全 文 ：书收稿日期:2012-03-28; 修订日期:2012-09-18
基金项目:国家自然科学基金面上项目( No． 30772779) ;
国家“十二五”重大新药创制科技重大专项
( No． 2011ZX09102 － 001 － 18)
作者简介:张秀萍( 1980-) ，女( 汉族) ，黑龙江绥滨人，现为黑龙江中医药
大学博士研究生，硕士学位，主要从事中药药理研究工作．
* 通讯作者简介:肖洪彬( 1957-) ，男( 汉族) ，黑龙江大庆人，现任黑龙江
中医大学教授，硕士学位，主要从事中药药理研究工作．
辽东楤木叶总皂苷体外抗肿瘤作用的研究
张秀萍1，尹丽颖1，牛雯颖1，刘佳维2，肖洪彬1*
(1．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040; 2．牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)
摘要:目的 探讨辽东楤木叶总皂苷( ETS) 的体外抗肿瘤作用，为进一步将其开发成新靶点的抗肿瘤药物提供可靠的科
学依据，为研发具有自主知识产权的抗肿瘤新药奠定坚实的基础。方法 利用磺酰罗丹明 B( SRB) 染色法，观察辽东楤木
叶总皂苷不同浓度对 A549、BGC、BEL － 7402 和 HCT － 8 肿瘤细胞的抑制作用。结果 ETS浓度达到 31． 25 μg·ml －1时即
可对人肺腺癌 A549 细胞、人胃癌 BGC细胞和人肝癌 BEL － 7402 细胞有 50%生长抑制作用，达到 62． 5 μg·ml －1时即可
对人结肠癌 HCT － 8 细胞有 50%生长抑制作用。其浓度达到 125 μg·ml －1时即可对人胃癌 BGC 细胞和人肝癌 BEL －
7402细胞有 50%杀死的作用。浓度达到 500 μg·ml －1时即可对人结肠癌 HCT － 8 细胞有 50%杀死的作用，而对人肺腺
癌 A549 细胞未测出其 50%杀死作用。各组均未测出完全抑制细胞生长所需的 ETS 浓度。对于体外加药 48 h 后对
A549、BGC、BEL和 HCT － 8 细胞 OD值的影响，ETS组 500，250，125 μg·ml －1均有极显著性统计学差异( P ＜ 0． 01) ，62． 5
μg·ml －1对 A549、BEL和 HCT － 8 均有显著性意义; 31． 25μg·ml －1均无统计学意义。结论 ETS 体外对人肺癌 A549、人
胃癌 BGC、人肝癌 BEL － 2、人结肠癌 HCT － 8 肿瘤细胞有一定的抑制作用。
关键词:辽东楤木叶总皂苷; SRB法; 抗肿瘤作用
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 12． 008
中图分类号:R962 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2012) 12-2966-02
Antitumor Effect of Congmuye Total Saponins on Tumor Cells in Vitro
ZHANG Xiu-ping 1，YIN Li-ying 1，NIU Wen-ying 1，LIU Jia-wei 2，XIAO Hong-bin 1*
( 1． Heilongjiang University of Chinese Traditional Medicine，Harbin 150040，China; 2． Mudanjiang College of
Medicine，Mudanjian 157011，China)
Abstract: Objective To investigate the antitumor effect of Congmuye total saponins in vitro． Methods Detected the activities of
A549，BGC，Bel － 7402 and HCT － 8 cells with SRB staining when they were administered by different concentrations of ETS． Re-
sults When the concentration of ETS was 31． 25μg·ml －1，it had 50% inbition to A549，BGC and Bel － 7402 cells，and the HCT
