒 ,或阳性细
胞数 1% ～ 10%;中度阳性(++):黄色颗粒较粗 ,或
阳性细胞数 11% ～ 50%;强阳性(+++):棕黄色粗
大颗粒 ,或阳性细胞数 >50%。
3.1.2　移植瘤组织内微血管密度(MVD)测定
对所有移植瘤块免疫组化切片用兔抗鼠 CD31的
单克隆抗体(稀释比例 1∶100), DAB底物显色试剂盒
来检测第一抗体 , PBS代替一抗设为空白对照 ,用苏木
精复染 ,镜下观察 ,棕色为阳性反应。低倍镜下选取新
生血管密集部位 ,光镜下观察微小血管数 ,观测 5个视
野 ,取平均值 ,作为微血管密度 [ 5] 。
4　统计学处理
数据用均数 ±标准差( x±s)表示 ,采用 SPSS17.0
统计软件 ,组间比较用 t检验进行分析 ,等级资料用
Ridit分析 。
5　实验结果(见表 1 ～ 3,图 1 ～ 2)
表 1　ETS对裸鼠人肺腺癌 A549体外移植瘤重量影响
组别 例数(n)
给药剂量
(mg·kg-1)
体重
(g)
瘤块重量
　　(g)
肿瘤抑制
率(%)
空白 6 ― 19.24±1.21 1.58±0.45 ―
ETS 7 100 19.63±1.66 1.01±0.35＊＊ 35.82
CTX 10 50 19.32±2.14 0.66±0.52＊＊ 58.02
　　注:与空白组比较 , ＊＊P<0.01。
表 2　ETS对人肺腺癌 A549肿瘤 COX-2的影响
组别 视野数(n) COX-2 u值 P值― + ++ +++
空白 12 0 2 4 6 - -
ETS 12 0 6 6 0 2.26 ＊＊
CTX 12 0 6 3 3 1.82 ＊
　　注:与空白组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01。
表 3　ETS对人肺腺癌 A549肿瘤微血管密度的影响
组别 视野数(n) 微血管密度(个)
空白 6 25.17±3.66
ETS 6 10.17±2.32＊＊
CTX 6 8.50±3.27＊＊
　　注:与空白组比较 , ＊＊P<0.01。
图 1　COX-2免疫组化
图 2　微血管密度
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Vol.38, No.6, 2010 　　　　　　　　　
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　　从图表中可知 , ETS口服给药(100mg·kg-1)对人
肺腺癌 A549荷瘤裸鼠的肿瘤生长具有明显的抑制作
用(P<0.01),抑瘤率为 35.82%。ETS口服给药对人
肺腺癌 A549荷瘤裸鼠的瘤组织 COX-2的表达具有
明显的抑制作用(P<0.01)。对人肺腺癌 A549荷瘤
裸鼠的瘤组织的微血管密度有降低作用。
6　讨论
环氧化酶(cyclooxygenase, COX)是催化花生四烯
酸转变为前列腺素和血栓素的限速酶 ,与机体的各种
生理病理过程密切相关 ,有两种同工酶:COX-1、
COX-2。 COX-2可以抑制肿瘤细胞的凋亡 ,抑制免
疫应答 ,逃避免疫监视 ,促进肿瘤血管生成及转移复
发 。实验结果表明 ETS可以降低 COX-2的表达。可
能是通过促进肿瘤细胞凋亡 、增强免疫应答 、抑制肿瘤
血管生成及转移复发来实现其抗肿瘤作用机理 。
微血管密度(MicrovesselDensity, MVD)即平均每
平方毫米肿瘤面积内的血管数 ,这一病理学指标被认
为是评价肿瘤血管生成的 “金标准 ” [ 6] 。研究发
现 [ 6-9]微血管密度与肿瘤的转移 、复发 、预后等关系密
切 ,它是一个反映恶性肿瘤生物学行为的重要参数。
实验结果表明 ETS可以减少 MVD,可能通过抑制肿瘤
血管的生成 ,从而达到抗肿瘤作用。
参考文献:
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TheExperimentalStudyofAraliaElataSeemLeavestoNudeMouseA549
ExplantationLumpSuppressionRateandLumpBodyAssociatedProteinCOX-2
ExpressionInfluence
WANGLi-yan1 , XIAOHong-bin2 , ZHANGXiu-ping2 , WANGMing-hui2 , LILing-yan
(1.DaqinMedicialVocationalTrainingSchool, Daqin163312, China;
2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine, Harbin150040, China)
Abstract:Objective:Toinvestigatetheanti-tumorefectandmechanismofETS, Inordertoprovidereliablescientific
basisfordevelopingETSintoanewtargetofanticancerdrug.Methods:TomakeanimalmodelofA549 tumor-bearing
nudemiceandcarryonexperimentsinvivoantitumor, takethelumpbody, Weighlumpweight, calculatetumorsuppres-
sionrate;Two-stepimmunohistochemicaldetecttumor-associatedproteinCOX-2 , CD31 antibodyintumormi-
crovesseldensity.Results:ETScouldsignificantlyinhibittumorgrowthinnudemiceA549 invitro;inhibittheexpres-
sionofCOX-2;reducedmicrovesseldensity.Conclusion:Theresultsprovideanexperimentalbasisfortheanti-tumor
mechanismofAraliaelata.
Keywords:AraliaelataSeemLeaves;ExplantationLumpSuppressionRate;ProteinCOX-2;ExperimentalStudy
临 证 体 会
运用中药辨证治疗脊髓型颈椎病
张虹
(河南省洛阳正骨医院 ,河南 洛阳 471002)
关键词:中药;辨证施治;脊髓型颈椎病
中图分类号:R681　　　文献标识码:B　　　文章编号:1002-2392(2010)06-0032-02
收稿日期:2010-08-20　　修回日期:2010-09-10
作者简介:张虹(1972-),女 , 09级硕士研究生 , 副主任药师 ,研究方
向:主要从事医院临床药学和药事管理工作。
　　脊髓型颈椎病是骨伤科疑难病之一 ,多由于颈椎
椎体退化及相邻软组织(如椎间盘突出 、椎体后缘骨
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