全 文 ：［收稿日期］ 20120222(010)
［基金项目］ 浙江省教育厅 2010 年度科研项目(Y201019049)
［通讯作者］ * 丁丽，硕士，讲师，从事中药药效物质基础及中药药理研究，Tel:0574-88221493，E-mail:nbncdl@ 163． com
三叶青水提物及其含药血清对人胃腺癌细胞株的抑制作用
丁丽 * ，纪其雄，李鸿文
(浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100)
［摘要］ 目的:考察三叶青水提物及其含药血清对人胃腺癌细胞 AGS 体外增殖的影响。方法:清洁级小鼠随机分为 5
组:三叶青水提物高、中、低(20，10，5 g·kg － 1)剂量组、环磷酰胺阳性对照(CTX，5 g·kg － 1)组及阴性对照组(蒸馏水)。各组
均 ig 给药，每次 20 mL·kg － 1，每天 2 次，连续给药 3 d，最后 1 次给药后 1 h 断头取血，4 ℃静置 4 h，3 000 r·min － 1离心 20 min，
分离血清，56 ℃灭活 30 min 后，用 0. 22 μm 的滤膜过滤除菌，－ 20 ℃保存备用。对数生长期的 AGS 细胞经 0. 25%胰蛋白酶
消化后，配成 2. 5 × 104 / L 的细胞悬液接种于 96 孔培养板，培养 24 h 后，加入不同浓度的三叶青水提物溶液及其含药血清，作
用 48 h 后，采用 MTT 比色法在 570 nm 波长下测定 A，观察不同浓度三叶青水提物及其含药血清对 AGS 细胞的抑制作用。结
果:1 ～ 40 g·L － 1三叶青水提物对 AGS 细胞有显著的抑制作用(P ＜ 0. 01) ，IC50为 13. 15 g·L
－ 1;三叶青水提物含药血清高、中、
低(20，10，5 g·kg － 1)剂量组也可显著地抑制 AGS 肿瘤细胞的增殖(P ＜ 0. 01) ，IC50为 70. 06 g·L
－ 1。二者均呈现出剂量依赖
性。结论:三叶青水提物及其含药血清对 AGS 细胞均有较强抑制作用。
［关键词］ 三叶青;AGS 细胞;含药血清;体外增殖抑制作用
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)17-0212-03
Effect of Water Extract of Tetrastigmatis hemsleyani
and the Serum Containing it on the Proliferation of AGS Cells
DING Li* ，JI Qi-xiong，LI Hong-wen
(Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China)
［Abstract］ Objective:To investigate the effect of the water extract of Tetrastigmatis hemsleyani and the
serum containing it on the proliferation in vitro． Method:The mice of clean grade were randomly assigned into 5
groups:high dose group (20 g·kg － 1) ，moderate dose group (10 g·kg － 1) ，low dose groups (5 g · kg － 1) ，
positive control cyclophosphamide (CTX，5 g·kg － 1)group and negative control group (distilled water)． Every
group was administered by intragastric administration 20 mL·kg － 1 each，twice a day within 3 successive days． One
hour after the last administration on third day，blood was collected from every decapitated mouse． The blood was
centrifugalized for 20 min at 3 000 r·min － 1 after standing at 4 ℃ ． The separated serum was filtered to remove
bacteria by 0. 22 μm sepatate film at 56 ℃ after inactivated for 30 min and stored at － 20 ℃ for later use． The
suspensions of AGS cells in logarithmic growth phase digested by 0. 25% tripsin were inoculated in 96 well culture
plate with a cell density of 2. 5 × 104 / L． The different concentrations of the water extract of T． hemsleyani and the
serum containing it were added into the culture after 24 h culture． MTT assay was used with determinating A value
in the wavelength of 570 nm to evaluate the cell proliferation of the water extract of T． hemsleyani and the serum