－ 8 was 62． 5μg·ml －1 ． The 50% killed effect was 125μg·ml －1 and 500μg·ml －1 to BGC，Bel － 7402 and HCT － 8 cells，re-
spectively． Conclusion ETS has some inhibition on A549，BGC，Bel － 7402 and HCT － 8 cells in vitro．
Key words: Congmuye total saponins; SRB staining; Antitumor effect
恶性肿瘤是严重危害人类生命及健康的重大疾病，目前已成
为人类最大的杀手之一，其病死率已上升至人类疾病死亡的第二
位［1］。据世界卫生组织预测，2020 年全球癌症新发病例将达到
2 000万，其中 1 200 万人将死于癌症［2］。
辽东楤木(Araia elata Seem)为五加科楤木属植物，又名龙牙
楤木、刺老牙等。祖国医学以辽东楤木的根皮和树皮入药，其药
材名为刺老鸦，具有补气安神、强精滋肾、祛风活血、除湿止痛之
功效，用于治疗神经衰弱、风湿性关节炎、糖尿病、便秘、外伤出血
及阳虚气弱、肾气不足等症。前期研究表明，辽东楤木叶中的总
皂苷为抗肿瘤有效部位，并基本阐明了其抗肿瘤有效部位的化学
成分，确定了它们的化学结构，并对三萜皂苷类化合物的化学结
构与抑制肿瘤细胞生长的作用间的构效关系进行了研究，发现一
些重要的规律，并从辽东楤木叶中筛选出活性很强的化合物，这
些规律对抗肿瘤药物的筛选、设计和研发具有重要的指导意
义［3，4］。本研究在前期的研究基础上，利用 SRB染色法重点观察
辽东楤木叶总皂苷体外抗肿瘤作用。
1 材料
1． 1 试剂 辽东楤木叶总皂苷(黑龙江中医药大学中药化学教
研室提供) ;5 －氟脲嘧啶注射液(天津金耀氨基酸有限公司) ;磺
酰罗丹明 B(Sigma公司) ;RPMI － 1640(德国贝尔公司) ;胰蛋白
酶(德国贝尔公司) ;胎牛血清(德国贝尔公司) ;Tris Base(Cxbio
Biotechnology Ltd．)。
1． 2 人肿瘤细胞株 人肺腺癌细胞株(A549)、人肝癌细胞株(BEL
－7402)、人胃癌细胞株(BGC)、人结肠癌细胞株(HCT － 8):由中国
医学科学院、中国协和医科大学药用植物研究所药理实验室惠赠。
2 方法
2． 1 细胞培养 将 A549、BGC、HCT － 8、BEL － 7402 细胞株置于
含 10%胎牛血清、青霉素和链霉素各 100 U·ml －1的 RPMI －
1640 培养基(完全培养基)中，置于含 5% CO2、37℃、饱和湿度的
培养箱中培养。
2． 2 磺酰罗丹明 B 染色 ①取指数生长期的 A549、BGC、BEL －
7402、HCT － 8 细胞，分别配成浓度为 3． 4 × 103、7． 4 × 103、6． 4 ×
103、2 × 103 cells·ml －1的细胞悬液。②各组细胞分为细胞对照
组、空白对照组、5 －氟脲嘧啶组、辽东楤木叶总皂苷不同浓度组。
按 100 μl /孔置于 96 孔板，空白对照组加相同体积的完全培养
基。于 37℃、5%CO2 的培养箱中培养 24 h。③药物作 5 个稀释
度，依次作 1∶ 2 稀释。每一浓度重复 6 个孔。24 h 后各给药组
加相应浓度的药物 100μl，空白对照组和细胞对照组加相同体积
的完全培养基。于 37℃、5% CO2 的培养箱中培养 2 d。④每孔
加预冷 50% TCA 50 μl(TCA 终浓度 10 %)固定，4℃放置 1 h。
倒掉固定液，小孔用去离子水洗 5 遍，空气干燥。⑤每孔加 100μl
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书SRB，室温放置 10 min。未与蛋白结合的 SRB用 1%醋酸洗 5 遍，
空气干燥。结合的 SRB用 150 μl 10mmol·L －1非缓冲 Tris 碱液
溶解。⑥酶标仪 510 nm测定每孔 OD 值。每一种细胞同时设两
块 96 孔板，其中一块用作对照组测定加药细胞的 OD值(T0)。
2． 3 指标测定及方法 辽东楤木叶总皂苷各浓度对人肺腺癌
A549、人胃癌 BGC、人肝癌 BEL － 7402、人结肠癌 HCT － 8 细胞的
