全 文 ：— 10 — 现代中药研究与实践2012年第26卷第2期Chin Med J Res Prac,2012 Mar.,Vol.26 No.2
2 药用植物及制剂外经贸绿色行业标准的要求。
9 标志、包装、运输与贮存
9.1 标志及包装
包装标志应符合 GB/T 191 的要求。包装规格按
每件 25 kg或 50 kg，或按客户要求进行，用洁净、
干燥、无污染、符合国家有关卫生要求的编织袋包裹
捆压成件，每件包装物上应标明品名、产地、规格、
毛重等。
9.2 运输与贮藏
运输工具应清洁、干燥、无异味、无污染。严
禁与可能污染其品质的货物如农药、化肥等有毒有
害物质混装。产品应放在清洁、干燥、通风处或专门
仓库室温下贮藏。仓贮应具备透风除湿设备及条件，
货堆与墙壁的距离不得少于 50 cm，离地 10 cm。库
房应有专人管理，防潮防霉变。
10 生产记录
按国家药品监督管理局令（2002 年）第 32号《中
药材生产质量管理规范（试行）》中 “第九章 文件管
理 ”相关规定执行。
参考文献
[1] 国家药典委员会．《中国药典》一部 [S]．北京：中国医药科技出版社，
2010 ：180.
正交法优化三叶青继代增殖与生根培养的条件
彭 昕，林言娜，何军邀，凌庆枝
（浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100）
摘要：目的 探究三叶青的组培快繁技术。方法 通过正交试验对三叶青的腋芽增殖、生根培养条件
进行优化，得出三叶青的快速繁殖的最适培养基。结果 在MS培养基上附加 2 mg•L-16-BA+0.5 mg•L-1ZT+1
mg•L-1IBA时芽的增殖效果最好；而在 1/2MS培养基上附加 1.0 mg•L-1IBA+20 g•L-1蔗糖时，生根效果最佳。
结论 通过腋芽增殖快繁育苗技术可获得完整植株，达到快速繁殖的目的。
关键词：三叶青；正交试验；继代增殖；生根培养
中图分类号：S567.23+9 文献标识码：A 文章编号：1673-6427(2012)02-0010-04
Optimization of Subculture and Root Induction Technique of Tetrastigma hemsleyanum
by Orthogonal Design
PENG Xin, LIN Yan-na, HE Jun-yao, LIN Qing-zhi
(Zhejiang Pharmaceutical College, Ningbo 315100, China)
Abstract Objective To set up tissue culture and rapid propagation of Tetrastigma hemsleyanum.
Methods The orthogonal experiment was designed to screen the optimum culture medium for buds propagation
and root induction of Tetrastigma hemsleyanum. Results The optimal buds propagation culture medium of
Tetrastigma hemsleyanum was MS+2 mg•L-1 6-BA+0.5 mg•L-1 ZT+1 mg•L-1 IBA, and the optimal rooting
culture medium was 1/2 MS+1.0 mg•L-1 IBA+20 g•L-1 sucrose. Conclusion Tetrastigma hemsleyanum can be
regenerated integratedy and breeded fastly by using axillary bud proliferation technology.
