全 文 ：基金项目:宁波市自然科学基金资助项目(2012A610181)
作者简介:丁丽，女，硕士，讲师 研究方向:中药药效物质基础及其质量控制 Tel:(0574)88222732 E-mail:nbncdl@ 163． com
三叶青三氯甲烷部位化学成分及其抗肿瘤活性研究
丁丽1，章璐幸1，邱彦2，王延辉1(1. 浙江医药高等专科学校药学系，浙江 宁波 315100;2. 厦门大学医学院，福建 厦门 361102)
摘要:目的 研究三叶青三氯甲烷部位的化学成分及其体外抗肿瘤活性。方法 利用硅胶，制备薄层板，LH － 20 等各种色谱
技术分离单体化合物，通过 NMＲ和质谱对化合物进行结构鉴定，并采用气-质联用色谱对三叶青三氯甲烷部位的其他成分进
行分析，采用 MTT法对分离得到的单体化合物进行抗肿瘤活性评价。结果 通过经典色谱法分离得到 6 个化合物，分析鉴定
为 β-谷甾醇(1) ，4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(2) ，齐墩果酸(3) ，5-羟甲基糠醛(4) ，壬二酸(5)和香草酸(6) ，并通过 GC-MS 指认
了 22 个化合物。结论 化合物 2 ～ 6 首次从三叶青中分离得到。化合物 1 和 3 对 Hela229 有较强的细胞毒活性，IC50分别为
40. 78，25. 69 μg·mL －1。化合物 3 对 A375 有较强的细胞毒活性，IC50为 69. 87 μg·mL
－1。三叶青三氯甲烷部位的体外抗肿
瘤活性由多种成分共同作用产生。
关键词:三叶青;气质联用;抗肿瘤;4-羟基-3-甲氧基苯甲醛;5-羟甲基糠醛;香草酸
doi:10. 11669 /cpj. 2015. 21. 005 中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2015)21 － 1857 － 04
Chemical Constituents in Chloroform Extraction of Tetrastigmatis hemsleyani Diels et. Gilg and Their Anti-
tumor Activities
DING Li1，ZHANG Lu-xing1，QIU Yan2，WANG Yan-hui1(1. Department of Pharmacy，Zhejiang Pharmaceutical College，
Ningbo 315100，China;2. College of Medicine，Xiamen University，Xiamen 361102，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To investigate the chemical constituents in chloroform extraction of Tetrastigmatis hemsleyani diels et.
Gilg and their antitumor activities. METHODS Various chromatography techniques such as column chromatography on silica gel，
Sephadex LH － 20 and preparative TLC were used to isolate and purify the compounds. Their structures were identified by1H-NMＲ，13
C-NMＲ and MS. Their antitumor activities was tested by MTT method. Moreover，the other compounds of chloroform extraction were
detected by GC-MS. ＲESULTS Six compounds were isolated by classic chromatography and identified as β-sitosterol(1) ，4-hydrox-
y-3-methoxybenzaldehyde(2) ，oleanolic acid (3) ，5-hydroxymethyl furfural(4) ，azelaic acid(5) ，vanillic acid(6). Twenty-two com-
pounds were identified by GC-MS. CONCLUSION Compounds 2 － 6 are isolated from this plant for the first time. Compounds 1 and
3 shows strong cytotoxic activities against Hela229 with IC50 values of 40. 78，25. 69 μg·mL
－1，respectively. Compound 3 also
showed strong cytotoxic activities against with IC50 values of 69. 87 μg·mL
－1. The result proved that antitumor activity of chloroform
extraction of Tetrastigmatis hemsleyani diels et. Gilg is due to the contribution of multi-components.
