全 文 ：收稿日期:2014 － 07 － 26;修回日期:2014 － 08 － 26
基金项目:2013 年度徐州市科技指导性计划项目 (XZZD1311)
作者简介:石丰运(1981 －)，女，讲师，硕士，研究方向为动物
分子学，xzsally@ 163． com．
运用 PCＲ技术检测水蛭成分和三叶青的真伪
石丰运，王海军，顾开朗，张善芳，董淑红，张海涛
(徐州生物工程职业技术学院，江苏 徐州 221006)
中图分类号:S853． 75;Q785 文献标识码:B 文章编号:1004 － 7034(2015)05 － 0212 － 02
关键词:水蛭;三叶青;PCＲ;检测;灵敏度
摘 要:为了对水蛭分子标记基因进行序列分析，试验选择 mtDNA的序列基因为目标基因，设计 1 对
特异性引物，用于对水蛭成分和三叶青进行检测。结果表明:水蛭中有性状差异较大的人工压制伪
品，尤其是以三叶青为代表的植物生品，通过对 PCＲ扩增体系的优化，该检测方法能实现对水蛭成分
和三叶青进行快速、准确地检测，具有很好的特异性及灵敏度。
水蛭为水蛭科动物蚂蟥又名宽水蛭(Whitmania
pigra Whitman)、水蛭(Hirude nipponica Whitman)或
柳叶蚂蟥又名长条水蛭(Whitmania acranulata Whit-
man)的干燥全体［1］。水蛭是一味传统药材，始载于
《神农本草经》，历代本草对它均有记录。近年来，由
于人们发现其对心脑血管疾病具有很好的治疗作用，
在临床上也越来越多地用于脑血栓、冠状动脉粥样硬
化性心脏病及脑水肿的治疗［2］。梁文艳［3］报道，水
蛭亦可以用于糖尿病、肾病的治疗。水蛭的临床研究
及药学研究越来越广泛，因此年需求量增加，供需矛
盾日益突出。目前，因水蛭价格不断上涨，常有不法
药材销售商掺假出售。用中药饮片代替水蛭粉，已严
重侵害患者的利益及身心健康，试验就水蛭和三叶青
的真伪鉴别检测报道如下。
1 材料与方法
1． 1 样品
水蛭粉、三叶青片，均购自徐州恩华药店。样品
均经过品种鉴定、验证。
1． 2 主要试剂与仪器
细胞 /组织 －基因组提取试剂盒，购自上海索莱
宝生物科技有限公司;Ex Taq DNA 聚合酶、dNTP、
DL －2 000 Marker、DL －1 500 Marker，均购自宝生物
工程(大连)有限公司;其他常规试剂，均由徐州生物
工程职业技术学院提供。MultiGeneⅡ普通 PCＲ 仪、
凝胶成像系统、核酸蛋白分析仪(型号为 DU800)，均
由徐州市检验检疫局提供。
1． 3 引物设计
试验根据聚合酶链式反应(PCＲ)的基本原理，
从 NCBI 上搜索到水蛭 mtDNA 的基因序列，使用
mtDNA基因扩增真核生物内源基因，以确保所提取
的 DNA 适合于 PCＲ 扩增 。用 DNAMAN 软件进行
同源性比对，选择以上物种同源性较高的 mtDNA 序
列作为引物设计的出发序列，用 Primer Premier 5 设
计，BLAST验证，设计出水蛭成分鉴别检测的特异性
引物，引物序列:上游引物 5– CCTTTCTATGCGGC-
CCAGCCGGCC– 3，下游引物 5 – ACCGGCGCAC-
CTGCGGGCCGC – 3，片段大小为 275 bp，由上海英
骏生物技术有限公司完成。
1． 4 DNA提取
称取样品 25 mg放入 1． 5 mL 的离心管中，其中
蛋白酶的作用时间延长至过夜，蛋白酶消化后
12 000 r /min离心 5 min，除去较大的杂质，除去杂质
的溶液按照试剂盒说明书操作步骤进行 DNA 的提
取，最后用 TE 溶液 100 μL 溶解 DNA，DNA 样品于
