全 文 ：中高温曲对“陈味”的主要贡献,应是曲中微生物产生的酸
性蛋白酶对原料蛋白质的有效利用。
2.2 发酵条件
发酵条件是“陈味”酒产生的重要作用。较高的入窖发酵
温度,较长的发酵期是“陈味”酒形成必不可少的重要条件。每
年的五月份、六月份及压池度夏后的九月份、十月份往往多产
“陈味”酒。
宜宾地区的许多酒厂,在夏天坚持生产。入窖、发酵温度
都较高,并且发酵期一般在70d以上,产酒“陈味”很浓。相反,
在气温较低的季节“陈味”不突出。
2.3 量质摘酒
有些酿酒厂家用中高温曲,多粮酿酒多年,就是不产“陈
味”酒。原因是多方面的,但摘酒不当就是原因之一。浓郁的
“陈味”酒,只占酒体的很少一部分。只有严格分层出窖、分层
蒸馏,量质摘酒,才有可能摘取出来。
窖底糟经过滴窖后,清蒸效果更好。清蒸与混蒸相比,酒醅
数量可增加1/3,同样一甑产酒多、酒度高。醇溶性的香味成份
更容易得到富集,而呈现浓郁幽雅的“陈味”。但摘酒时,不可贪
多。“陈味”物质的呈现有一定的数量和比例关系,若摘取过多,
则会被冲淡或比例关系不恰当,就不再有明显的“陈味”了。
2.4 长期贮存
不带“陈味”的酒,再贮存也不会出现“陈味”。而带“陈味”
的酒,越贮存则“陈味”越浓郁,越成熟。因此上好的“陈味”酒
才越有贮存价值。
3 小结
3.1 香味俱佳的“陈味”酒的出现,对我们扳倒井及山东酒行
业是个极大的精神鼓舞,打破了业界认为北方难产“陈味”酒
的思维定式。
3.2“陈味”酒不只在多粮酿造中出现,在单粮酿造中也出
现,与菌种、发酵条件关系密切,应加强研究。
3.3“陈味”的物质类群认识还很模糊,工艺定型也难,但潜
力很大,达到 10%以上是完全可能的,其关键因素有待于我
们进一步探讨。
第35卷 第2期
2008年 3月
酿 酒
LIQUOR MAKING
Vol.35.№.2
Sept.,2008
文章编号:1002-8110(2008)02-0067-04
自溶-碱法提取啤酒酵母β-(1,3)-D
葡聚糖工艺研究
李 骥,孟小林
(武汉大学生命科学学院, 湖北 430072)
摘 要:通过单因素和正交实验得出自溶-碱法提取啤酒酵母 β-(1,3)-D葡聚糖的最佳工艺条件为:定量酵
母粉,以料液比 1∶30加入 3%NaCl水溶液,40℃水浴 24h;4000r/min离心去上清,以料液比 1∶30加入 2%
NaOH水溶液,95℃水浴提取3h,4000r/min离心去上清,蒸馏水洗两次,60℃烘干,得成品。
关键词:酵母;β-(1,3)-D葡聚糖;提取;自溶-碱法
中图分类号:TS262.5;Ts261.11;TS261.9 文献标识码:A
Researchtheprocessofautolysis-alkalineprocessextracting
beeryeastβ-(1,3)-Ddextran
LIJi,MENGXiao-lin
(1.ColegeofLifeScience,WuhanUniversity,Wuhan430072,China;
2.ColegeofLinghtTextileandFoodScience,SichuanUniversity,Chengdu610065,China)
Abstract:Thewaywasbythesinglefactorandorthogonalexperimentsmadesurethattheautolysis-alkalineprocessoptimumconditionsof
extractingβ-(1,3)-Ddextran:Quantitativeyeast,3%NaClsolutionwaspouredintocertainyeastpowderwitha1:30ratio,andwaterbath
under40℃for24h.Aftercentrifugalizationataspeedof4000r/min,3%NaOHsolutionwaspouredintowitha1:30ratio,andwaterbathfor3h
under95℃folowedbycentrifugalizationoncemore.Afterwashedtwiceanddriedunder60℃,thefinalproductwasatained.