杀伤作用。采用美国国立癌症研究所常用 GI50、TGI、LC50表
示［5］。具体计算方法及意义如下:
规定对照组的 OD 值为 C，样品组的 OD 值为 T，药物作用 0
时的 OD值为 T0(刚刚加药，药物还没有发挥作用时的 OD值)。
GI50、TGI、LC50的具体计算方法为:
GI50是指 100 ×［(T － T0)/(C － T0) ］= 50，表示抑制 50%蛋
白净增加量所需的药物浓度。
TGI是指 100 ×［(T － T0)/(C － T0)］=0，表示使蛋白净增加量
为 0时所需药物浓度，换句话说，就是药物作用后的蛋白量等于药物
作用前的蛋白量，即蛋白量没有增加，药物完全抑制细胞生长。
LC50是指 100 ×［(T － T0)/T0］－ 50，表示引起 50%蛋白减少
所需的药物浓度，即药物作用后的蛋白量低于药物作用前的蛋白
量，反映出药物对细胞有杀伤作用。
2． 4 统计学方法 数据用 珋x ± s 表示，采用 SPSS17． 0 统计软件，
组间比较用 t检验进行分析。
3 结果
3． 1 对 A549、BGC、BEL － 7402、HCT － 8 细胞的杀伤作用 实验
采用 ETS和 5 － FU各设定 5 个浓度，实验结果按是否达到细胞
50%生长抑制所需的药物浓度(GI50) ，100%生长抑制所需的药
物浓度(TGI) ，杀死 50%细胞所需的药物浓度(LC50)3 种判定方
法判定结果。结果可见，ETS对 A549 的 GI50为 31． 25μg·ml
－1;5
－ FU的 GI50为 12． 5μg·ml
－1;均未测出其 TGI 和 LC50(表 1)。
ETS对 BGC的 GI50为 31． 25μg·ml
－1，LC50为 125μg·ml
－1，未测
出 TGI;5 － FU GI50为 25μg·ml
－1，未测出 TGI和 LC50(表 2)ETS
对 BEL － 7402 GI50为 31． 25μg·ml
－1，LC50为 125μg·ml
－1;5 －
FU的 GI50为 12． 5μg·ml
－1，LC50为 100μg·ml
－1;5 － Fu TGI 为
50，25，12． 5μg·ml －1(表 3) ，ETS对 HCT － 8 的 GI50为 62． 5μg·
ml －1，LC50为 500μg·ml
－1，未测出 TGI;5 － FU 的 LC50为 100μg
·ml －1(表 4)。
表 1 ETS各浓度体外对人肺腺癌 A549 细胞的杀伤作用
组别 浓度 C /μg·ml －1 GI50 TGI LC50
ETS 500． 00 + － －
250． 00 + － －
125． 00 + － －
62． 50 + － －
31． 25 + － －
5 － FU 200． 00 + － －
100． 00 + － －
50． 00 + － －
25． 00 + － －
12． 50 + － －
“ +”为有效，“ －”为无效
表 2 ETS各浓度体外对人胃癌 BGC细胞的杀伤作用
组别 浓度 C /μg·ml －1 GI50 TGI LC50
ETS 500． 00 + － +
250． 00 + － +
125． 00 + － +
62． 50 + － －
31． 25 + － －
5 － FU 200． 00 + － －
100． 00 + － －
50． 00 + － －
25． 00 + － －
12． 50 － － －
“ +”为有效，“ －”为无效
表 3 ETS各浓度体外对人肝癌 BEL － 7402 细胞的杀伤作用
组别 浓度 C /μg·ml －1 GI50 TGI LC50
ETS 500． 00 + － +
250． 00 + － +
125． 00 + － +
62． 50 + － －
31． 25 + － －
5 － FU 200． 00 + － +
100． 00 + － +
50． 00 + + －
25． 00 + + －
12． 50 + + －
“ +”为有效，“ －”为无效
表 4 ETS各浓度体外对人结肠癌 HCT － 8 细胞的杀伤作用
组别 浓度 C /μg·ml －1 GI50 TGI LC50
ETS 500． 00 + － +
250． 00 + － －
125． 00 + － －
62． 50 + － －
31． 25 － － －
5 － FU 200． 00 + － －
100． 00 + － －
50． 00 － － －
25． 00 － － －