－ 20 ℃保存，备用。
1． 5 PCＲ扩增
PCＲ 扩增的反应体系(25 μL):DNA模板 1 μL，
10 × PCＲ Buffer 2． 5 μL，dNTP Mixture 1． 0 μL，Mg2 +
2． 0 μL，10 μmol /L 引物各 1． 0 μL，5 U /μL Taq 酶
0． 5 μL，加 ddH2O补足至 25 μL。特异性引物扩增条
件:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 40 s，58 ℃退火
35 s，72 ℃延伸 1 min，共 35 个循环;72 ℃再延伸
5 min。
PCＲ mtDNA 扩增产物用 1． 5%琼脂糖凝胶电泳
检测，用 Bio － Ｒad电泳仪进行电泳，电压为 90 V，时
间为 30 min。电泳结束后，用 Bio － Ｒad 凝胶成像系
统观察电泳结果。
2 结果与分析
2． 1 靶基因片段 PCＲ扩增结果
分别用宽水蛭、水蛭和长条水蛭 3 种水蛭粉和三
叶青压片 DNA 模板和空白对照进行 PCＲ 扩增。电
212
Heilongjiang Animal Science
and Veterinary Medicine № 05 2015
DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2015.0719
2015 年 05 月(上)
泳检测结果，见图 1。特异性引物能有效扩增出 3 种
水蛭 DNA模板，PCＲ产物经电泳分离，割胶纯化并测
序，结果表明，PCＲ 产物序列长度为 275 bp，与预期
扩增产物大小相同，空白对照无扩增条带。
M． DL － 2 000 Marker;1．宽水蛭;2．水蛭;3．长条水蛭;
4．三叶青;5．空白对照。
图 1 特异性引物水蛭 PCＲ扩增电泳结果
2． 2 特异性引物建立 PCＲ方法的灵敏度测试
测量水蛭的 DNA 模板原液浓度后，母液均定量
至 10 ng /μL，分别进行 10 ×梯度稀释，即 1 × 10 －1，
1 × 10 －2，1 × 10 －3，1 × 10 －4共 4 个梯度。用特异性引
物进行 PCＲ扩增，扩增后产物进行 1． 5%琼脂糖凝胶
电泳检测，结果见图 2。
M． DL － 2 000 Marker;1． 1 × 100;2． 1 × 10 －1;3． 1 × 10 －2;
4． 1 × 10 －3;5． 1 × 10 －4;6．空白对照。
图 2 特异性引物对水蛭成分的灵敏度检测结果
由图 2 可知，该特异性引物检测灵敏度可以达到
检测水平。
3 讨论
试验采用的特异性引物是选择 mtDNA水生动物
唯一的核外遗传物质，所有组织细胞中均含有大量的
线粒体［4］。mtDNA 主要由编码序列构成，种内的异
质基因很少，而在不同的物种间具有高度的变异性。
在高等植物中没有发现类似结构的基因，在植物
mtDNA 中也没有相似的编码同源蛋白的基因［5 － 6］。
因此，高等生物线粒体细胞色素 b基因是一个比较理
想的、保守性较好的分子标记基因。研究通过 1 对特
异性引物可以对水蛭进行有效扩增。
目前，以 DNA为基础的 PCＲ方法对动物物种成
分鉴定的报道较多，这些研究的重点主要是对常见动
物成分进行检测，如对牛、羊、猪、鸡、鸭等动物性成分
进行鉴定［7 － 10］;但对水蛭成分的检测目前较为少见。
研究建立的水蛭成分的 PCＲ 方法不仅特异性好，而
且灵敏度高，因此该检测方法可以为水蛭的真假鉴定
提供技术支撑。
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