全 文 ：辽东楤木叶总皂苷对 H22荷瘤小鼠
p53及 PCNA蛋白表达的影响
尹丽颖 ,边晓燕 ,肖洪彬＊ ,匡海学
(黑龙江中医药大学 ,哈尔滨 150040)
摘　要:目的:观察辽东楤木叶总皂苷对 H22荷瘤小鼠 p53及 PCNA蛋白的影响 ,初步探讨其体内抑瘤作
用机制 。方法:采用免疫组化法对 H22荷瘤小鼠 p53及 PCNA蛋白表达进行检测 ,运用真彩色病理图像
分析系统进行分析。结果:辽东楤木叶总皂苷能有效降低 H22荷瘤小鼠 p53及 PCNA蛋白的阳性表达。
结论:辽东楤木叶总皂苷可能通过抑制突变型 p53蛋白的表达 ,使 PCNA蛋白表达下调 ,从而抑制肿瘤
细胞增殖 ,以此作为其抗肿瘤的机制之一 。
关键词:辽东楤木叶总皂苷;H22荷瘤小鼠;p53;PCNA
中图分类号:R285.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2010)01-0018-03
收稿日期:2009-12-09　　修回日期:2009-12-15
基金项目:科技部国际科技合作项目(编号:2007dfa30930);国家自然科
学基金(项目批准号:30772779);黑龙江中医药大学基金资
助项目(99322)
作者简介:尹丽颖(1979-),女 ,助理研究员 ,方剂学硕士 , 现主要从事
透射电子显微技术工作。
＊通讯作者:肖洪彬(1957-),教授 ,博士生导师。研究方向:中药有效
成分研究。
　　恶性肿瘤已经成为影响人类生命健康的又一主要
疾病之一 ,彻底攻克癌症 ,一直是医学界重要的研究课
题 。中医中药在抑制杀伤肿瘤细胞 、提高机体免疫功
能 、减轻放化疗后的毒副作用等方面发挥着重要的作
用 [ 1] 。中药辽东楤木叶具有补气安神 、强精补肾 、祛
风活血 、除湿止痛之功效。近年来本课题组研究发现
辽东楤木叶总皂苷具有抑制肿瘤生长的作用 [ 2-4] ,本
研究在前期工作的基础上 ,通过测定 H22荷瘤小鼠肿
瘤细胞中 p53及 PCNA蛋白的表达情况来进一步探讨
其抗肿瘤的作用机制 。
1　材料与方法
1.1　动物与瘤株　清洁级昆明种小鼠 30只 ,体重 18
～ 22g,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供 ,雌雄
各半。 H22腹水型小鼠肝癌细胞由哈尔滨医科大学肿
瘤研究所提供。
1.2　药品与试剂　辽东楤木叶总皂苷(ETS)由黑龙
江中医药大学中药化学教研室提供;环磷酰胺(CTX)
由江苏恒瑞制药厂生产 ,批号 06111521。
1.3　仪器　HIMAS-2000多媒体彩色病理图文分析
系统(同济医大), XSE-HI生物显微镜(重庆光学仪
器厂)。
1.4　实验方法
1.4.1　动物造模与分组　取体重 18 ～ 22g昆明小鼠
30只 ,雌雄各半 ,无菌条件下取第 8天转移癌 H22腹水
(计算活细胞大于 95%),用 0.9%生理盐水 1∶3稀释
后 ,每只鼠右侧腋部皮下注射 0.2ml瘤细胞悬液 ,然后
将荷瘤鼠随机分为 3组 ,即模型组 、ETS组 、 CTX组 ,
每组 10只。
1.4.2　给药方法与剂量 模型组:生理盐水灌胃
20mL/kg/d,腹部皮下注射生理盐水 10mL/kg/d;ETS
组:ETS灌胃 100mg/kg/d, 腹部皮下注射生理盐水
10mL/kg/d;CTX组:生理盐水灌胃 20mL/kg/d, 腹部
皮下注射 CTX30mg/kg/d。以上各组均在实验第 2天
