全 文 ：牛大力多糖的分离纯化及抗氧化活性研究
陈蓉蓉，蒲含林*，姜华，郑元升
（暨南大学细胞生物学系，广东广州 510632）
摘 要：建立了热水提取、乙醇沉淀、三氟乙酸除蛋白、Sephadex G-75凝胶过滤层析法，从牛大力分离纯化得到一种
水溶性多糖，命名为 MSP-1。通过红外光谱和离子色谱对其结构和单糖组成进行初步分析，结果表明 MSP-1主要由
鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖组成。同时对牛大力水提物、醇沉物和粗多糖进行体外抗氧化活性研究，结果
表明，三者的抗脂质过氧化作用和对·OH自由基和 DPPH·自由基清除能力：VC＞牛大力水提物＞牛大力醇沉物＞牛大
力粗多糖，并呈量效关系。
关键词：牛大力；多糖；抗氧化
Purified and Antioxidant Activity of Water-soluble Polysaccharide from Millettia Speciosa Champ
CHEN Rong-rong，PU Han-lin*，JIANG Hua，ZHENG Yuan-sheng
（Department of Cell biology，Jinan University，Guangzhou 510632，Guangdong，China）
Abstract：A water-soluble polysaccharide （MSP-1） was obtained from Millettia Speciosa Champ. by hot water
extraction， ethanol precipitation， trifluoroacetic acid method removing proteins and gel permeation
chromatography. The structure of MSP-1 was characterized by Ion Chromatography and FTIR spectroscopy. The
results showed that MSP -1 was mainly composed of rhamnose， galactose， glucose， mannose and fructose.
Additionally， Antioxidant activity in vitro of different extractions from Millettia Speciosa Champ were studied by
testing the scavenging effects of·OH， DPPH·and lipid peroxidantion. The results showed that three parts can
effectively remove·OH， DPPH·， lipid peroxidantion and was dose-effect relationship. The order of radical
scavenging activity was as follow： water extraction＞ethanol precipitation＞crude polysaccharide.
Key words：Millettia Speciosa Champ；polysaccharide；antioxidant activity
作者简介：陈蓉蓉（1987—），女（汉），在读硕士，主要从事天然产物
研究。
*通信作者：蒲含林（1964—），男（汉），副研究员，研究方向：天然产
物研究。
食品研究与开发
Food Research And Development
2014年 2月
第 35卷第 3期
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.009
牛大力（Millettia Speciosa Champ.）别名：金钟根、
牛牯大力等，为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤的干燥
根，性味甘、平，具有补虚润肺，强筋活络的功用[1]。临
