全 文 ：第 25卷 第 2期
2 0 0 7年 2月
中 华 中 医 药 学 刊
CH INESE ARCH IVES OF TRAD IT IONAL CH INESE MED IC INE
Vo.l 25 No. 2
Feb. 2 0 0 7
中华中医药
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学刊
山核桃提取物体外抗肿瘤作用研究
胡旭姣,赵肖君,周 奋,余美荣,陈银银, 李瑞枝,贾永慧,指导:丁志山
(浙江中医药大学,浙江 杭州 310053)
摘 要:目的:探讨山核桃的抗肿瘤作用。方法: 采用极性溶剂法从山核桃叶子中分离提取出石油醚、氯仿、
乙酸乙酯、正丁醇和水提取物 5种提取物, 采用 M TT法观察其对肿瘤细胞 SGC - 7901增殖的抑制作用, 并采用光
学显微镜和电镜方法观察乙酸乙酯提取物对 SGC - 7901细胞凋亡的诱导作用。结果: 山核桃乙酸乙酯提取物抗
肿瘤作用最强, 并且能够诱导肿瘤细胞凋亡。结论:山核桃叶子中有抗肿瘤物质,值得进一步深入研究。
关键词:山核桃;抗肿瘤; 乙酸乙酯提取物;凋亡
中图分类号: R931 文献标识码: A 文章编号: 1673 -7717( 2007) 02 -0369 - 02
The Ant i- tumorE ffects ofCa rya C a thayens is S a rg. Extracts in V itro
HU Xu-jiao, ZHAO Xiao-jun, ZHOU Fen, YU M e i-rong,
CHEN Y in-yin, L IRui-zh,i JIA Yong-hu ,i Adv isor: D ING Zhi-shan
( Zhe jiang University o f TCM, H angzhou 310053, Zhe jiang, Ch ina)
Abstrac tO b jective: To study the anti-tum or effects o fCarya Cathayensis Sarg. M ethods: W e extract five k inds ex-
trac ts from Carya Ca thayensis Sarg. leavesw ith ligh t petro leum, chlorofo rm, acetic e ther, n-butano l and w ate r. W e observe
the an ti-tum or e ffects of them byMTT assay. And w e a lso observe the induc tion o f apoptosis o f ace tic e ther extracts on SGC-
7901. Resu lts: The ace tic ethe r extracts have the strongest anti-tumo r e ffects, and it can induce SGC-7901 ce ll apoptosis.
C onc lus ion: The re is an titumo rigenic substance in Carya Cathay ens is Sarg. leaves, and it wo rth of study furtherm ore.
Keywords: carya cathayens is sarg. ; anti-tumo r; acetic e ther ex trac ts; apop to sis
收稿日期: 2006 - 09 - 27
作者简介:胡旭姣 ( 1984 - ) ,女,浙江宁波人, 2002级本科学生, 研
究方向:中药药理学。
山核桃 ( Carya ca thayens is Sarg. )是我国特有的名优
干果和木本油料作物,胡桃科山核桃属植物,主要分布在浙
江临安,皖南山区和皖西大别山。具有营养、保健、美容及
药用价值。山核桃油味清香, 是优良的营养食用油,经常食
用有润肺、滋补和康复之功效,又可降低血脂, 预防冠心病。
民间常用于清热、解毒、抗癌、镇痛等疾病的治疗。
目前国内外对山核桃的研究主要是对其植物形态分