开始用药 ,每日 1次 ,连续 10天 ,禁食 12小时后处死
小鼠 ,剥离瘤组织 。
1.4.3　p53及 PCNA蛋白免疫组化检测 采用免疫组
化二步法。常规切片脱蜡 、水化 , 3%H2O2孵育 5min,
PBS冲洗 ,柠檬酸热修复抗原 ,加一抗 4℃过夜 , PBS冲
洗 ,加二抗室温孵育 20min, PBS冲洗 , DAB染色 ,苏木
精复染 , 脱水透明封片。由 PBS代替一抗作阴性
对照。
1.4.4　结果判定　胞核染成棕黄色为阳性细胞。于
光学显微镜下观察肿瘤细胞的生长情况 ,其结果运用
真彩色病理图像分析系统进行分析。每组随机选取
10个视野 ,利用显微摄像系统在 400×下输入计算机 ,
通过灰度调节分析阳性目标总面积与统计场总面积比
值 ,取平均值进行统计分析 。
1.4.5　统计学处理　应用 spss10.0统计学软件处
理 ,采用单因素方差分析 ,结果以 x±s表示 ,以 P<
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0.05有统计学意义。
2　结果
2.1　p53蛋白的表达情况
p53蛋白检测结果显示:模型组荷瘤小鼠的肿瘤
细胞中突变型 p53蛋白的阳性表达异常增高 ,免疫组
化染色可见大片深棕色区域;ETS组突变型 p53蛋白
的表达明显降低 ,与模型组比较有显著性差异(见图
1、2、3)。
图 1　p53模型组 IH400× 图 2　p53 ETS组 IH400×
图 3　p53CTX组 IH400× 图 4　PCNA模型组 IH400×
2.2　PCNA蛋白的表达情况
PCNA蛋白检测结果显示:模型组荷瘤小鼠的肿
瘤细胞中 PCNA蛋白的表达率明显增高 ,而 ETS组与
模型组比较 , PCNA蛋白的表达明显受到抑制(见图 4、
5、6)。
图 5　PCNAETS组 IH400× 图 6　PCNACTX组 IH400×
2.3　利用多媒体图象分析系统统计 ETS对 H22荷瘤
小鼠 p53及 PCNA蛋白表达的影响
数据显示:与模型组比较 , ETS组 、CTX组中突变
型 p53蛋白的阳性表达均低于模型组 ,差异有显著性
意义(P<0.01)。与模型组比较 , ETS组 、CTX组中
PCNA蛋白的阳性表达均低于模型组 ,有显著性差异
(P<0.05),结果见表 1。
表 1　ETS对 H22荷瘤小鼠 p53及 PCNA蛋白表达的影响( x±s)
组别 例数(n) p53阳性细胞数 PCNA阳性细胞数
模型组 10 64.87±10.72 65.24±15.06
ETS组 10 44.03±11.53＊＊ 52.14±12.37＊
CTX组 10 37.76±9.16＊＊ 50.73±12.33＊
　　注:与模型组比较 , ＊P<0.05;＊＊P<0.01
3　讨论
肿瘤的发生通常认为是由于细胞原癌基因的激活
和抑癌基因失活扰乱了正常细胞的增殖和分化的调
控 ,导致增殖过度 、分化不足所致。在一系列的肿瘤抑
制基因中 , p53基因与肿瘤的关系较早受到人们的重
视 ,而且也是研究的最为广泛 、最为系统的抗癌基因之
一 。p53蛋白分为野生型和突变型两种 。野生型 p53
蛋白质分子具有抑制肿瘤细胞的作用 ,但其突变型的
等位基因却往往具有癌基因的作用特点。突变型的
p53蛋白作为一种显性的负性调节因子 ,干扰了野生
型 p53蛋白的作用 ,其机制是突变型 p53蛋白质分子
与野生型 p53蛋白质分子结合 ,形成一种异寡聚体形
式 ,这种复合物能够改变野生型 p53蛋白质分子的构