KEY WOＲDS:Tetrastigmatis hemsleyani;GC-MS;antitumor;4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde;5-hydroxymethyl furfural;vanillic
acid
中药材三叶青是葡萄科植物三叶崖爬藤(Tet-
rastigmatis hemsleyani Diels et Gilg)的干燥块根，在
民间常被用于小儿惊厥高热、支气管炎、肺炎、扁桃
体炎、咽喉炎、肝炎及病毒性脑膜炎的治疗［1］。课
题组前期对三叶青抗肿瘤活性部位进行筛选，发现
三氯甲烷提取部位有较强的体外肿瘤细胞抑制作
用［2-3］，为探明其中抗肿瘤活性成分，我们采用经典
柱色谱技术结合气相色谱-质谱联用仪对其进行化
学成分研究。本实验通过溶剂提取、硅胶色谱、制备
薄层色谱等方法分离得到 6 个化合物，分别鉴定为
β-谷甾醇(1) ，4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(2) ，齐墩果
酸(3) ，5-羟甲基糠醛(4) ，壬二酸(5)和香草酸(6) ，
其中 2 ～ 6 首次从该植物中分离得到，并采用 GC-
MS鉴定出 22 个化合物。利用 MTT法对化合物 1 ～
6 进行体外抗肿瘤实验，结果表明，化合物 3 具有显
著的抗肿瘤活性。
1 仪器与材料
Bruker AV － 500 型，INOVO 400 MHz 型核磁共
振波谱仪;AB 3200 Q-trap质谱仪，Agilent LC-MS 液
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质联用仪，柱色谱用硅胶(200 ～ 300 目)和薄层色谱
板(青岛海洋化工厂) ;葡聚糖凝胶 Sephadex LH －
20(Pharmacia 公司)。GC-MS 采用 Thermo scientific
ITQ 900 气相色谱-质谱联用仪测定。酶标仪(美国
Bio-Ｒad公司) ，倒置生物显微镜(Motic 实业集团有
限公司) ;CO2培养箱(力康生物医疗科技控股有限
公司) ，人宫颈癌细胞株 Hela 229 和人恶性黑色素
瘤细胞株 A375 系由本校细胞实验室冻存并提供，
MTT ［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltet-
razolium bromide］(美国 Amresco 公司) ，ＲPMI 1640
培养液(美国 Invitrogen 公司) ，胎牛血清、胰岛素
(上海蓝季科技发展有限公司) ，5-氟尿嘧啶注射液
(天津金耀氨基酸有限公司) ;乙醇、三氯甲烷均为
分析纯。
三叶青药材购自宁波市鄞州医药药材公司，经
浙江医药高等专科学校中药系杨雄志教授鉴定为
Tetrastigma hemsleyanum Diels et. Gilg的干燥块根。
2 样品的提取与制备
2. 1 样品Ⅰ的提取
将三叶青药材 20 kg 粉碎后，加体积分数 95%
乙醇回流提取 3 次，每次 1 h，体积分数 60%乙醇回
流提取 3 次，每次 1 h，合并提取液，过滤，减压浓缩
得乙醇浸膏，用少量水将上述浸膏分散，用三氯甲烷
萃取，回收溶剂后，得到样品Ⅰ62. 1 g。
2. 2 样品Ⅱ的制备
取三叶青药材 1 kg，粉碎后，照“2. 1”项下方
法提取，回收三氯甲烷，得到浸膏 29. 4 mg。取上
述浸膏适量，加三氯甲烷溶解成 3 mg·mL － 1的
溶液，即得。
3 经典柱色谱分离方法
将样品Ⅰ经硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯(20∶
1 ～ 1∶ 10)梯度洗脱，收集各部分洗脱液，经薄层色
谱检识，合并为 8 个组分(Fr1 ～ Fr8)。其中，Fr1 经
硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯(10∶ 1 ～ 1∶ 10)洗脱得
到化合物 1(264 mg) ，2(14 mg) ，3(20 mg) ，Fr3 经
硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯(10∶ 1 ～ 1∶ 10)洗脱，