Keywords:yeast;β-(1,3)-Ddextran;extraction;autolysis-alkalineprocess
收稿日期:2007-11-26
作者简介:李 骥(1976-)男,四川射洪人,工程硕士,研究方向:基因
工程药物及昆虫病毒分子生物学。
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50
40
30
20
得
率
/%
0% 1% 2% 3% 47% 5%
60
50
40
30
20
NaOH质量体积分数
葡
聚
糖
含
量
/%
得率/%
多糖含量/%
▲
■
据统计,2006年我国啤酒工业年产啤酒约 3000万吨,按
每生产 1吨啤酒可回收废酵母 1～1.5kg计,每年能回收废酵
母3万～4.5万吨。这是一种量大集中、营养丰富的可再生资
源。目前,国内大多数啤酒厂除将小部分酵母泥留作种子外,
大部分连同其中残留的啤酒直接排放掉,严重污染环境(酵母
泥的 BOD和 COD均高达 105mg/L以上)。因此,废酵母这种
生物资源的再利用应该引起重视。
在酵母细胞中,水约占75%～85%,干物质约占 15%～
25%。在干物质中蛋白质为 45%～55%,脂肪 3%～7%,主要
是磷脂、固醇和不饱和脂肪酸,核酸约占 6%,以及灰分约 8%
和大量糖类(约30%)[1]。
酵母细胞壁含有碱不溶性、酸溶性、碱溶性三种葡聚糖。
其中碱不溶性葡聚糖是高分支的 β-(1,3)-D葡聚糖,重合度
(DP)1450～1500,有3%的 β-(1,6)链间连接。酵母的 β-(1,3)
-D葡聚糖能增强哺乳动物免疫活力,有抗癌、抗细菌、抗病
毒、降低血脂等功能。同时还有保湿、成膜、无刺激性等特点,
故广泛用于医药、食品、化妆品等行业[2]。
本文采用较为简单、环保的提取酵母葡聚糖的有效方
法——自溶-碱法[3,4],通过、单因素和正交实验确定提取最佳
工艺条件,以期获得高纯度 β-葡聚糖产品。
1 实验材料及方法
1.1 主要原材料
实验用的主要原材料有酵母粉:市售饲料用啤酒酵母粉;
分析纯试剂:葡萄糖、硫酸、乙醇、氢氧化钠、苯酚、盐酸、苯胺
等。
1.2 主要仪器
实验用的主要仪器:分光光度计,UV-120-02,日本岛津株
式会社;分析天平,AB104-N,Metler-Toledo Group梅特勒-
托利多仪器(上海)有限公司;恒温水浴锅,离心沉淀机等。
1.3 自溶-碱法提取酵母 β-1,3-D-葡聚糖
1.3.1 实验原理
利用在碱性条件下,酵母细胞壁大量存在的 N-糖苷键、
蛋白质中的酰胺键和GPI残基都是不稳定的,尽管 O-糖苷
键不易断裂,但是甘露聚糖、蛋白质却以甘露聚糖、甘露聚
糖-肽、肽或氨基酸等的形式溶入碱溶液中,从而得到高纯度
的碱不溶性 β-1,3-D-葡聚糖。
1.3.2 实验方法
配制 1.0mol/L氢氧化钠溶液 100mL,加入酵母粉 5g,在
90℃下反应3h。3000r/min离心15min,沉淀物水洗2次,然后
用无水乙醇洗涤,无水乙醚脱水,-0.1Mpa/50℃条件下真空
干燥至恒重即得产品。
1.4 β-1,3-D-葡聚糖糖含量检测:苯酚-硫酸法[5]
1.4.1 样品处理
称取混合均匀的多糖样品(M)0.0200g,置于 100mL容量
瓶中,加入 50%硫酸溶液 5mL,60℃水浴 30min,过程中需摇
瓶数次,使瓶壁附着样品洗下充分水解后;待多糖样品充分水
解溶解后,以蒸馏水定容到 100mL(V1),旋转混匀器混匀。此
溶液为样品测定液。
1.4.2 样品测定
准确吸取样品测定溶液 1mL(V2)于 25mL比色管中,加
入2mL9%苯酚溶液,旋转混匀器混匀;小心加入 10mL50%硫
酸溶液,旋转混匀器小心混匀,沸水浴中煮沸 15min,冷却至
室温用后分光光度计在 490nm波长处,以试剂空白为参比,
1cm比色皿测定吸光度值(A)。从葡萄糖标准曲线方程算出
其葡聚糖质量(m),再计算样品中葡聚糖含量。
1.4.3 计算公式
X=[m×(V1/V2)/(M×106)]×100%
式中:X—样品葡聚糖含量(以葡萄糖计),%;