类、栽培、山核桃仁营养价值等的研究, 但对于其化学成分
的提取分离及药理作用等的研究尚未见报道。本文采用系
统溶剂法从山核桃叶子中分离提取石油醚、氯仿、乙酸乙
酯、正丁醇和水 5种提取物, 采用细胞培养技术观察这 5种
提取物的抗肿瘤作用。
1 材 料
1. 1 山核桃 山核桃 ( Carya ca thayen sis Sarg. ), 落叶乔
木,树皮、果皮及叶子民间可药用,具有清热解毒作用。山
核桃叶子于 2004年夏采自浙江临安湍口镇, 晒干后备用。
1. 2 仪器 SHZ -D (Ⅲ )循环水式真空泵,巩义市英谷予华
仪器厂; SENCO R - 201旋转蒸发仪, 上海中顺生物科技有
限公司; H eraeus三气细胞培养箱 , H eraeus公司; SW - CJ -
1F层流超净工作台, 苏州安泰空气技术公司; XDS - 1倒置
显微镜系统,重庆光学仪器厂; LD4 -2A型低速离心机,北京
医用离心机厂, UR - 4100型酶标仪, 美国 Dynatech公司。
2 实验方法
2. 1 药物制备 将采集的山核桃叶子 200g以 70%的乙醇
10倍量浸泡过夜,水浴回流 2h, 旋转蒸发仪回收乙醇得褐
色黏稠物;叶子再加 5倍的 70% 的乙醇浸泡过夜, 回收乙
醇浓缩液,汇总乙醇浓缩液留存备用。
将总浓缩液悬浮于适量水中, 充分震荡混匀后分别采
用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取。先用石油醚
萃取 3次, 每次 200mL, 旋转蒸发仪回收石油醚萃取层留
存;余下液体用氯仿萃取 3次,每次 200m L, 旋转蒸发仪回
收氯仿层;再以乙酸乙酯萃取 3次, 每次 200m L, 旋转蒸发
仪回收乙酸乙酯层;余下液体用水饱和正丁醇萃取 3次, 每
次 200mL, 旋转蒸发仪回收正丁醇层。余下水层离心后取
水层旋转蒸发仪回收留存。得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正
丁醇和水提取物等 5种提取物。
各称取 2mg的上述 5种提取物, 水层直接用 1mL RP-
M I1640溶解备用; 石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物
溶解于 200LL二甲基亚砜中, 旋涡震荡, 全部溶解后, 加入
800LL RPM I1640 培养液旋涡震荡混匀。将上述药物
16000r /m in离心后 0. 22Lm滤膜过滤除菌后放置于 4e 冰
箱保存备用。
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DOI：10.13193/j.archtcm.2007.02.178.huxj.080
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2. 2 细胞培养方法 将胃癌 SGC - 7901细胞接种于含
10%新生小牛血清、100U /m L青霉素和 100U /mL链霉素的
PPM I1640培养液中, 37e 培养, 长满后 0. 08% 胰蛋白酶消
化传代培养。
2. 3 MTT法观察山核桃提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作
用 用含 10% FBS的 1640培养液培养的胃癌细胞 SGC -
7901以 7 @ 103 /孔接种于 96孔板, 37e 5% CO 2的培养箱
中培养 3h后, 分别加入上述配制的药物, 加入量分别为 2、
4、6、8和 10LL,每剂量组 6复孔, 不加任何药物的为对照。
继续培养 48h后, 观察细胞形态的变化。加入 MTT孵育
4h,吸弃上清液,加入 DMSO 150LL震荡 10m in, 570nm处测
OD值。RI(细胞增殖抑制率 ) =〔(对照组 A 值 - 用药组
A值 ) /对照组 A值 @ 100%〕。
2. 4 乙酸乙酯提取物诱导 SGC - 7901细胞凋亡的观察
①光学显微镜观察: 在 6孔培养板中放入清洗干净的盖玻
片,紫外线照射灭菌。每孔接种 SGC - 7901细胞, 4h后分