再经 Sephadex LH －20 凝胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇
(200∶ 1 ～ 60∶ 1)反复洗脱，得化合物 4(13 mg) ，5(10
mg) ，6(18 mg)。
4 GC-MS测试
色谱条件:Thermo TＲACE TＲ-WAXMS 毛细管
色谱柱(30. 0 m ×0. 25 mm，液膜厚度 0. 25 μm) ，分
流比 20∶ 1，气化温度 250 ℃，接口温度 240 ℃，程序
升温(起始温度 140 ℃，保持 2 min，以 3 ℃·min －1
升至 220 ℃，保持 10 min) ;载气为氦气，流速 1. 0
mL·min －1。质谱条件为 EI 源电子能量 70 eV;离
子源温度 240 ℃;扫描范围 50 ～ 650 amu。
5 结构鉴定
5. 1 经典柱色谱鉴定结果
化合物 1:白色针晶(石油醚-乙酸乙酯) ，mp
137 ～ 140 ℃。Liebermann-Burchard 反应阳性。在
不同展开系统下展开，10%硫酸乙醇溶液显色，斑点
颜色、Ｒ f与对照品 β-谷甾醇一致，确定该化合物为 β-
谷甾醇。
化合物 2:白色粉末(甲醇) ，mp 80 ～ 82 ℃。EI-
MS m/z 168［M +］。1 H-NMＲ(500 MHz，CDCl3)δ:
7. 41(1H，d，J = 8. 5 Hz，H-6) ，7. 40(1H，s，H-2) ，
6. 84(1H，d，J = 8. 5 Hz，H-5) ，3. 89(3H，s，OCH3)。
13C-NMＲ(125 MHz，CDCl3)δ:142. 6(C-1) ，123. 2
(C-2) ，151. 6(C-3) ，147. 5(C-4) ，115. 5(C-5) ，
113. 1(C-6) ，56. 4(OCH3) ，168. 1(C = O)。以上波
谱数据与文献［4］报道的数据一致，故鉴定化合物 2
为 4-羟基-3-甲氧基苯甲醛。
化合物 3:无色针晶(石油醚-乙酸乙酯) ，mp
303 ～ 305 ℃。EI-MS m/z 456［M +］。1H-NMＲ(400
MHz，CDCl3)δ:0. 70(3H，s，H-24) ，0. 73(3H，s，H-
30) ，0. 90(3H，s，H-27) ，0. 92(3H，s，H-25) ，0. 95
(3H，s，H-26) ，0. 98(3H，s，H-29) ，1. 12(3H，s，H-
23) ，3. 19(1H，m，H-3) ，5. 20(1H，s，H-12)。13 C-
NMＲ(100 MHz，CDCl3)δ:37. 5(C-1) ，27. 0(C-2) ，
81. 3(C-3) ，39. 0(C-4) ，56. 1(C-5) ，16. 8(C-6) ，
32. 2(C-7) ，40. 1(C-8) ，48. 0(C-9) ，37. 3(C-10) ，
22. 6(C-11) ，123. 2(C-12) ，144. 7(C-13) ，42. 3(C-
14) ，27. 8(C-15) ，23. 5(C-16) ，46. 7(C-17) ，41. 2
(C-18) ，46. 6(C-19) ，2 32. 0(C-20) ，33. 7(C-21) ，
31. 4(C-22) ，26. 5(C-23) ，16. 0(C-24) ，15. 1(C-
25) ，18. 2(C-26) ，27. 3(C-27) ，180. 8(C-28) ，33. 0
(C-29) ，33. 0(C-30)。以上波谱数据与文献［5］报
道的数据一致，故鉴定化合物 3 为齐墩果酸。
化合物 4:淡黄色油状物(石油醚-乙酸乙酯)。
EI-MS m/z 126［M +］。1H-NMＲ(400 MHz，CDCl3)δ:
7. 22(1H，d，J = 3. 6 Hz，H-3) ，6. 50(1H，d，J = 3. 6
Hz，H-4) ，4. 70(2H，s，H-6) ，9. 56(1H，s，CHO)。13C-
NMＲ(100 MHz，CDCl3)δ:150. 5(C-2) ，121. 3(C-
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3) ，109. 0(C-4) ，158. 1(C-5) ，56. 8(CH2OH) ，177. 5