床上已证明其对多种慢性疾病有治疗作用，主要用来
治腰痛、肾虚带下、风湿性关节炎、腰肌劳损、慢性肝
炎、病后体虚等。吕世静等[2]通过溶血空斑试验、小鼠
血清抗体凝集效价、IL-2活性测定等实验研究牛大力
对实验小鼠 B淋巴细胞分泌特异性抗体及 T淋巴细
胞产生白细胞介素 2的免疫调节作用，发现牛大力多
糖具有增强免疫力的功能。从目前这些研究来看，牛
大力多糖具有潜在的开发应用价值，且牛大力多糖结
构分析与清除自由基的研究还少见报道。本研究旨在
分析其一级结构组成以及体外抗氧化作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛大力购自广州天河石牌东百康源大药房，经鉴
定为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤（Millettia Speciosa
Champ.）的根。DPPH为美国 sigma公司，硫代巴比妥酸
（TBA）为中国医药（集团）上海化学试剂公司，VC为美
国罗氏公司，其余试剂均为国产分析纯。
1.2 受试动物
昆明种小白鼠，雌雄各半，二至三月龄，体重 18 g～
22 g。由暨南大学实验动物中心提供，常规实验室饲养。
1.3 牛大力粗多糖的提取、纯化
牛大力干品切片（3 kg）→粉碎→80 ℃水浴浸提
分离提取
31
2 h三次→合并滤液→离心，取上清液（水提物）→浓
缩→加入乙醇至含醇量达 80 %（醇沉物），-4℃冰箱静
置 12 h→离心，收集沉淀→适量热水溶解，缓慢加入
15 %三氯乙酸，搅拌至无沉淀生成，离心，合并上清
液→透析 2 d，浓缩，冻干→先后加入无水乙醇、丙酮，
不断搅拌，洗去色素，过滤→冷冻干燥，得到粉状牛大
力多糖（粗多糖）。
1.4 牛大力粗多糖的纯化
分离柱为 Sephadex G-75葡聚糖凝胶层析柱。层
析柱先用超纯水平衡 12 h后，上样前将样品溶解后离
心，过 0.45 μm微孔滤膜。分离条件为室温，以超纯水
为流动相洗脱，流速为 0.5 mL/min，苯酚硫酸法跟踪
检测，收集主峰，合并洗脱液，浓缩，冷冻干燥得到纯
化多糖。
1.5 牛大力多糖结构分析
1.5.1 牛大力的元素分析前处理
牛大力切片粉碎，干燥，称取 1.000 0 g牛大力于
瓷坩埚中，置电阻炉中高温加热至 600℃完全灰化，冷
却，加入 1 mL浓 HNO3溶解后，定容。测定条件为等离
子体 15 L/min，等离子发射功率为 1 300 W，辅助气流
量 0.2 L/min，雾化器 0.70，观测距离 15.0，等离子体轴
向观测。同样条件以硝酸及双蒸水作空白对照，按外
标法测定各元素含量[3]。
1.5.2 牛大力多糖的元素组成分析
使用 CHNS/O元素分析仪对牛大力多糖进行 C、H、
N等元素分析。实验条件为通气载气：20 PSI（0.14MPa），
氧气：15 PSI（0.1 MPa），气动气：（0.4 MPa）；燃烧管温
度（925），还原管温度（640）。
1.5.3 红外光谱分析
称取 1.0 mg干燥牛大力多糖组分（MSP-1）于 KBr
混合压片中，在 4 000 cm-1~400 cm-1范围进行红外扫描。
1.5.4 离子色谱分析
牛大力多糖 MSP-1水解：配制 1.0 mg/mL牛大力
多糖溶液，取 1 mL于具塞试管中，加入 4.0 g/L三氟乙
酸溶液 1.0 mL，封口，在水浴锅 80 ℃下水解反应 1 h，
加水溶解并定容至 2.0 mL检测[4]。
色谱条件为 CarboPACTMPAl0糖分离柱（2mm i.d×
250mm），CarboPACTMPAl0糖保护柱（2mm i.d×50mm），
AminoPAC Trap氨基酸捕集柱（2 mm i.d×50 mm）；流动
相为 14.0 mmol/L NaOH，流量 0.2 mL/min，进样量 25μL，
柱温 30℃。
1.6 牛大力抗脂质过氧化作用
昆明种小鼠脱颈椎处死，迅速取出肝组织，放入
到 4℃预冷的生理盐水中，洗净残血，吸干水分，称重，
用生理盐水制备成 3%肝匀浆。在具塞试管各加入 3mL
肝匀浆后，实验组加入三部位不同浓度牛大力提取物
1 mL，阳性组加入 VC溶液 1 mL，对照管加入 1mL双蒸