Key words: Tetrastigma hemsleyanum; orthogonal experiment; subculture; root induction
收稿日期：2011-09-17
基金项目： 浙江省新苗人才计划项目（ZJPCKJCX201006）；浙江医药高等
专科学校校级科研项目(ZPCSR2010003）
作者简介：彭昕，讲师，硕士，主要研究方向：生物制药技术，TEL:
（0574）88223161，E-mail:pengx@mail.zjpc.net.cn
三叶青 (Tetrastigma hemsleyanum)又名金钱吊葫
芦，是葡萄科多年生蔓生藤本植物，以块根或全草入
药，是我国独有的珍贵物种。其主要活性成份黄酮可
用于治疗高热、扁桃体炎、肝炎、风湿性关节炎及
病毒性脑膜炎等多种疾病 ,也是抗肿瘤常用药物 [1,2]。
三叶青对生长环境的要求非常苛刻，近年来，随着
自然环境恶化以及人们无序的采挖，致使野生三叶青
资源已濒临灭绝，因此，有必要探讨应用组织培养进
行快速繁殖的研究。目前，三叶青组织快繁的研究已
有少数文献报道 [3,4]。但都是以单因素水平来设计的，
无法准确了解多因素的相互作用，且芽苗增殖倍数不
高。本研究设计了多因素正交试验，研究不同因素对
三叶青茎段腋芽增殖和生根培养的影响，从中筛选适
宜的培养基，为三叶青的快速繁殖提供理论和技术上
的帮助。
1 材料与方法
DOI:10.13728/j.1673-6427.2012.02.007
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1.1 材料
实验材料采自浙江省丽水市，经安徽师范大学
生命科学学院周守标教授鉴定为三叶青（Tetrastigma
hemsleyanum）。
1.2 方法
1.2.1 材料处理及初代培养　选取生长良好的三叶
青植株幼嫩带芽茎段，自来水冲洗 2 h，8%次氯酸
钠消毒 5 min，再用 0.1%HgCl2溶液消毒 5 min,然
后用无菌水冲洗 8次，无菌滤纸吸干水分，切成
1.5~2.0 cm2的小块，接种在诱导培养基 (MS+0.5 mg•
L-1IBA+2.0 mg•L-16-BA+3%蔗糖 +0.8%琼脂，pH 5.8)
上，(26±2)℃培养，光照强度 2 000 lx，光照周期 12
h/d，进行初代培养。
1.2.2 继代增殖培养　将初代培养形成的芽苗切段
移入不同增殖培养基，30 d后转接 1次，60 d后统计
各处理的增殖系数，每个处理接种 20个外植体，重
复 3次。
1.2.3 生根培养　将生长良好、植株健壮、株高 2~3
cm的三叶青芽苗接入不同生根培养基中，每个处理
接种 10瓶，每瓶接种芽 2个，接种 30 d后，统计平
均根数。
1.2.4 统计分析 本研究中正交设计及所有数据的
统计分析均使用正交设计助手Ⅱ V3.1软件。
2 结果与分析
2.1 不同激素浓度对继代增殖的影响
将初代培养后诱导萌发的三叶青芽苗切段移入
增殖培养基 ,前 30 d增殖系数较低 , 培养 30 d转接
1次后增殖系数明显增大 , 60 d后统计各处理的增殖
系数。正交实验方案及统计结果见表 1，正交试验结
果分析见表 2。从中可以看出不同激素浓度对芽苗
继代增殖影响的极差 R顺序为：6-BA > IBA >ZT，
其中 6-BA和 IBA浓度对增殖系数均有显著影响
(P<0.05)，促进芽增殖的最佳处理组合是 A1B2C3，通
过实验验证得知此培养基对继代培养诱导丛生芽较
好，其出芽率为 100%，且芽数量较多，增殖系数为
9±1.6，芽长而粗壮，见图 1。因此，对芽苗继代增
殖的适宜培养基组合为 2 mg•L-16-BA+0.5 mg•L-1ZT+1
mg•L-1IBA。
2.2 不同培养基组成对生根培养的影响
将诱导的丛生芽切割成单芽，分别转接到表 3
各培养基中，10 d可见大多数无根小苗的基部出现乳
白色根突起，形态上无显著差别，均为棕色、细长、
密布白色根毛的大量侧根，但平均生根条数有明显区
别，少数培养基上的小苗基部产生大量的愈伤组织，
没有根的生长和分化，并且芽上叶片有发黄凋谢的现
象。培养 30 d后的统计结果见表 3。正交试验结果分
析见表 4。可见各因素对生根影响的极差 R顺序为：
基础培养基 >IBA>糖，其中基础培养基对愈伤组织
生长有显著影响 (P<0.05)，促进根生长的最佳处理组
合是A2B2C2，即 1/2MS +1.0 mg•L-1IBA+20g•L-1蔗糖。
通过实验验证得知该培养基能使根早生快发，根粗而
多，根系发达，主根粗壮，侧根发达，且芽苗生长健