(CHO)。以上波谱数据与文献［6］报道的数据一
致，故鉴定化合物 4 为羟甲基糠醛。
化合物 5:淡黄色粉末(石油醚-乙酸乙酯) ，mp
104 ～ 106 ℃。EI-MS m/z 188［M +］。1 H-NMＲ(500
MHz，DMSO-d6)δ:2. 18 (4H，t，H-2，H-8) ，1. 47
(4H，t，H-3，H-7) ，1. 25(6H，s，H-4，H-5，H-6)。13 C-
NMＲ(125 MHz，DMSO-d6)δ:174. 0(C-1，C-9) ，33. 3
(C-2，C-8) ，28. 1(C-4，C-5，C-6) ，24. 4(C-3，C-7)。
以上波谱数据与文献［7］报道的数据一致，故鉴定
化合物 5 为壬二酸。
化合物 6:白色粉末(乙酸乙酯) ，mp 207 ～ 209
℃。EI-MS m/z 168［M +］。1 H-NMＲ(500 MHz，DM-
SO-d6)δ:7. 41(1H，d，J = 2. 0 Hz，H-2) ，7. 42(1H，
dd，J = 8. 2 Hz，H-6) ，6. 83(1H，dd，J = 8. 0，3. 0 Hz，
H-5) ，9. 82(1H，s，4-OH) ，12. 47(1H，s，COOH) ，
3. 80(3H，s，OCH3)。
13 C-NMＲ(125 MHz，DMSO-d6)
δ:121. 6(C-1) ，112. 9(C-2) ，147. 0(C-3) ，151. 2
(C-4) ，115. 2(C-5) ，123. 6(C-6) ，55. 6(OCH3) ，
167. 0(COOH)。以上波谱数据与文献［8］报道的数
据一致，故鉴定化合物 6 为香草酸。
5. 2 GC-MS分析结果
采用 GC-MS 从样品Ⅱ中分离出 91 个峰，通过
Thermo Xcalibur工作站检索 NIST标准质谱图库，同
时结合文献解析，指认出 22 个化合物。按峰面积归
一化法进行计算，求出各化学成分的相对百分含量，
见表 1 和图 1。
6 抗肿瘤活性测定
收集对数生长期人宫颈癌细胞 Hela229 和人恶
性黑色素瘤细胞 A375 分别培养在含 10%(体积分
数)灭活新生小牛血清 ＲPMI-1640 培养液中，用
0. 25%的胰蛋白酶消化后，分别配成 3. 3 × 104个·
mL －1的细胞悬液接种于 96 孔培养板中，每孔加细
胞悬液 150 μL;培养 24 h后，除去培养液，取化合物
1 ～ 7 用 10%(体积分数)DMSO配成的药液，质量浓
度分别为 5、10、25、50、75、100 μg·mL －1，每孔 200
μL，每个浓度设 3 个复孔，同时设空白对照，阳性对
照(5-氟脲嘧啶) ，在 37 ℃、5% CO2、饱湿条件下培
养 48 h后，每孔加入 5 g·L －1 MTT 20 μL，培养 4 h
后，弃去上清液，加入 150 μL DMSO 震荡 10 min，
570 nm波长下测定 A 值。按下式计算药物对肿瘤
细胞生长的抑制率。
肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1 －实验组平均
A值 /对照组平均 A值)100%
结果表明，化合物 1 和 3 对 Hela229 细胞有较
强的细胞毒活性，IC50分别为 40. 78，25. 69 μg·
mL －1。化合物3对A375细胞有较强的细胞毒活
表 1 三叶青三氯甲烷提取物中 22 个化合物及相对含量
Tab. 1 The 22 compounds and relative contents of the chloroform extract of Tetrastigmatis hemsleyani
No. Ｒetention time /min Compounds Molecular formula Ｒelative molecular weight Ｒelative amount /%
1 9. 86 (2E，5Z)-14-Methyl-2，15-octadecadien-1-ol C19H36O 280 0. 12
2 10. 99 10，12，14-Nonacosatriynoic acid C29H46O2 426 0. 18
3 14. 81 2，6，10-Trimethyltetradecane C17H36 240 0. 40