m—据标准方程算出测试样中含葡聚糖质量,m=
225.34×A-14.224,μg;
其中A为测定样品溶液吸光度值;
V1—样品测定溶液体积,V1=100mL;
V2—测定用样品测定溶液体积,V2=1mL;
M—样品质量,g
106—1g多糖样品所含 μg数;
上式可简化为:
X=(225.34×A-14.224)/(M×104)×100%
2 结果与讨论
2.1 氢氧化钠浓度对葡聚糖提取效果的影响
分别配制质量体积分数 1%、2%、3%、4%NaOH溶液各
100mL,分别加入酵母粉5g,于水浴锅 80℃下提取 3h,冷却后
4000r/min离心 15min,去上清,沉淀用蒸馏水洗 3次后(每次
水洗都需4000r/min离心15min并去上清液),60℃烘干,得成
品,测产品得率、多糖含量,结果如图1所示:
图1 提取体系NaOH质量体积分数对提取葡聚糖效果影响
由图 1:随着 NaOH含量增加,收得率明显降低,但产品
中葡聚糖纯度在NaOH浓度由1%增加到2%时增长显著,其
后趋于平缓,说明单纯增加NaOH浓度对提取效率无明显效
果;提取体系NaOH质量体积分数可定为2%。
2.2 提取体系固液比对葡聚糖提取效果的影响
由 2.1,将提取体系氢氧化钠浓度暂定为 2%;分别配制
2%氢氧化钠溶液 50mL、100mL、150mL,各加入酵母粉 5g,
于水浴锅 80℃下提取 3h;冷却后 4000r/min离心 15min,去上
清,沉淀用蒸馏水洗 3次后(每次水洗都需 4000r/min离心
15min并去上清液),60℃烘干,得成品,测产品得率、多糖含
量,其结果如图2所示:
第二期 2008酿 酒
· 68·
碱提取次数
产品/g
得率/%
检测称样量/g
检测OD值
葡聚糖含量/%
1
1.6
32
0.0276
0.647
47.7
2
1.4
28
0.0196
0.454
44.9
项 目
产品/g
得率/%
检测称样量/g
检测OD值
葡聚糖含量/%
对 照
1.6
32
0.0276
0.647
47.7
等电点去蛋白质
1.4
28
0.0266
0.638
48.7
得
率
/%
40
35
30
1 2 3 4 5
提取时间/h
60
50
40
得率/%
多糖含量/%
▲
■
葡
聚
糖
含
量
/%
得率/%
多糖含量/%
▲
■
葡
聚
糖
含
量
/%
得
率
/%
40
35
30
25
20
55
50
45
40
1 2 3 4 5
水洗次数
得率/%
多糖含量/%
▲
■
50
40
30
20
0 10 20 30 40
液固比
葡
聚
糖
含
量
/%
60
50
40
30
20
得
率
/%
得率/%
多糖含量/%
▲
■
葡
聚
糖
含
量
/%
50
40
30
20
60 65 70 75 80 85 90 95 100
60
50
40
30
20
温度/℃
得
率
/%
图2 提取体系固液比对提取效率的影响
由图 2,随着提取体系液体比例加大,收得率明显降低,
但葡聚糖纯度却呈先增后降的趋势,可能是提取体系体积过
大,使得水溶性较差的葡聚糖因在体系内未达饱和值而随着
上清液流失,说明在提取体系中,应有提取最佳液固比例;在
正交试验中应考虑固液比因素。
2.3 提取温度对葡聚糖提取效果的影响
配制体积分数2%氢氧化钠溶液 100mL,加入酵母粉 5g,
分别于水浴锅 65℃、80℃、95℃下提取 3h;冷却后 4000r/min
离心 15min,去上清液,沉淀用蒸馏水洗 3遍后(每次水洗都
需4000r/min离心15min并去上清液),60℃烘干,得成品,测
产品得率、多糖含量,其结果如图3所示:
图3 提取体系温度对葡聚糖提取效果的影响
由图 3,随着提取体系温度升高,收得率先明显降低,其
后趋于平缓;其葡聚糖糖纯度呈先增后降的趋势,其原因不排
除高温下葡聚糖在碱性条件下水解为可溶性葡萄糖的可能
性,说明提取体系存在最佳提取温度;在正交试验中应考虑提
取温度因素。
2.4 提取时间对葡聚糖提取效果的影响
配制质量体积分数 2%氢氧化钠溶液 100mL,加入酵母