壮，叶色浓绿，生长整齐一致（图 2）。
3 讨论
激素对植物组织和细胞的增殖、分化以及芽和
根的诱导与形成等起着关键的作用。本实验不同阶段
培养基中外源性激素的种类和浓度配比事先均做过系
统考察，正交试验激素质量浓度是在单因素的基础上
表1 不同激素浓度对芽苗继代增殖系数的影响
Tab.1 The effects of different hormones concentration on proliferation
实验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
6-8A
2
2
2
3
3
3
4
4
4
ZT
0
0.5
1
0
0.5
1
0
0.5
1
IBA
0.2
0.5
1
0.5
1
0.2
1
0.2
0.5
误差项
1
2
3
3
1
2
2
3
1
增殖系数
4.8
6
7.2
4.5
7.8
2.7
3.4
1.5
1.2
注：表格中激素浓度单位均为 mg•L-1，以下表格同
表2 不同激素浓度对继代增殖系数的影响的方差分析
Tab.2 ANOVA of the effects of different hormones concentration on
proliferation
方差来源
6-BA
ZT
IBA
误差
S2
25.54
3.00
15.62
0.14
F
51.5
6.0
31.5
注：F0.05=19， df=2
芽增殖系数
图1 经优化后的继代培养基诱导的丛生芽
Fig.1 Cluster Shoots induced by optimized medium
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表4 不同培养基组成对生根培养的影响的方差分析
Tab.4 ANOVA of the effects of different medium on root induction
方差来源
基础培养基
糖
IBA
误差
S2
38.62
0.30
7.72
1.90
F
20.2
0.16
4.04
注：F0.05=19， df=2
平均生根数
表3 不同培养基组成对生根培养的影响
Tab.3 The effects of different medium on root induction
实验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
培养基
MS
MS
MS
1/2MS
1/2MS
1/2MS
1/4MS
1/4MS
1/4MS
蔗糖浓度
10
20
30
10
20
30
10
20
30
IBA
0.5
1
2
1
2
0.5
2
0.5
1
误差项
1
2
3
3
1
2
2
3
1
平均生根数
0
1.2
0.5
7
6.3
3.6
2.4
2
4.2
注：蔗糖浓度为 g•L-1
图2 经优化后的生根培养基诱导后的芽苗
Fig.2 Roots induced by optimized medium
选取效果较好的激素质量浓度进行设计。前期试验发
现 IBA是最有利于三叶青愈伤组织分化、腋芽增殖和
生根的外源性生长素，且愈伤及芽苗的褐化最轻，而
其它生长素更有利于愈伤组织的生长而限制器官的分
化，故本实验采用 IBA作为外源性生长素。对 IBA浓
度的测试，结果显示 IBA浓度过低，在切口处会产生
大量的愈伤组织，阻碍了芽的生长和分化，不利于增
殖培养；IBA浓度适当提高能促进芽的生长，但浓度
大于 1 mg•L-1时，芽的增殖系数明显下降。对 6-BA
浓度的测试显示，随着其浓度的升高，试管苗的增殖
率提高，当超过一定浓度后，增殖率开始下降。这可
能是由于细胞分裂素浓度高，促进茎段上的愈伤组织
过度生长，从而抑制了芽的分化；ZT浓度增加，诱
导率呈升高趋势，增殖倍数也呈现升高趋势，但当质
量浓度升高超过 1 mg•L-1后，诱导出的丛生芽成簇状
生长，芽较密集，芽体多，但都很矮小、生长缓慢，
不易分割到单芽进行下一步的继代增殖培养。这一点
与北五味子快繁体系建立时的结果 [5]相类似。
有研究 [3]认为 6-BA在三叶青的继代培养中的
作用可以忽略不计，MS+NAA0.2 mg•L-1是最佳组合
的继代增殖培养基，利用茎段为外植体时增殖系数为
6.2倍。也有研究 [4]认为三叶青在高浓度的 6-BA培
养基中不定芽生长量较大，有利于三叶青不定芽的继
代，MS+6-BA 2.0 mg•L-1+NAA0.2 mg•L-1是最佳组合
的继代增殖培养基，增殖系数为 5.45倍。本研究通
过多因素正交实验发现 6-BA和 IBA对增殖系数均有