别加入上述配制好的乙酸乙酯提取物 96LL /mL,不加任何
药物的为对照,继续培养 24h, 取出盖玻片上细胞进行苏木
素 ) 伊红染色,光镜下观察细胞形态变化。②透射电镜观
察:在 100m L培养瓶中接种 SGC - 7901细胞, 4h后加入上
述配制好的乙酸乙酯提取物, 浓度和对照组设立同上。处
理 24h后收集细胞, 加 2. 5% 的戊二醛固定 30m in后, 加
1%四氧化锇固定 1h,包埋后超薄切片,透射电镜下观察细
胞形态变化。
3 结 果
3. 1 药物制备 利用系统溶剂法从 200g山核桃叶中提取
得到石油醚提取物 0. 31g, 氯仿提取物 0. 38g, 乙酸乙酯提
取物 0. 44g,正丁醇提取物 1. 58g, 水提取物 4. 21g。
3. 2 山核桃提取物对 SGC - 7901细胞增殖的抑制作用
从图 1可以看出, 山核桃的不同提取物均能抑制 SGC -
7901细胞的增殖;随着药物浓度的增加, 其生长抑制作用
增强,呈量效关系; 其中,乙酸乙酯提取物的抑制作用最强,
随着加入药物浓度的增加, 其对 SGC - 7901细胞生长抑制
率提高 (同对照比较 P < 0. 05) ; 氯仿提取物的作用次之
(同对照比较 P < 0. 05); 而其它 3种提取物对 SGC - 7901
细胞增殖的抑制作用不大 (同对照比较 P > 0. 05)。
图 1 山核桃提取物对 SGC -7901细胞增殖的抑制作用
3. 3 乙酸乙酯提取物诱导 SGC - 7901细胞凋亡 乙酸乙
酯提取物处理 SGC - 7901细胞, HE染色后, 光学显微镜下
观察,多数细胞体积变小, 变形, 细胞核固缩, 但细胞膜完
整。而对照组 SGC - 7901细胞形态学无明显变化。
电子显微镜下可见, 凋亡细胞体积变小, 细胞核变小,
染色质浓缩并凝结成块,细胞核碎裂, 细胞呈典型的凋亡现
象。而对照组 SGC -7901细胞形态学无明显变化, 见图 2。
A:对照组 (透射电镜, 3700@ ), B:用药组 (透射电镜, 3700@ )
胃癌细胞可见细胞核的染色质高度凝聚、固缩、碎裂。
图 2 电镜观察乙酸乙酯提取物诱导 SGC -7901细胞凋亡
4 讨 论
传统中草药在肿瘤临床治疗上已得到广泛应用。对一
些常用抗癌中草药的研究已取得突破性的进展, 对其直接
或间接的抗癌作用也有了更深的认识。从中药中开发新的
抗肿瘤药物越来越受到人们的重视,多年来人们已经对药
典上记载的各种中药进行了多次筛选。我国民间有丰富的
草药偏方在抗肿瘤方面有独特的功效, 但在药典上并没有
记载,因此对民间草药的开发研究也许会为肿瘤治疗开辟
新思路。
近年来研究表明:核桃科植物除了果仁部分具有丰富
的营养价值和药用价值外, 植物本身还具有抑制醛糖还原
酶、抗肿瘤、镇痛消炎、抑菌及生物毒性等生物活性作
用 [1 - 4]。
核桃是山核桃的同科植物,近年来国内外对核桃化学
成分的分离提取和抗癌作用机理研究是近年国内外研究的
热点。用核桃青果皮、核桃叶作为作为抗癌民间药方, 历史
源远。核桃楸果是核桃未成熟果实或果皮 (青龙衣 ), 具有
清热, 解毒, 止痢, 明目的攻效。治泄泻, 痢疾, 白带, 目赤
等。在 1200多年前, 唐代《食疗本草》中就有胡桃 /通润血
脉0的记载。近年来,不少文献对核桃楸用药部位、有效成
分、止痛及抗肿瘤作用进行了研究。研究发现核桃果皮、叶
子及树皮等都具有较好的抗肿瘤作用 [1 - 2, 4 ]。
山核桃 ( Carya cathay ensis Sarg. )是我国特有的胡桃
科植物,目前尚未见有关于山核桃化学成分及药理作用的
文献报道。本研究利用系统溶剂法山核桃树叶叶中提取出
五种提取物,结果发现乙酸乙酯提取物具有明显的抑制肿
瘤细胞增殖作用, 并且能够诱导肿瘤细胞增殖。这同宋
华 [4]等人采用核桃的研究结果是一致的。山核桃乙酸乙
酯提取物由几种物质组成? 具体哪种成分在起作用? 值得
进一步深入研究。
参考文献
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沈阳药学院学报, 1987, 4 ( 3) : 166 - 169
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