12． 50 － － －
“ +”为有效，“ －”为无效
3． 2 辽东楤木叶总皂苷各浓度体外加药 48 h 后对 OD 的影响
SRB可与生物大分子中的碱氨基酸结合，其 OD值与细胞数呈良
好的线性关系，故可用作细胞数的定量。结果可见，各药物浓度
与细胞对照组比较，对于体外加药 48 h后对人肺腺癌 A549 细胞
OD值的影响，辽东楤木组 500，250，125，62． 5μg·ml －1均有极显
著性统计学差异，31． 25μg·ml －1无统计学意义。5 －氟脲嘧啶各
浓度组均有统计学意义(见表 5)。各药物浓度与细胞对照组比
较，对于体外加药 48h后对人胃癌 BGC 细胞 OD 值的影响，辽东
楤木组 500，250，125μg·ml －1、5 －氟脲嘧啶各浓度组均有极显
著性统计学差异，辽东楤木组 62． 5，31． 25μg·ml －1无统计学意
义(见表 6)。各药物浓度与细胞对照组比较，对于体外加药 48 h
后对人肝癌 BEL细胞 OD值的影响，辽东楤木组 500，250，125μg
·ml －1、5 －氟脲嘧啶各浓度组均有极显著性统计学差异，辽东楤
木组 62． 5μg·ml －1均有显著性统计学差异，31． 25μg·ml －1无统
计学意义(见表 7)。各药物浓度与细胞对照组比较，对于体外加
药 48h后对人结肠癌 HCT － 8 细胞 OD 值的影响，辽东楤木组
500，250，125，62． 5μg·ml －1、5 －氟脲嘧啶各浓度组均有极显著
性统计学差异，31． 25μg·ml －1无统计学意义(见表 8)。
表 5 ETS各浓度体外加药 48 h对
人肺腺癌 A549 细胞 OD值的影响(珋x ± s)
组别 浓度 C /μg·ml －1 OD值
对照 － 0． 346 ± 0． 049
ETS 500 0． 168 ± 0． 037＊＊
250 0． 182 ± 0． 093＊＊
125 0． 220 ± 0． 043＊＊
62． 5 0． 249 ± 0． 082
31． 25 0． 273 ± 0． 095
5 － FU 200 0． 223 ± 0． 057＊＊
100 0． 210 ± 0． 070＊＊
50 0． 213 ± 0． 063＊＊
25 0． 223 ± 0． 069*
12． 5 0． 238 ± 0． 064*
与对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;n = 6
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012VOL ． 23 NO． 12 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 12 期
书表 6 ETS各浓度体外加药 48 h
对人胃癌 BGC细胞 OD值的影响(珋x ± s)
组别 浓度 C /μg·ml －1 OD值
对照 － 0． 494 ± 0． 068
ETS 500 0． 076 ± 0． 029＊＊
250 0． 079 ± 0． 035＊＊
125 0． 102 ± 0． 039＊＊
62． 5 0． 377 ± 0． 169
31． 25 0． 587 ± 0． 193
5 － FU 200 0． 237 ± 0． 058＊＊
100 0． 249 ± 0． 056＊＊
50 0． 322 ± 0． 055＊＊
25 0． 343 ± 0． 042＊＊
12． 5 0． 398 ± 0． 023＊＊
与对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;n = 6
表 7 ETS各浓度体外加药 48 h
对人肝癌 BEL － 7402 细胞 OD值的影响(珋x ± s)
组别 浓度 C /μg·ml －1 OD值
对照 － 0． 774 ± 0． 243
ETS 500 0． 080 ± 0． 046＊＊
250 0． 065 ± 0． 042＊＊
125 0． 140 ± 0． 048＊＊
62． 5 0． 370 ± 0． 137*
31． 25 0． 830 ± 0． 219
5 － FU 200 0． 082 ± 0． 040＊＊
100 0． 219 ± 0． 045＊＊
50 0． 268 ± 0． 080＊＊
25 0． 375 ± 0． 096＊＊
12． 5 0． 439 ± 0． 049＊＊