4 16. 18 Octadecanoic acid C18H36O2 284 9. 54
5 17. 62 2，4-Bis(1，1-dimethylethyl)-phenol C14H22O 206 0. 11
6 18. 87 Ethyl 14-methyl-hexadecanoate C19H38O2 298 0. 25
7 19. 24 Ethyl hydrogen succinate C6H10O4 146 1. 23
8 21. 58 Eicosanoic acid C20H40O2 312 0. 93
9 22. 04 6-Octadecenoic acid C18H34O2 282 5. 06
10 22. 25 9-Octadecenoic acid(9Z)-，2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl ester C21H40O4 356 0. 83
11 22. 72 (8Z)-7-Methyl-8-tetradecenyl acetate C17H32O2 268 0. 68
12 23. 26 9-Cis，11-trans-Octadecadienoic methyl ester C19H34O2 294 23. 88
13 24. 66 2-Cyclohexylpiperidine C11H21N 167 0. 50
14 24. 94 Methyl 9，12，15-octadecatrienoate C20H34O2 306 3. 72
15 27. 20 1，2-Benzenedicarboxylate，decyl octyl ester C16H32O2 256 0. 62
16 33. 48 13-Methyl-tetradecanoic acid，methyl ester C23H38O4 378 13. 26
17 40. 44 Cis-6，9，12，15-docosatetraenoicacid，methyl ester C23H38O2 346 1. 05
18 43. 26 Ethyl palmitate C18H36O2 284 0. 98
19 44. 93 n-Propyl 11-octadecenoate C21H40O2 324 3. 70
20 48. 55 Ethyl 9，12-hexadecadienoate C18H32O2 280 15. 71
21 54. 02 Cis-4，7，10，13，16，19-Doconexent C22H32O2 328 1. 89
22 64. 67 14，15β-Epoxy-3β，11α-dihydroxy-5β-bufa-20，22-dienolide C24H32O5 400 0. 23
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图 1 三叶青三氯甲烷提取物总离子流图
Fig. 1 The total ion chromatograms of the chloroform extract
constituents of Tetrastigmatis hemsleyani
性，IC50为 69. 87 μg·mL
－1。化合物 5 对 Hela229
细胞 和 A375 细 胞 的 IC50 分 别 为 158. 71 和
168. 11 μg·mL － 1，显示出较弱的细胞毒活性。
而化合物 2、6 对两种肿瘤细胞几乎没有体外细
胞毒作用。
7 讨 论
目前，三叶青在浙江民间常被用于肿瘤的治疗，
前期实验表明，三叶青粗提物在体内外有抗肿瘤作
用［3，9］。本实验对三叶青的抗肿瘤活性部位进行全
面的化学成分研究，探明其中具有较强体外肿瘤抑
制作用的化学成分主要为齐墩果酸，β-谷甾醇、5-羟
甲基糠醛和壬二酸对 Hela229 细胞或 A375 细胞也
有一定的抑制作用。三叶青三氯甲烷部位有大量弱
极性的化合物，为全面研究其化学成分，我们对其进
行 GC-MS分析，发现该部位的物质多为有机酸及其
酯类。脂肪酸的抗肿瘤作用已有报道［10-12］，结合经
典柱色谱分离所得成分的抗肿瘤活性实验，本课题
组认为，三叶青三氯甲烷部位的体外抗肿瘤活性由
多种成分共同作用产生。
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