粉 5g,于水浴锅 80℃分别提取 2h、3h、4h;4000r/min离心
15min,去上清流澈,沉淀用蒸馏水洗 3遍后,60℃烘干,得成
品,测产品得率、多糖含量,其结果如图2.4所示:
图4 提取时间对葡聚糖提取效果的影响
由图 4,随着提取时间延长,收得率略有增加,不明显;其
多糖含量却有较明显提高,说明随着提取时间延长葡聚糖提
取效率会更高(但因考虑工业生产效率及成本,提取时间不能
太长)。
2.5 水洗次数对葡聚糖提取效果的影响
以体积分数2%氢氧化钠溶液 100mL,加入酵母粉 5g,于
80℃下提取 3h;4000r/min离心 15min,去上清,沉淀用蒸馏水
分别水洗 2次、3次、4次后,60℃烘干,得成品,测产品得率、
多糖含量,其结果如图5所示:
图5 提取后水洗次数对葡聚糖提取效果的影响
由图 5,随着水洗次数增加,收得率呈下降趋势;其葡聚
糖含量明显降低,其可能原因为水溶性多糖随着水洗次数增
加,大量流失,故水洗次数不能太多。
2.6 碱提取次数对葡聚糖提取效果的影响
以质量分数2%氢氧化钠溶液 100mL,加入酵母粉 5g,于
80℃下提取3h;4000r/min离心15min,去上清。沉淀用蒸馏水
洗 3次后,60℃烘干,得成品;另一份蒸馏水洗后再次加入
2%氢氧化钠溶液 100mL,于 80℃下提取 3h;4000r/min离心
15min,去上清。沉淀用蒸馏水洗3次后,60℃烘干,得成品;分
别测产品得率、多糖含量,其结果如表1所示:
表1 碱提取次数对葡聚糖提取得率及收得品含量的影响
由表 1,随着碱提取次数增加,收得率与葡聚糖含量均呈
下降趋势,这个结果与(2.5)结果是吻合的,因为 2次碱处理
过程中,水洗次数增加了 3次(第一次碱处理过程结束,水洗
后换碱溶液再提取),其可能原因与水溶性葡聚糖损失有关。
2.7 等电点去蛋白质对葡聚糖提取效果的影响
配制质量体积分数 2%氢氧化钠溶液 100mL,加入酵母
粉 5g,在 80℃下提取 3h后用 HCl调 pH4.5,作用 2h,
4000r/min离心 15min,去上清,沉淀用蒸馏水洗 3遍后,60℃
烘干,得成品。测产品得率、葡聚糖含量,结果如表2所示:
表2 提取过程中用等电点去蛋白质法对葡聚糖提
取得率及收得品含量的影响
李 骥,等:自溶-碱法提取啤酒酵母β-(1,3)-D葡聚糖工艺研究第二期 2008
· 69·
表5 结果及分析
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
收
率
%
葡
聚
糖
含
量
K1
K2
K3
R
K1
K2
K3
R
提取
时间/h
2
2
2
3
3
3
4
4
4
108
100
108
8
120.1
127.5
124.7
7.4
提取
温度/℃
65
80
95
65
80
95
65
80
95
116
104
96
20
121.6
123.4
127.3
5.7
提取
料液比
1∶10
1∶20
1∶30
1∶20
1∶30
1∶10
1∶30
1∶10
1∶20
128
100
88
40
109.4
130.0
132.9
23.5
成品
/g
1.2
0.8
0.7
0.9
0.7
0.9
0.8
1.1
0.8
得率
/%
48
32
28
36
28
36
32
44
32
样品
/g
0.0220
0.0310
0.0280
0.0280
0.0297
0.0238
0.0245
0.0268
0.0224
OD
0.396
0.649
0.602
0.598
0.657
0.480
0.547
0.489
0.505
葡聚糖
含量/%
34.1
42.6
43.4
43.0
45.0
39.5
44.5
35.8
44.4
影响因素:料液比>温度>
提取时间最佳提取条件:
2h,65℃,1∶10
影响因素:料液比>提取
时间>温度最佳提取
条件:3h,95℃,1∶30
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
提取时间/h
2
2
2
3
3
3
4
4
4