containing it for 48 h． Result:When the concentration of the water extract of T． hemsleyani was range from 1 g·
L － 1 to 40 g·L － 1，a significant proliferation inhibiting (P ＜ 0. 01)was shown and its 50% inhibition concentration
(IC50)was 13. 15 g·L
－ 1 ． High，moderate and low dose treatment groups (20，10，5 g·kg － 1)also significantly
inhibited the proliferation of AGS cells and its IC50 was 70. 06 g·L
－ 1 ． Both of the proliferation inhibitings were
shown in dose-dependent manner． Conclusion:The water extract of T． hemsleyani can strongly inhibit the AGS
·212·
第 18 卷第 17 期
2012 年 9 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 17
Sep．，2012
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.17.048
cells proliferation．
［Key words］ Tetrastigmatis hemsleyani;AGS cells;the serum containing T． hemsleyani;inhibition of
proliferation in vitro
葡萄科植物三叶青，又名蛇附子，金线吊葫芦
等，以块根或全草入药，味甘，性凉，具有清热解毒、
祛风化痰、活血止痛的功效，临床用来治疗小儿惊厥
高热、肺炎、支气管炎、咽喉炎、痢疾、肝炎、病毒性脑
膜炎、瘰疬、痈疔疮疖等症［1］。现代药理研究证明，
三叶青能抑制肿瘤细胞的增殖和诱导其凋亡［2-6］。
本课题组前期研究结果也表明，三叶青脂溶性提取
部位对体外培养的人恶性黑色素瘤细胞 A375、人宫
颈癌细胞株 Hela 229、人胃腺癌细胞株 AGS 及人膀
胱癌细胞株 5637 表现出较强的抑制作用［7］。但这
些结论均来自于三叶青粗制剂的离体试验或体内抑
瘤率试验，均不足以说明这些中药粗制剂经口服吸
收后对肿瘤细胞确有细胞毒性。笔者研究了三叶青
水提物及其小鼠含药血清对人胃腺癌细胞株 AGS
肿瘤细胞的体外抑制作用的影响。旨在为三叶青抗
肿瘤的作用机制及活性成分的研究提供实验依据。
1 材料
1. 1 药材 三叶青块根饮片购自宁波市鄞州医药
药材公司，经浙江医药高等专科学校中药系杨雄志
教授鉴定为 Tetrastigmatis hemsleyani Diels et． Gilg。
1. 2 细胞株 人胃腺癌细胞株 AGS 购自上海中国
科学院细胞生化所。
1. 3 动物 清洁级小鼠，雄性，体重(22 ～ 26)g，购
自 浙 江 省 实 验 动 物 中 心，许 可 证 号 SCXK
(浙)20080033。
1. 4 仪器与试药 iMark 酶标仪(美国 Bio-Rad 公
司) ，AE21 型倒置生物显微镜(Motic 中国公司) ，
HF160W 型 CO2 培养箱(中国力申科学仪器有限公
司)。MTT (美国，Amresco 公司) ，RPMI 1640 培养
基(美国，Invitrogen 公司) ，胎牛血清(上海蓝季科技
发展有限公司) ，胰岛素(上海蓝季科技发展有限公
司) ，注射用环磷酰胺(CTX，山西普德药业有限
公司。
2 方法
2. 1 药物配制
2. 1. 1 三叶青水提物制备 三叶青饮片 150 g，用
蒸馏水浸泡过夜，加热回流提取 3 次，每次 1 h，合并
提取液，过滤，滤液减压浓缩，离心 1 次，取上清液浓
缩至 150 mL，获生药含量为 1. 0 g·mL － 1三叶青水
提物，调 pH 7. 0 ～ 7. 2，用含 10%体积分数灭活新生
小牛血清 RPMI-1640 培养液稀释，分别配制成 1，
2. 5，5，10，20，40 g·L － 1的溶液，无菌过滤，备用。
2. 1. 2 小鼠含药血清制备 将 50 只小鼠随机分
组，每组 10 只，分别为三叶青水提物高、中、低(20，
10，5 g·kg － 1)剂量组［8］(相对应水提物质量浓度分
别为 1 000，500，250 g·L-1)阳性对照环磷酰胺
(CTX，5 g·kg － 1)组(相对应 CTX 质量浓度为 250 g
·L-1)及阴性对照组。各组均灌胃给药(阴性对照组
给予蒸馏水［9］) ，每次 20 mL·kg － 1，连续给药 3 d，每
天 2 次，最后 1 次给药后 1 h(灌胃前禁食 12 h)断
头取血，4 ℃静置 4 h，3 000 r·min － 1离心 20 min，分
离血清，56 ℃灭活30 min 后，用 0. 22 μm 的滤膜过
滤除菌，－ 20 ℃保存备用。
2. 2 细胞培养 人胃腺癌细胞株 AGS 用含 10%体
积分数灭活新生小牛血清 RPMI-1640 培养液在 37
℃ 5% CO2 饱湿条件下培养。
2. 3 体外肿瘤抑制试验
2. 3. 1 三叶青水提液对 AGS 细胞的体外抑制作用
取对数生长期人胃腺癌细胞株 AGS 细胞用
0. 25%的胰蛋白酶进行消化后，配成 2. 5 × 104 /L 的
细胞悬液接种于 96 孔培养板，每孔加细胞悬液 200
μL;培养 24 h 后，除去培养液，加入不同浓度的三叶
青水提物溶液各 200 μL，空白对照组加 200 μL 培
养液，阳性对照组分别加入不同浓度的 CTX 溶液