水，再各加入 6 mmol/L FeSO4 100 μL，60 mmol/L H2O2
40 μL，混匀，37 ℃温育 90 min；再加入 15 % TCA 1 mL
沉淀蛋白振荡终止反应，加入 0.67 % TBA 1 mL混匀，
煮沸 15 min，冰浴冷却；用分光光度计测定在 515 nm
处的吸光度。按脂质过氧化产物MDA的摩尔消光系数
ε= 1.56×104 mol/（L·cm）计算MDA的产量[5-6]。
1.7 牛大力对·OH自由基的清除作用
反应体系包含 100 μmol/L 抗坏血酸 20 μL，
100 μmol/L CuSO4 20 μL，还原型细胞色素 C（II）注射
液 40 μL，再加入提取物或者 PBS（PH7.4，0.15 mol/L）
缓冲液 20 μL，PBS缓冲液 1.9 mL，混匀后在 37℃水浴
1 h，取出后于分光光度计上测定 550 nm处的吸光度。
抑制率（%）=（Fo - Fx）/F0 × 100 %
式中：Fo为贮备液的荧光值；Fx为贮备液+样品的
荧光值。
1.8 牛大力对二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）清除
作用
向 2.5 mL 6.5×10-5 mol/l DPPH·溶液中加入 0.5 mL
的样品溶液，空白对照用等量双蒸水代替，总体积 3mL，
混匀，室温下封闭反应 15 min后测定在 517 nm波长
的测吸光度 Ai。每一吸光度平行测 3次，取其平均值，
DPPH·清除率计算式：
清除率/% = 1 -（Ai - Aj）A0
× 100 %
式中：Ai为 2.5 mL 6.5×10-5 mol/LDPPH乙醇溶液
与 0.5 mL试样混合液在 517 nm处吸光值；Aj为 2.5 mL
乙醇与 0.5 mL试样混合液在 517 nm处吸光值；A0为
2.5 mL 6.5×10-5 mol/LDPPH乙醇溶液与 0.5 mL双蒸水
混合液在 517 nm处吸光值[7]。
2 结果与分析
2.1 牛大力多糖的纯化
牛大力多糖通过凝胶柱的分离纯化结果见图 1。
图 1 凝胶柱层析法纯化牛大力多糖
Fig.1 Elution profile of crude polysaccharide on Sephadex G-75
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
49
0
nm
0 5 10 75
管数
15 40 55 6020 25 3530 45 50 65 70
分离提取陈蓉蓉，等：牛大力多糖的分离纯化及抗氧化活性研究
32
图 1显示，经过 Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱分
离纯化后，洗脱曲线图有两个多糖峰，可见牛大力多
糖（polysaccharide of Millettia Speciosa Champ.，MSP）含
有 2个不同分子量范围的多糖。其中，先洗脱下来的
多糖峰的总糖含量较高，并且为一对称峰。洗脱液经
透析、冻干后得纯化多糖，命名为 MSP-1。
旋光度的测定，称取多糖组分（MSP-1）0.2 mg，蒸
馏水溶解并定容至 2 mL，用WZZ-1型自动指示旋光
仪于室温（26℃）下测定多糖旋光度，以蒸馏水为参照
调零。通过测定 MSP-1旋光度为-15°。
2.2 牛大力多糖的结构分析
2.2.1 牛大力的元素分析
牛大力的元素分析结果见表 1。
如表 1所示，本研究测定了牛大力切片中的 19种
元素，约占 1.139%。其中 Ca、K、Mg、Al、Fe和Mn等含量
较为丰富，同时其含有丰富的微量元素，约占 0.127 1%。
重金属砷、汞、铅、镉、铬等微量元素在体内蓄积至一定
量时可引起免疫系统和多种功能损害[8]。《药用植物及
制剂进出口绿色行业标准》中对重金属的限量指标
（mg/kg）：铅（Pb）≤5.0、镉（Cd）≤0.3、砷（As）≤2.0。本
研究药材中重金属均符合标准。
2.2.2 红外光谱分析
牛大力多糖的红外图谱见图 2。
MSP-1红外光谱见图 2，3 304 cm-1附近的强圆底