提取温度/℃
65
80
95
65
80
95
65
80
95
提取料液比
1∶10
1∶20
1∶30
1∶20
1∶30
1∶10
1∶30
1∶10
1∶20
因素 提取时间/h
2
3
4
提取温度/℃
65
80
95
提取料液比
1:10
1:20
1:30
水
平
表4 正交表L9(33)
由表 2,等电点去蛋白质使收得率降低,但其对葡聚糖含
量无明显影响。
2.8 醇洗对葡聚糖提取效果的影响
配制 2%氢氧化钠溶液 100mL,加入酵母粉 5g,在 80℃
下提取3h后,4000r/min离心15min,去上清,沉淀分别用蒸馏
水、70%vol、80%vol、95%vol乙醇水溶液洗两次后,60℃烘
干,得成品。测产品得率、葡聚糖含量,结果如图6所示:
图6 提取后醇洗乙醇浓度对葡聚糖提取效果的影响
由图 6,随着醇洗乙醇浓度加大,收得率明显升高;葡聚
糖含量却明显下降。其中原因可能是因为酵母粉中主要成分
为水溶性物质,其醇溶性较差,随着乙醇浓度加大,此类物质
反而更易保留在提取相中,使得收得率呈上升趋势。由于葡聚
糖有限,随着收得率的增加而使得其在产品中含量降低也是
可以理解的。由于试验目的是得到高纯度葡聚糖产品,故提取
后选用蒸馏水洗为佳。
2.9 多因素多水平正交试验
由上述单因素试验结果可以看出,其中提取时间、提取体
系温度、提取体系料液比例对提取效果影响较大;而提取体系
氢氧化钠浓度、沉淀处理方式(水洗、醇洗及水洗次数)等因素
对提取效果影响不大。遂以提取时间、提取体系温度及提取体
系料液比等三因素作正交试验,其因素水平表见表3:
提取体系固定因素:2%氢氧化钠溶液;沉淀蒸馏水水洗
次数:2次。
表3 正交因素水平表
因试验目的是得到高纯度的葡聚糖产品,故上表中葡聚
糖提取最佳条件为:配制 2%氢氧化钠溶液 150mL,加入酵母
粉5g,在95℃下提取3h后,4000r/min离心 15min,去上清,沉
淀分别用蒸馏水洗两次后,60℃烘干,得成品。
2.10 正交实验结果验证
以正交结果(葡聚糖含量)及最初设定条件作提取对照:
2.10.11g酵母粉,30mL2%NaOH溶液,95℃提取3h,4000r/min离
心,沉淀蒸馏水洗两次,4000r/min离心15min,沉淀60℃烘干
(正交结果)。
2.10.2 1g酵母粉,30mL2%NaOH溶液,80℃提取3h,
4000r/min离心,沉淀蒸馏水洗两次,4000r/min离心 15min,沉
淀60℃烘干(因在单因素试验中,80℃为最佳提取温度)。
2.10.31g酵母粉,20mL2%NaOH溶液,80℃提取3h,4000r/min
离心,沉淀蒸馏水洗两次,4000r/min离心,沉淀 60℃烘干(最
初设定条件,主要为文献数据)。结果如表6所示:
表6 验证试验结果
由表6,正交结果收率偏低,但葡聚糖纯度是最高的。
3 结论
自溶 -碱法提取 β-(1,3)-D葡聚糖的最佳工艺条件:
NaOH浓度 2%,料液比 1:30,提取温度 95℃,提取时间
3h,4000r/min离心15min,去上清,蒸馏水洗2次,60℃烘干,得
成品。用自溶-碱法提取酵母细胞壁β-1,3-D-葡聚糖,所得
产品中去除了蛋白质和甘露聚糖成分,且葡聚糖得率高。所以,
碱提取法是从酵母中提取β-1,3-D-葡聚糖的高效方法。
[参考文献]
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016～018.
编号
原料/g
成品/g
得率/%
检测称样量/g
检测OD值
葡聚糖含量/%
1
0.9955
0.3057
30.7
0.0216
0.439
39.2
2
0.9983
0.4573
45.8
0.0281
0.482
33.6
3
0.9653
0.3962
41
0.0333
0.601
36.4
第二期 2008酿 酒
· 70·
60
55
50
45
40
35
30
50
45
40
35
30
0 20 40 60 80 100
乙醇浓度/%
得率/%
多糖含量/%
▲
■
葡
聚
糖
含
量
/%
得
率
/%