显著影响 (P<0.05)，促进芽增殖的最佳处理组合是 2
mg•L-16-BA+0.5 mg•L-1ZT+1 mg•L-1IBA，增殖系数为
9±1.6，与前述结果类似，但激素组合有区别。出现
不一致的结果可能是由于所用茎段来源不同 ,其遗传
背景和内源激素水平不同所导致；另外，本实验中还
加入了 ZT，改变了细胞分裂素的组成；另外在植物
培养过程中 ,还受许多不可控因素的影响 ,这也是导
致不同研究者得出的结果不一致的一个重要原因。本
研究是在单因素实验基础上采用正交实验，考虑了不
同激素种类和水平的相互影响，因此，筛选出培养基
对三叶青腋芽增殖系数显著高于以往研究结果。
不定根的形成是组织培养过程中一个非常关键
环节 ,它直接影响到组培苗移栽成活率的高低 ,关系
到组织培养成败。组培苗生根，是从异养状态进入自
养状态的一个变化。利用根系来吸收营养和水分是植
物体的一种本能。在培养基中有浓度较高的营养元
素，特别是糖和无机盐能满足的情况下，组培苗产生
依赖性而不易生根，所以一般生根培养基的营养成分
和糖的含量通常要比继代培养的培养基减少一半或
更多。在本研究中也发现采用 1/2MS培养基的生根
率普遍高于MS培养基 ,但采用 1/4MS培养基的生根
率却不及 1/2 MS培养基高，显示无机盐浓度过低也
不利于三叶青幼苗生根。这一点与何首乌组培研究中
的结果 [6]类似。
蔗糖浓度在 10~30 g•L-1范围内对三叶青芽苗生
根的影响不显著，低于 10 g•L-1或高于 30 g•L-1都会
明显抑制芽苗的生长。一般认为，生长素的比率高时
产生根，但也有研究 [7]表明，生长素水平较低，不
足以对根原基产生足够的诱导，但过高浓度也会使生
根受到抑制。本实验采用了 IBA1 mg•L-1浓度诱导生
根 ,在这一浓度下三叶青组培苗根系粗壮 ,侧根发达 ,
IBA浓度降低会使根变细 ,侧根明显减少 , 生根时间
（下转第33页）
— 33 —现代中药研究与实践2012年第26卷第2期Chin Med J Res Prac,2012 Mar.,Vol.26 No.2
成。内皮层由 1列长椭圆形细胞组成，凯氏点明显。
韧皮部狭窄。形成层不甚明显。木质部宽广，导管均
木化，木纤维较多。髓部薄壁 细胞圆形，有髓腔（图2）。
2.3 理化鉴别
供试品粉末 2 g，加无水乙醇 10 mL，加热
回流提取 50 min，放冷，滤过，滤液浓缩至 2 mL，
作为供试品溶液。参照《中国药典》[2]，吸取上述溶
液各 5 μL，点于硅胶 G板上，以石油醚 -乙酸乙酯 -
正丁醇（8:3:0.8）为展开剂。置 365 nm紫外灯下检视，
Rf为 0.30、0.78处有明显的黄色斑点，Rf为 0.85处
有明显的深蓝色斑点。见图 3。
3 讨论
毛裂峰斗菜为民间常用中药，在陕西、青海、
甘肃个别地区用蜂斗菜代替款冬花作药用 [3]。本文从
药材性状、显微特征、理化等方面对毛裂峰斗菜进
图3 毛裂峰斗菜茎叶的TLC图
Fig. 3 TLC analysis of Petasites tricholobu France.
1. Petasites tricholobu France.; 2. Rutin
行了初步研究，为毛裂峰斗菜的鉴别提供科学依据，
为制订毛裂峰斗菜的质量标准提供参考。
参考文献
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[2] 国家药典委员会 .《中国药典》（一部）[S]. 北京 : 中国医药科技出版
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[3] 王秀杰. 款冬花与蜂斗菜的鉴别[J]. 中国药业,2002,11（8）: 65-66.
（上接第 12 页）
延长；而当其浓度超过 2 mg•L-1后，生根数、平均
根长和平均根粗都呈下降趋势，小苗生长也较缓慢，
尤其当达到 4 mg•L-1时，外植体不出现根的分化，在
后期甚至使已萌发的芽枯萎并产生大量愈伤组织。
在杜仲的生根培养 [8]中同样发现类似的现象。因此，
本研究认为，促进根生长的最佳处理组合是 1/2MS
+1.0 mg•L-1IBA+20 g•L-1蔗糖。
本研究用正交设计法安排多因素多水平的试
验，初步筛选出适于三叶青腋芽增殖和诱导生根的培
养基，这为三叶青组培试验提供了参考数据，为大量
繁殖种苗提供了技术支持。当然，影响快繁育苗的因
素还有很多，有待于进一步的研究。
参考文献
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