全 文 ：·中草药· 北方园艺２０１３（１７）：１５４～１５６
第一作者简介：李光（１９８０－），男，河南商丘人，博士，副教授，研究方
向为作物遗传育种及天然产物提取。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｇ２００２９＠１２６．ｃｏｍ．
责任作者：陈庆富（１９６６－），男，教授，博士生导师，研究方向为作物
遗传育种及天然产物提取。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｑｆ１９６６＠１６３．ｃｏｍ．
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１０６０２０７，３１１７１６０９）；国
家现代农业产业技术体系专项资金资助项目（ＣＡＲＳ－０８－Ａ４）；贵州
省农业科技攻关资助项目（黔科合ＮＹ字［２０１０］３０９４）；贵州省科
技创新团队资助项目（黔科合人才团队（２０１１）４００７）；贵阳市科技
计划资助项目（筑科合同［２０１１１０２］１－１２）。
收稿日期：２０１３－０４－１５
金荞麦叶总黄酮含量测定方法研究
李 光１，２，３，余 霜１，邓 银１，周 永 红２，陈 庆 富１
（１．贵州师范大学 生命科学学院 植物遗传育种研究所，荞麦产业技术研究中心，贵州 贵阳５５０００１；
２．四川农业大学 小麦研究所，四川 温江６１１１３０；３．安顺学院 化学与生物农学系，贵州 安顺５６１０００）
摘 要：以金荞麦叶为试材，采用超声波辅助法提取金荞麦叶中的黄酮类化合物，研究了基
于亚硝酸钠－硝酸铝法的金荞麦叶总黄酮含量测定的改良方法。结果表明：该方法稳定性好，操作
简单方便，可适用于金荞麦叶提取液中总黄酮含量的测定。
关键词：金荞麦叶；黄酮；测定方法
中图分类号：Ｓ ５６７ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００１－０００９（２０１３）１７－０１５４－０３
黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，它
能清除生物体内的自由基，具有抗氧化作用［１］。金荞
麦（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｃｙｍｏｓｕｍ （Ｔｒｅｖ．）Ｍｅｉｓｎ．）属蓼科
（Ｐｏｌｙｇｏｎａｃｅａｅ）荞麦属（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ）植物。别名天荞麦、
赤地利（唐本草）、透骨消、苦荞麦、野桥荞麦［２］，它是国家
二级保护植物，药用价值极大。金荞麦叶富含黄酮类化
合物，而有关金荞麦叶总黄酮含量的研究鲜见报道。该
研究拟以建立基于亚硝酸钠－硝酸铝法的金荞麦叶总黄
酮含量的改良测定方法为目标，以期为金荞麦的合理开
发利用提供理论基础和科学依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
金荞麦叶采自贵州师范大学生命科学学院植物遗
传育种研究所。芦丁标准品购自贵州迪大生物有限公
司；乙醇（９５％）为分析纯，１２．５ｃｍ快速试纸（杭州特种
纸业有限公司）。ＤＨＧ－９０Ａ（１０１ＡＢ）干燥箱（上海索谱仪
［５］ Ｄｕｆ Ｓ Ｊ Ｂ，Ｍｕｒｒａｙ Ｗｉｌｉａｍ Ｄ．Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｒｅｓｔ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎｄｕｓｔｒｙ
ｗａｓｔｅ ｃｅｌｕｌｏｓｉｃｓ ｔｏ ｆｕｅｌ ｅｔｈａｎｏｌ：ａ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，
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ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｇｎｏｃｅｌｕｌｏｓｉｃ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
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Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｄｉｌｕｔｅ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍｓｐ．Ｃｅｌｕｌｏｓｅ
ＳＨＩ Ｊｉｎｇ１，２，ＬＩＮ Ｚｈａｎ－ｘｉ １，２，ＬＩＮ Ｄｏｎｇ－ｍｅｉ １，ＳＵ Ｄｅ－ｗｅｉ １，２，ＬＵＯ Ｈａｉ－ｌｉｎｇ１，ＬＩＮ Ｘｉｎｇ－ｓｈｅｎｇ１，
ＬＩＮ Ｚｈａｎ－ｓｅｎ１，ＺＨＥＮＧ Ｄａｎ１，２，ＹＡＯ Ｊｕｎ－ｘｉｎ１，２，ＣＨＥＮ Ｊｉｎ－ｈｕａ１，２
（１．Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｕｎｃａｏ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ ３５０００２；２．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ ３５０００２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍｓｐ．ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ，ａｃｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅ ａｎｄ
ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ Ｈ２ＳＯ４ｏｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍｓｐ．ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｄｉｌｕｔｅ ａｃｉｄ（Ｈ２ＳＯ４）ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ａｓ
ｆｏｌｏｗｓ：ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ １∶２０，ａｃｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ２．０％，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ ６０ｍｉｎ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ １００℃．Ｔｈｉｓ
ａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｇｉａｎｔ Ｊｕｎｃａｏ ａｓ ｂｉｏ－ｅｔｈａｎｏｌ ｆｕｅｌ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍｓｐ．；ｃｅｌｕｌｏｓｅ；ｄｉｌｕｔｅ ａｃｉｄ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
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北方园艺２０１３（１７）：１５４～１５６ ·中草药·
器有限公司）；紫外可见分光光度计ＵＶ－１８００（岛津公
司）；ＡＲ１１４０电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；
ＷＢ－４００小型高速粉碎机（北京维博创机械设备有限公
司）；ＴＤＬ－５Ｃ型低速台式离心机（上海安亭科学仪器
厂）；ＡＫＪＹ－２０超纯净水机（艾柯）；ＫＱ－２５０ＤＥ型数控超
声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；ＰＨＳ－３Ｃ型酸度
计（上海虹仪仪器有限公司）。
１．２ 试验方法
１．２．１ 过滤对标准曲线的影响 准确称取１００ｍｇ芦丁
标准品，定容至１００ｍＬ，获得１．０ｍｇ／ｍＬ芦丁标准品。
用移液器吸取１．０、２．０、３．０、４．０、５．０ｍＬ芦丁标准品置
于１０ｍＬ容量瓶中，用６０％的乙醇补充至５．０ｍＬ，分别
加入５％的ＮａＮＯ２０．３ｍＬ，摇匀，放置６ｍｉｎ；再依次加
入１０％的Ａｌ（ＮＯ３）３０．３ｍＬ，摇匀，静置６ｍｉｎ，再分别加
入１．０ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ ４．０ｍＬ，用６０％乙醇定容至刻
度，摇匀，静置２０ｍｉｎ，然后于５１０ｎｍ下测吸光度。以吸
光度为纵坐标，浓度（ｍｇ／ｍＬ）为横坐标，绘制标准曲
线［３］。研究过滤法对芦丁标准的影响，使用快速定性滤
纸过滤，然后绘制标准曲线。
１．２．２ 金荞麦叶总黄酮测量方法的确定 取１００ｇ金
荞麦叶在６０℃下烘至恒重，粉碎后过４０目，准确称取
０．３ｇ干粉，以浓度为６０％的酒精，固液比１∶２０，温度
４０℃，提取时间２０ｍｉｎ，提取３次，超声波功率１７８．５Ｗ，
超声提取前静置５ｍｉｎ，提取液２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，
合并提取液即为黄酮提取液。移取黄酮提取液０．５ｍＬ，
按照１．２．１的方法加入试剂，然后进行１８０ｓ的连续吸
光度值测定，测定间隔设定为０．５ｓ。研究过滤对提取液
的影响，将提取液用１．０ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ调ｐＨ值至
９．０，静置，使用快速定性滤纸过滤，过滤后进行１８０ｓ的
连续吸光度值测定。
１．３ 数据分析
运用ＳＰＳＳ １７．０软件对连续吸光度值测定中获得
的吸光度值进行统计分析，对比２种方法的优劣。
２ 结果与分析
２．１ 过滤对标准曲线的影响
未过滤芦丁的浓度与其吸光度的回归方程为：
Ｙ＝０．１０１７ Ｘ－０．０１３９，Ｒ２＝０．９９９３（Ｘ为吸光度值．Ｙ
为总黄酮提取液浓度，单位为ｍｇ／ｍＬ）。过滤后测得芦丁
浓度与其吸光度的回归方程为：Ｙ＝０．１０４９Ｘ－０．０２６１，
Ｒ２＝０．９９９５，单位相同。过滤前后的标准曲线的方程变
化不大，从拟合优度系数来看，过滤后标准曲线方程相
关系数有所提高。由表１可知，芦丁标准品溶液通过快
速滤纸后，吸光度变化不大，变化区间在正负０．００９０之
间，第３组数据过滤前后的吸光度是一致的。表明芦丁
在通过滤纸的过程中损失较小，暗示提取液通过滤纸后
再测量黄酮含量的方法是可行的。
表１ 过滤法对标准溶液吸光度值的影响
Ｔａｂｌｅ １ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｏｎ ａｂｓｏｒｂｅｎｃｙ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
黄酮浓度
／ｍｇ·ｍＬ－１
未过滤吸光度 过滤后吸光度 吸光度差
１．０ ０．０８９０ ０．０８３０ ０．００６０
２．０ ０．１８７０ ０．１７８０ ０．００９０
３．０ ０．２８９０ ０．２８９０ ０．００００
４．０ ０．４０００ ０．３９３０ ０．００７０
５．０ ０．４９１０ ０．５０００ －０．００９０
２．２ 金荞麦叶总黄酮含量测定方法的确定
从图１可以看出，使用２种方法进行测量的前６０ｓ
内数据均有一定的波动，这个阶段的数据不宜采用，而