峰形是分子间或分子内的 O－H伸缩振动峰，表明其存
在羟基；2 927 cm-1的小尖峰为 C－H（－CH2）伸缩振动
峰；1 764 cm-1处有 C=O伸缩振动的吸收峰；1 236 cm-1、
1 332 cm-1的吸收峰是 C－H的弯曲振动，这些吸收峰
显示 MSP-1具有多糖的特征。1 017 cm-1和 1 077 cm-1
的强吸收峰是 C－O－C和 C－OH的弯曲振动峰，表面此多
糖为吡喃糖，832 cm-1处为 α－吡喃环 C－H弯曲振动特征
峰，755 cm-1处为吡喃糖对称环伸缩振动，表面糖苷键
为α－型糖苷键。结果说明MSP-1为 α－型吡喃多糖。
2.2.4 离子色谱分析
通过离子色谱来分析牛大力多糖的组成，结果见
图 3。
图 3实验结果所示，牛大力多糖 MSP-1主要由葡
萄糖和果糖组成，此外还有少量的鼠李糖、半乳糖、及
甘露糖。
3 牛大力多糖体外抗氧化活性
3.1 抗脂质过氧化作用
牛大力多糖的抗脂质过氧化作用的结果见图 4。
由图 4可以看出，与不同浓度的牛大力提取物共
同孵育，肝匀浆内脂质过氧化产物的含量均有不同程
度的降低，表明牛大力提取物均能有效抑制肝匀浆的
表 1 ICP-AES测定牛大力主要的元素含量
Table 1 ICP-AES analysis of the element of Millettia Speciosa
Champ
元素 含量/（mg/kg） 元素 含量/（mg/kg）
Ca 5 879.5 Cu 6.44
K 2 815.77 B 3.2
Mg 1 338.14 Pb 1.84
Al 767.63 As 0.58
Fe 335.09 Ni 0.44
Mn 96.33 Cr 0.19
Na 85.48 Cd -
Ba 28.28 Mo -
Zn 15.79 Se -
Si 15.06 - -
注：“-”为未检出。
100
96
92
88
84
80
透
光
率
/%
4 000 3 500 3 000 500
波数/cm-1
2 500 2 000 1 500 1 000
图 2 牛大力多糖MSP-1红外光谱
Fig.2 The IR spectrum of MSP-1
图 3 离子色谱测定牛大力多糖的单糖组成
Fig.3 IC analysis of the complete hydrolysis of polysaccharide
600
500
400
300
200
100
-10
nC
0.0 2.0 4.0 20.0
min
6.0 8.0 10.012.0
果
糖甘
露
糖
葡
萄
糖
鼠
李
糖
半
乳
糖
14.016.018.0
图 4 抗脂质过氧化作用
Fig.4 The inhibition of lipid- peroxidation
90
80
70
60
50
40
30
20
10
抑
制
率
/%
0 200 400 1 000
浓度/（μg/mL）
600 800
牛大力多糖
牛大力水提物
牛大力醇沉物
VC
陈蓉蓉，等：牛大力多糖的分离纯化及抗氧化活性研究分离提取
33
自发性脂质过氧化作用，且抑制作用具有一定的量效
关系。以 IC50来评价抗脂质过氧化的能力：VC＞牛大力
水提物＞牛大力醇沉物＞牛大力粗多糖。
3.2 对·OH自由基的清除作用
牛大力多糖对·OH自由基的清除作用的结果见
图 5。
图 5 结果显示，牛大力的提取物均能有效清除
·OH自由基，并呈量效关系。VC在 0.25 μg/mL时就达
到 82 %，之后保持恒定。而牛大力提取物对·OH清除
率开始较低，随着浓度的增大，清除率提高；在浓度为
0.2 μg/mL时，牛大力水提物的清除率达 50 %，牛大力
醇沉物的清除率为 35 %，牛大力多糖的清除率为
23 %，可见清除能力依次为：VC＞牛大力水提物＞牛大
力醇沉物＞牛大力粗多糖。
3.3 对 DPPH·自由基的清除作用
牛大力多糖对 DPPH·自由基的清除作用的结果
见图 6。
VC、牛大力水提物、牛大力醇沉物和牛大力多糖
对 DPPH·自由基均具有一定的清除作用（图 6），清除
率呈现一定的量效关系。VC对 DPPH·自由基清除率最
高达到 89 %，而牛大力水提物、牛大力醇沉物和牛大
力多糖对 DPPH·自由基清除率分别为 82 %、62 %、