200 μL，培养 48 h 后，每孔加入 5 g·L － 1的 MTT
20 μL，培养 4 h 后，弃去上清液，加入 150 μL DMSO
震荡 10 min，570 nm 波长下测定 A 值，每剂量组设 6
复孔。
2. 3. 2 三叶青水提物含药血清对 AGS 细胞的体外
抑制作用 取对数生长期人胃腺癌细胞株 AGS 细
胞用 0. 25% 的胰蛋白酶进行消化后，配成 2. 5 ×
104 /L 的细胞悬液接种于 96 孔培养板，每孔加细胞
悬液 200 μL;培养 24 h 后，除去培养液，更换无血清
的培养液及含药血清。三叶青水提物高、中、低剂量
组及阳性对照组、阴性对照组各含 10%相应含药血
清的 RPMI-1640 培养液 200 μL，空白对照组含 10%
阴性对照组血清但不含细胞的 RPMI-1640 培养液
200 μL，培养 48 h 后，每孔加入 5 g·L － 1的 MTT
20 μL，培养 4 h 后，弃去上清液，加入 150 μL DMSO
震荡 10 min，570 nm 测定 A 值，每剂量组设 6 复孔。
·312·
丁丽，等:三叶青水提物及其含药血清对人胃腺癌细胞株的抑制作用
按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
细胞生长抑制率 =(1 － A实验组平均 /A对照组平均)× 100%
2. 4 统计方法 本实验数据采用 SPSS 17. 0 进行
处理，结果均用 珋x ± s 表示，用 Dunnet t 检验对结果
进行统计分析，P ＜ 0. 05 为有统计学意义。
3 结果
3. 1 三叶青水提物对 AGS 细胞体外抑制作用 与
阴性对照组比较，1 ～ 40 g·L － 1三叶青水提物作用
AGS 细胞 48 h 后，对 AGS 肿瘤细胞有显著地体外
抑制作用(P ＜ 0. 01) ，并且随着药物浓度的增加，对
细胞体外生长的抑制率增加，呈现出剂量依赖性，见
表 1。
表 1 三叶青水提物对 AGS 细胞的体外抑制作用(珋x ± s，n = 6)
组别
浓度
/ g·L － 1
A
抑制率
/%
IC50
/ g·L － 1
阴性对照 0 1. 464 0 0
水提物 1 1． 215 ± 0． 161) 19． 54 ± 10． 581)
2． 5 1． 173 ± 0． 131) 22． 85 ± 9． 871)
5 1． 023 ± 0． 101) 34． 59 ± 9． 071)
13． 1510 0． 755 ± 0． 081) 55． 62 ± 6． 651)
20 0． 553 ± 0． 201) 71． 44 ± 10． 251)
40 0． 249 ± 0． 041) 95． 25 ± 3． 291)
CTX 1 0． 705 ± 0． 041) 59． 53 ± 3． 101)
2． 5 0． 670 ± 0． 041) 62． 21 ± 3． 521)
5 0． 633 ± 0． 071) 65． 16 ± 3． 571)
1． 2510 0． 588 ± 0． 071) 68． 67 ± 5． 191)
20 0． 499 ± 0． 071) 75． 62 ± 4． 561)
40 0． 216 ± 0． 011) 97． 83 ± 0． 911)
注:和阴性组比较1)P ＜ 0. 01(表 2 同)。
3. 2 三叶青水提物含药血清对 AGS 细胞体外抑制
作用 三叶青水提物高、中、低剂量组含药血清作用
AGS 细胞 48 h 后的抑制作用，与阴性对照组比较，
含药血清对 AGS 肿瘤细胞有显著地抑制作用(P ＜
0. 01) ，并且随着剂量的增加，对细胞体外生长的抑
制率增加，呈现出剂量依赖性。见表 2。
表 2 10%三叶青含药血清对 AGS 细胞的体外
抑制作用(珋x ± s，n = 6)
组别
剂量
/ g·kg － 1
A
抑制率
/%
IC50
/ g·L － 1
阴性对照 0 1. 020 0 0
水提物含药血清 5 0． 886 ± 0． 081) 17． 69 ± 10． 911)
10 0． 804 ± 0． 151) 28． 60 ± 9． 091) 70． 06
20 0． 729 ± 0． 061) 38． 51 ± 8． 331)
CTX 5 0． 626 ± 0． 041) 52． 05 ± 5． 471) －
4 讨论
中药粗制剂中含有大量的杂质(如鞣质、无机
盐等)、酸碱度及渗透性等，直接加入体外反应系
统，可能会产生假阳性或假阴性结果，因此，中药粗
制剂直接作用于体外实验的结果的可信度难以客观
评价。中药血清药理学是指将中药或中药复方经口
给动物灌服一定时间后采集动物血液、分离血清，以
含药血清代替中药粗提物作为药物源加入离体反应
系统中从而研究其药理作用的一种半体内实验方
法［10］。此方法可以排除中药中杂质等因素的干扰，
其实验结果与在体实验相一致，较为客观地反映了
中药的药效［11］。
本实验表明，三叶青水提物及其含药血清对
AGS 细胞均有较强抑制作用，并且其抑制作用呈现
出剂量依赖性。试验结果同时显示三叶青水提物在
体外直接作用 AGS 肿瘤细胞作用较强，IC50 为
13. 15 g·L － 1，而其含药血清 IC50为 70. 06 g·L
－ 1。
笔者认为，三叶青经口服后，其在体内可能经过吸
收、代谢或受血清中各种因子的影响，所以，在体外
对 AGS 肿瘤细胞的抑制作用减弱。三叶青在生物
体内作用机制有待于进一步探究。
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［责任编辑 聂淑琴］
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第 18 卷第 17 期
2012 年 9 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 17
Sep．，2012