全 文 ：2 0 1 1 年 12 月 农 业 机 械 学 报 第 42 卷 第 12 期
山核桃外果皮黄酮提取与纯化*
陈向明1 徐 涛1 查甫本2
(1．合肥学院生物与环境工程系，合肥 230022;2．合肥工业大学生物与食品工程学院，合肥 230009)
【摘要】 采用有机溶剂萃取法提取山核桃外果皮黄酮化合物，通过单因素和正交试验确定了最佳工艺参数。
结果表明，提取溶剂为体积分数 70%乙醇、提取时间 4 h、提取温度 60℃、液料比 15 mL /g条件下得黄酮化合物最高
提取率为 1. 14%。采用硅胶色谱柱层析法纯化黄酮化合物，在液固比 3 mL /g 的条件下，体积分数 70%乙醇以
2 mL /min的流速进行洗脱，黄酮纯度提高了 34. 6%，总黄酮回收率达 89. 46%。
关键词:山核桃外果皮 黄酮 提取 纯化
中图分类号:TS201. 1 文献标识码:A 文章编号:1000-1298(2011)12-0177-05
Extraction and Purification of Flavone in C． cathayensis Exocarp
Chen Xiangming1 Xu Tao1 Zha Fuben2
(1． Department of Biological and Environmental Engineering，Hefei University，Hefei 230022，China
2． School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China)
Abstract
In order to study the extraction and purification of flavonein C． cathayensis exocarp，organic solvent
extraction was used to extrat flavone compound in C． cathayensis exocarp． Through single fraction
experiments and orthogonal experiments，the optimal technological parameters were determined． The
result showed the maximum extraction ration of flavone compound was 1. 14% under the condition of 70%
ethanol，time of 4 h，temperature of 60℃，liquid-solid ratio of 15 mL /g． Silica gel chromatography was
used to purify falconoid，liquid-solid ratio of 3 mL /g，gradient eluted by 70% ethanol at the speed of
2 mL /min，the purity of flavone was improved by 34. 6%，and its recovery reached to 89. 46% ．
Key words C． cathayensis exocarp，Flavone，Extraction，Purification
收稿日期:2011-01-10 修回日期:2011-07-08
* 安徽省高校省级自然科学基金重点资助项目(KJ2010A293、2006KJ190B)
作者简介:陈向明，教授，博士，主要从事农业生物资源综合利用研究，E-mail:cxming@ email． hfuu． edu． cn
引言
山核桃外果皮是浙、皖地区的主要农业废弃物。
研究表明，山核桃外果皮富含 K、Mn、Ca、Fe、Cu、Zn、
Mg等多种无机元素和黄酮、单宁、醌类、多糖、维生
素等生物活性成分［1］。因此，开发利用山核桃外果
皮有利于提高植物资源的利用率和保护山核桃产区
的生态环境。已有资料报道，可以利用山核桃外果
皮制备工业钾盐———碳酸钾和焦磷酸钾［2］;山核桃
外果皮黄酮化合物具有重要的生物学功能，如抑制
食用油脂的自动氧化过程、清除活性氧自由基、延长
油脂的储藏时间［3］;对小鼠(Musmusculus)经60 Co 辐
射所致的氧化损伤有一定的防护作用，能显著降低
血清和肝组织中的丙二醛含量并提高细胞超氧物岐
化酶的活性［4］，对农作物小麦和绿豆的苗期生长具
有一定的促进作用［5］等。目前，山核桃外果皮黄酮
化合物的研究主要集中在医学、农业和食品等领域，
有关山核桃外果皮黄酮化合物的提取与纯化工艺尚
未见有报道。本文对山核桃外果皮黄酮的提取与纯
化工艺条件进行研究，以期能为农业废弃物的开发
利用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料与设备
1. 1. 1 试验材料
植物材料:山核桃外果皮为当年产，由安徽省
宁国市山里仁食品有限公司提供。将山核桃外果皮
捡去石块和杂物，用水稍加清洗后自然晾干，机械粉
碎过 40 目筛，避光冷藏备用。
层析材料:硅胶(200 ～ 300 目)用浓盐酸清除微
量金属离子，蒸馏水冲洗至 pH值 7 左右［6］，在干燥
箱 110℃下活化 24 h，冷却至室温备用。
1. 1. 2 试剂与设备
试剂:芦丁标准品(优级纯，购于中国药品生物
制品鉴定所)、乙醇、盐酸、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧
化钠均为分析纯。
设备:FA-1004 型电子天平(上海方瑞仪器有限
公司) ;757 型紫外-可见分光光度计(上海雷韵试验