与对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;n = 6
表 8 ETS各浓度体外加药 48 h
对人结肠癌 HCT － 8 细胞 OD值的影响(珋x ± s)
组别 浓度 C /μg·ml －1 OD值
对照 － 0． 774 ± 0． 243
ETS 500 0． 080 ± 0． 046＊＊
250 0． 065 ± 0． 042＊＊
125 0． 140 ± 0． 048＊＊
62． 5 0． 370 ± 0． 137*
31． 25 0． 830 ± 0． 219
5 － FU 200 0． 082 ± 0． 040＊＊
100 0． 219 ± 0． 045＊＊
50 0． 268 ± 0． 080＊＊
25 0． 375 ± 0． 096＊＊
12． 5 0． 439 ± 0． 049＊＊
与对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;n = 6
4 结论
通过 SRB法的使用，本实验结果表明，辽东楤木叶总皂苷
1255μg·ml －1起即对人肺腺癌 A549 细胞有抑制作用;对人胃癌
BGC细胞达到 62． 5 μg·ml －1即有效果;而对于人肝癌 BEL －
7402 细胞和人结肠癌 HCT － 8 细胞在 31． 255 μg·ml －1即有效
果。其作用机理有待进一步研究。
参考文献:
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版社，2005:1787．
收稿日期:2012-05-14; 修订日期:2012-09-18
基金项目:国家自然科学基金( No． 31100421) ; 植物资源与利用湖南省高校重点实验室开放基金课题( No． JSK201113)
作者简介:袁带秀( 1975-) ，女( 土家族) ，湖南绥宁人，现任吉首大学医学院实验师，硕士学位，主要从事中医药抗衰老研究工作．
杜仲粕对 D －半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用研究
袁带秀1，2，袁志忠2，李中正1
(1．吉首大学医学院，湖南 吉首 416000;
2．吉首大学植物资源与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000)
摘要:目的 研究杜仲粕对 D －半乳糖诱导的衰老小鼠的抗衰老作用，并对其可能作用机制进行了探讨。方法 小鼠随机
分为 4 组: 空白对照组，衰老模型组( 350 mg·kg －1·d －1 ) ，杜仲粕组( 300 mg·kg －1·d －1 ) ，维生素 E组( Vit E) ( 100 mg
·kg －1·d －1 ) 。6 周后，测定小鼠血清、肝脏组织和脑组织中超氧化物歧化酶( SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH － Px) 、
总抗氧化能力( T － AOC) 及丙二醛( MDA) 含量。结果 与衰老模型组相比，杜仲粕组和 Vit E组可提高小鼠血清、肝组织
和脑组织 SOD、GSH － Px、T － AOC活力，降低 MDA含量。结论 杜仲粕具有延缓衰老的作用，其作用机制可能与提高抗
氧化酶活性、减少过氧化脂质生成，清除体内自由基，提高机体抗氧化能力有关。
关键词:杜仲粕; D －半乳糖; 小鼠; 抗衰老; 自由基
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 12． 009
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2012) 12-2968-03
Anti － aging Effect of Eucommia Fruit Mea on D － Galactose － induced Mouse Aging
Model
YUAN Dai-xiu1，2，YUAN Zhi-zhong2，LI Zhong-zheng2
·8692·
时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 12 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012VOL． 23 NO． 12