象 ,使其失去与特异性 DNA序列进行结合的能力。所
以 ,突变型 p53蛋白不能监视损伤的 DNA,不能诱导
突变的细胞凋亡 ,不能使异常增殖细胞停止增殖 ,最终
引起细胞癌变 [ 5 -7] 。本实验显示 ETS的抗肿瘤作用
可能与抑制突变型 p53蛋白的表达有密切相关 。
PCNA即增殖细胞核抗原 ,在正常增殖和转化的
细胞中 , PCNA储量有明显的周期性变化。大部分 G0
～ G1期细胞没有明显的 PCNA表达 ,在 G1晚期表达
量大幅度增加 , S期达到高峰 , G2 ～ M期下降 ,在 M期
和静止期达到最低水平 ,这和细胞内 DNA复制时相变
化一致 [ 8] 。 PCNA的表达强度可以反映细胞增殖活
性 ,据此可用于判断肿瘤细胞的生长速度 ,协助鉴别良
性恶性病变 [ 9, 10] 。PCNA作为一项评估细胞增殖状态
的指标在肿瘤研究中的应用日渐增多 。肿瘤细胞的无
限增殖在一定程度上反映了肿瘤细胞的代谢和 DNA、
RNA的合成状态 ,其增殖活性与肿瘤细胞的浸润 、转
移和预后有关 ,是独立于其它肿瘤特征的基因标记 。
近年来 ,许多研究表明在组织恶变过程中 p53与
PCNA之间存在着密切的正相关 [ 11, 12] 。本研究结果也
证明了作为核内转入因子的突变型 p53基因能够激活
细胞增殖相关基因的表达功能 ,促进细胞增殖 ,从而使
PCNA呈现高表达 ,使细胞增殖逐渐活跃 ,凋亡下降。
野生型 P53蛋白能通过上调 GADD45的转录而减弱
DNA的修复 ,该基因与 PCNA蛋白结合后可抑制细胞
进入细胞周期的 S期 ,使 G1期向 S期及 G2期向 M期
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的癌细胞增殖受阻 ,从而使移植瘤生长停顿。
综上所述 ,我们认为 ETS可能通过抑制突变型
p53基因的表达 ,使 PCNA基因表达下调 ,从而抑制肿
瘤细胞增殖 ,并以此作为其抗肿瘤的机制之一 。
参考文献:
[ 1] 　李庆玲.谈中医药治疗肿瘤的特色及其作用 [ J] .中医药学报 ,
2001, 29(5):4-6.
[ 2] 　匡海学.龙牙楤木叶总皂甙抗肿瘤作用的研究 [ C] .1995年人参
类植物国际会议论文汇编 , 1995:109.
[ 3] 　韩玉英.龙牙楤木总皂甙的遗传毒性及抗肿瘤作用研究 [ D] .哈
尔滨:黑龙江中医药大学 , 2002.
[ 4] 　王丽岩 ,肖洪彬 ,王鸣慧.辽东楤木叶总皂苷抗急性肝损伤的实验
研究 [ J] .中医药信息 , 2009, 26(2):29-30.
[ 5] 　成军.肿瘤相关基因 [ M] .北京:北京医科大学出版社, 1999:281.
[ 6] 　焦广宇 ,魏新刚 ,苏云明.灵芪胶囊对 H22荷瘤小鼠 P53蛋白表达
的影响 [ J] .中医药信息 , 2009, 26(4):94-95.
[ 7] 　白云 ,苏慧 , 苏云明.脑心康片对脑缺血大鼠细胞凋亡相关蛋白
P53表达的影响 [ J] .中医药信息 , 2009, 26(3):84-86.
[ 8] 　FracchiloosNS, CapaccioP, Carboni-N, etal.Immunohistochemical
andmolecularanalysisofbax, bcl-2 andp53 genesinlaryngeal
squamouscelcarcinomas[ J] .AnticancerRes, 1999, 19(2A):1043.