53 %，可见清除能力如下：维生素 C＞牛大力水提物＞
牛大力醇沉物＞牛大力粗多糖。
4 讨论
植物多糖以其广泛的治疗作用和极低的细胞毒
性，在医药、食品等领域具有宽广的应用前景。从天然
植物中寻找新的清除体内自由基的抗氧化剂成为了
现代医药和功能食品行业发展的新方向。研究多糖及
其衍生物的抗氧化作用，开发新的天然抗氧化剂，具
有重要的现实意义。
本研究提取了牛大力多糖，采用 Sephadex G-75
葡聚糖凝胶柱分离纯化得到一种多糖 MSP-1，利用红
外光谱和离子色谱对其结构和单糖组成进行了初步
分析，确定其由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖
组成。通过测定牛大力元素含量，可知其 Ca、K、Mg、
Al、Fe和 Mn等矿物质元素含量高，同时含有丰富的微
量元素 Zn、Mn，这与其发挥抗炎、调节免疫的功能相
关。研究了 VC、牛大力水提物、牛大力醇沉物和牛大力
粗多糖对自由基的清除能力和抗氧化活性。结果表
明，四者的抗脂质过氧化作用和对·OH 自由基和
DPPH·自由基清除能力：VC＞牛大力水提物＞牛大力醇
沉物＞牛大力多糖。可见水提物有较大的清除能力，这
与牛大力提取物具有多种组分相关，特别是含有黄
酮，异黄酮等组分，这些组分具有清除自由基和抗氧
化作用。本研究可为牛大力多糖在抗氧化和抗衰老功
能性食品中的应用开发提供参考。
参考文献：
[1] 谢国材,肖巧卿.彩图中国百草良方[M].汕头:汕头大学出版社,
2000:119
[2] 吕世静,黄槐莲,吴宋厦.牛大力对抗体及 IL-2产生的影响[J].上
海免疫学杂志,1997, 17(1):56
[3] 封聚强,赵骏.中药多糖的分子量及结构研究进展[J].时珍国医国
药,2008,19(3): 624-625
[4] Nicola Volpi. Milligram -scale preparation and purification of
oligosaccharides of defined length possessing the structure of chon－
droitin from defructosylated capsular polysaccharide K4[J]. Glyco－
biology, 2003,13(9):635-640
[5] 石焱,弓小雪,那婕.牛大力多糖对免疫抑制小鼠的免疫调节作用
[J].临床军医杂志, 2008,36(4):530-533
[6] 方积年,丁侃.天然药物-多糖的主要生物活性及分离纯化方法
[J].中国天然药物,2007,5(5):338-348
[7] 刘富梁,金卫根,梁华正.酶法在中药提取中的研究进展[J].时珍
国医国药,2006,17(7): 1152-1153
[8] 郭新华,章世元,严桂芹.中药多糖的免疫调节作用及其在畜禽生
产中的应用[J].国外畜牧学,2008,28(4):75-80
收稿日期：2012-07-12
图 5 牛大力提取物对羟基自由基的清除作用
Fig.5 Oxhydryl scavenging activity of extraction from Millettia
Speciosa Champ
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
清
除
率
/%
0.1 0.2 0.5
浓度/（μg/mL）
0.3 0.4
牛大力多糖
牛大力水提物
牛大力醇沉物
VC
图 6 牛大力提取物对 DPPH·自由基的清除作用
Fig.6 DPPH·scavenging activity of extraction from Millettia
Speciosa Champ
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
清
除
率
/%
100 200 500
浓度/（μg/mL）
300 400
牛大力多糖
牛大力水提物
牛大力醇沉物
VC
分离提取陈蓉蓉，等：牛大力多糖的分离纯化及抗氧化活性研究
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