在６０～１８０ｓ的区间内数据相对较好。对２种方法
６０～１８０ｓ区间的数据进行统计分析发现，过滤后提取液
的吸光度在标准误差、标准差、方差、峰度、偏度等指标
上均优于未过滤的提取液（表２）。表现在图１中，未过
滤的提取液吸光度曲线有较多的波峰，而过滤后明显减
少，故金荞麦叶总黄酮含量测定的方法为，使用快速滤
纸过滤提取液，依次加入反应液后静置２１ｍｉｎ，测量在
３ｍｉｎ内完成，以便获得更加稳定和重现性好的试验
数据。
３ 讨论与结论
该研究确定的静置时间与林静等［４］确定的１０～１５ｍｉｎ
不同，这可能是由于测定的对象不同造成的。同时，该
研究确定的测量方法对其它植物叶片黄酮含量的测定
是否适用要根据测定对象的不同具体分析。
该试验结果表明，过滤后提取液吸光度值的稳定性
比未过滤的好，其原因可能是在黄酮提取液中加入碱液
使部分杂质发生沉淀，过滤使沉淀被除去，导致过滤后
的黄酮提取液吸光度的动力学特征得到改善。
可见及紫外分光光度法是黄酮测量常用的方法，该
方法有操作简便、检测成本低的优点，目前使用的可见
及紫外分光光度法有亚硝酸钠－硝酸铝法和三氯化铝法
２种，而由于使用三氯化铝法获得的黄酮含量的测量值
比实际的要低，所以，亚硝酸钠－硝酸铝法的使用更为普
遍，该研究建立了一种基于亚硝酸钠－硝酸铝法的金荞麦
叶总黄酮含量的测定方法，该法可以为金荞麦其它组织
中总黄酮含量的测定提供参考。
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·中草药· 北方园艺２０１３（１７）：１５４～１５６
图１ ２种方法的时间进程曲线
注：Ａ：未过滤；Ｂ：过滤。
Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ ｇｒａｐｈ ｏｆ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｎｏｔｅ：Ａ：Ｎｏｔ ｆｉｌｔｅｒ；Ｂ：Ｆｉｌｔｅｒ．
表２ ２种方法吸光度值的统计分析
Ｔａｂｌｅ ２ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｂｓｏｒｂｅｎｃｙ ｖａｌｕｅ ａｂｏｕｔ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ
序号 标准误差 标准差 方差 峰度 偏度 区域
置信度
（９５．０％）
未过滤 ８．８７×１０－５ ０．００１０ ９．５×１０－７ ０．００９６ ０．３３６６ ０．００４６ ０．０００２
过滤 ５．６５×１０－５ ０．０００６ ３．９×１０－７ －１．３１４６ ０．１１４１ ０．００２１ ０．０００１
参考文献
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Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ
Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｃｙｍｏｓｕｍＣｏｍｐｌｅｘ Ｌｅａｖｅｓ
ＬＩ Ｇｕａｎｇ１，２，３，ＹＵ Ｓｈｕａｎｇ１，ＤＥＮＧ Ｙｉｎ１，ＺＨＯＵ Ｙｏｎｇ－ｈｏｎｇ２，ＣＨＥＮ Ｑｉｎｇ－ｆｕ１
（１．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｕｃｋｗｈｅａｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ ５５０００１；２．Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｎｊｉａｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ ６１１１３０；３．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｓｈｕｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｎｓｈｕｎ，Ｇｕｉｚｈｏｕ ５６１０００）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｃｙｍｏｓｕｍｃｏｍｐｌｅｘ ｌｅａｖｅｓ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ
ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍＦａｇｏｐｙｒｕｍ ｃｙｍｏｓｕｍｃｏｍｐｌｅｘ ｌｅａｖｅｓ，ａｎｄ ａ ｎｅｗ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｂａｓｅ ｏｎ ＮａＮＯ２－Ａｌ（ＮＯ３）３－
ＮａＯＨ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｂｕｉｌｔ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ａｎｄ
ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｐａｒｔｓ ｉｎ Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｃｙｍｏｓｕｍｃｏｍｐｌｅｘ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｃｙｍｏｓｕｍｃｏｍｐｌｅｘ ｌｅａｖｅｓ；ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ
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