[ 9] 　王立生 ,赵俊生 ,阙锦荣 ,等.PCNA在淋巴结反应性增生及非何
杰金氏恶性淋巴瘤中的表达 [ J].第一军医大学学报 , 1998, 18
(3):171.
[ 10] 余柏林 ,李春杰 ,魏品康.消痰散结方干预胃癌组织增殖细胞核抗原
(PCNA)表达影响的研究 [ J].中医药信息, 2008, 25(5):56-59.
[ 11] 张光霁.藤蟾方对 S180小鼠 p53和 PCNA蛋白表达的影响 [ J].
现代中西医结合杂志 , 2004, 13(12):1566-1567.
[ 12] 蔡宇.消瘤饮对肉瘤小鼠的抑制作用及对 p53和 PCNA的影响
[ J] .中成药 , 2005, 27(2):234-235.
蓬子菜水溶液对股动脉硬化闭塞症家兔模型
血清 C-反应蛋白的影响
赵钢 ,吕勃川 ,孙秋
(黑龙江中医药大学附属第一医院 血管外科 ,黑龙江 哈尔滨 150040)
摘　要:目的:观察蓬子菜水溶液对股动脉硬化闭塞症家兔模型的血清 C-反应蛋白的影响 ,进一步探
讨蓬子菜水溶液治疗动脉硬化闭塞症的作用机理。方法:采用复合手段制成 “股动脉硬化闭塞症 ”家兔
模型 ,观察蓬子菜水溶液对其血清血清 C-反应蛋白的影响。结果:蓬子菜水溶液可降低股动脉硬化闭
塞症家兔血清 C-反应蛋白 ,并且明显优于对照组(P<0.01)。结论:蓬子菜水溶液可降低血清 C-反
应蛋白 ,对动脉硬化闭塞症的发生发展有着很好的抑制作用 ,起着积极的治疗作用。
关键词:动脉硬化闭塞症;蓬子菜水溶液;C-反应蛋白
中图分类号:R285.5;R543.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2010)01-0020-03
收稿日期:2010-11-05　　修回日期:2010-01-08
基金项目:国家教育部春晖计划项目(项目编号:Z2008-1-15004)
作者简介:赵钢(1958-), 男 ,主任医师 , 硕士研究生导师 , 主要从事周
围血管病临床及科研工作。
　　动脉硬化闭塞症(atherosclerosisobliterans, ASO)
是全身性动脉粥样硬化在肢体局部的表现 ,好发于腹
主动脉下端 、髂动脉及股腘动脉 ,严重时可发生肢体坏
疽而合并感染 ,截肢率和死亡率均比较高 ,发病率呈逐
年明显增多的趋势 [ 1] 。根据其病因病机 、发病特点和
临床表现 ,中医学将其归属为 “脱疽 ”范畴 。西方学者
倾向于在手术及基因方面进行研究 ,主要以抗凝 、扩张
血管 、降血脂等药物为主改善肢体的血液循环。我国
由于中西医结合工作卓有成效的开展 ,非手术治疗在
动脉硬化闭塞症的研究与治疗中占据着较大的优势 ,
尤其是对于不能耐受手术 ,或并发其他疾病的老年患
者来说 ,中药为首选的治疗途径 。近年来 ,随着发病率
的逐年增高 ,对本病的基础研究越来越受到国内外学
者的重视。本实验在股动脉硬化闭塞症家兔模型建立
基础上 ,应用我院临床治疗 ASO的常用中药蓬子菜水
溶液进行治疗 ,研究其对本病的治疗机制 。
1　材料与方法
1.1　实验动物　60只体重 1.5 ～ 2.0kg的健康新西
兰大白兔 ,均为雄性 ,由黑龙江中医药大学动物实验中
心提供 。在黑龙江中医药大学动物实验室内喂养。
1.2　试剂与药物
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Vol.38, No.1, 2010