仪器制造有限公司) ;UV-1600 型紫外分光光度计
(北京北分天普仪器技术有限公司) ;SBS100 型数控
记滴自动部分收集器(上海新诺仪器设备有限公
司) ;RE-52A 型旋转蒸发仪(郑州亚荣仪器设备
厂)。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 黄酮提取试验
称取山核桃外果皮粉末 5 g，经溶剂回流提取、
抽滤、离心、上清液减压浓缩、干燥得黄酮粗提样品
冷藏备用。
(1)单因素试验
通过单因素试验确定提取溶剂类型、提取溶剂
体积分数、提取时间、提取温度、液料比各因素的较
适宜范围。其中，提取溶剂为蒸馏水、体积分数为
50%甲醇、体积分数为 50%乙醇、丙酮、乙酸乙酯，
适宜溶剂提取的体积分数为 50%、60%、70%、
80%、90%，提取时间为 1、2、3、4、5 h，提取温度为
50、60、70、80、90℃，液料比为 8、10、15、20、25 mL /g。
(2)正交试验
在单因素试验的基础上，以溶剂体积分数、提取
时间、提取温度、液料比为研究对象，按 L9(3
4)安排
四因素三水平的正交试验，黄酮提取率为评价指标。
正交试验因素与水平如表 1 所示。
1. 2. 2 黄酮纯化试验
(1)黄酮粗提液预处理
用体积分数为 70%乙醇溶解黄酮粗提样品成
表 1 正交试验因素与水平
Tab． 1 Factors and levels
水平
因素
溶剂体积
分数 a /%
提取时间
b /h
提取温度
c /℃
液料比
d /mL·g － 1
1 60 2 60 10
2 70 3 70 15
3 80 4 80 20
质量浓度为 1. 5 mg /mL 的黄酮粗提液，经适量石油
醚萃取 3 次，去除脂溶性成分弃去石油醚层，留作纯
化样品时使用。
(2)硅胶色谱柱制备
采用硅胶色谱柱层析法纯化黄酮［6］。经预处
理硅胶，湿法装入 5 cm ×60 cm玻璃色谱柱中。
(3)解吸附条件
在黄酮粗提液与硅胶液固比 3 mL /g的条件下，
设置体积分数 20%、40%、60%、80%甲醇和体积分
数 20%、40%、60%、80%乙醇作洗脱剂，对硅胶吸
附的黄酮进行静态解吸附性能比较，以确定最佳洗
脱溶剂;设置洗脱流速为 1、2、3、4、5 mL /min，采用
数控记滴自动部分收集器分段收集流出液，进行动
态解吸附性能比较，以确定最佳洗脱流速。
1. 3 测定方法
1. 3. 1 评价指标
(1)黄酮提取率:黄酮质量与山核桃果皮质量
的百分比。
(2)黄酮洗脱率:洗脱黄酮质量与吸附黄酮质
量的百分比，计算式为
D =
D3
D2(D0 － D1)
× 100% (1)
式中 D0———加入的起始黄酮质量，mg
D1———滤液中残余黄酮质量，mg
D2———硅胶吸附的黄酮质量，mg
D3———洗脱的黄酮质量，mg
1. 3. 2 标准曲线绘制
(1)芦丁标准溶液的配制
精确称取芦丁(黄酮标准物)对照品 10 mg，置
10 mL 容量瓶中，用体积分数 95%乙醇溶解并稀释
到刻度，摇匀。
(2)最大吸收波长的测定
精确量取 1. 0 mL 芦丁标准溶液，用体积分数
95%乙醇补充至 10 mL;加入质量分数 5%亚硝酸钠
0. 3 mL摇匀，放置 6 min;再加质量分数 10%硝酸铝
0. 3 mL ，放置 6 min;加入质量分数 4%氢氧化钠溶
液4 mL，用体积分数 95%乙醇稀释至刻度;15 min
后采用 UV-1600 型紫外分光光度计在波长 200 ～
700 nm范围内扫描并确定黄酮吸收波长。
(3)回归方程建立
按照 NaNO2 － AlCl3络合-分光光度法
［6］于波长
510 nm处测定吸光度，作出标准曲线。得到吸光度
与质量浓度关系的回归方程为
E = 0. 086F + 0. 002 5 (r = 0. 999 8) (2)
式中 E———吸光度
F———黄酮质量浓度，mg /mL
871 农 业 机 械 学 报 2 0 1 1 年
1. 3. 3 黄酮纯度测定
准确称取纯化前、后的样品粉末各 0. 1 g，分别
溶于体积分数 95%乙醇并定容到 100 mL，在相同条
件下测定样品的吸光度，根据回归方程计算出样品
中的黄酮含量。
2 结果与分析
2. 1 提取条件
2. 1. 1 提取溶剂
定量称取山核桃果皮粉末 5. 0 g，在提取时间
4 h，提取温度 60℃，液料比 15 mL /g，提取溶剂为蒸
馏水、体积分数 50%甲醇、体积分数 50%乙醇、丙
酮、乙酸乙酯的条件下，研究溶剂对黄酮提取率的影
响，试验结果如表 2 所示。由表 2 可以看出，黄酮提
取率因溶剂的极性不同有很大区别，蒸馏水的提取
率最低，体积分数 50%乙醇的提取率最高。说明此
类黄酮可能是一类结构呈平面型的黄酮醇分子，因
为分子间排列紧密，引力较大，难溶于水，易溶解于
有机溶剂［7］。丙酮的提取率也较高，考虑到丙酮的
毒性和产物得率，以下试验均选用乙醇作为最适提
取溶剂。
表 2 提取溶剂的选择
Tab． 2 Choice of extraction solvent
提取溶剂 蒸馏水
体积分数
50%甲醇
体积分数
50%乙醇
丙酮 乙酸乙酯
提取率 /% 0. 235 0. 680 0. 894 0. 802 0. 436
2. 1. 2 提取溶剂体积分数
在提取时间 4 h，提取温度 60℃，液料比 15 mL/g
的条件下，研究体积分数为 50%、60%、70%、80%、
90%乙醇对黄酮提取率的影响。由图 1a 可以看出，
随着乙醇体积分数的增加，黄酮提取率呈线性迅速
增长，当乙醇体积分数大于 70%后，黄酮提取率呈
下降的趋势。这是由于乙醇体积分数不同其极性不
同，黄酮类化合物具有较高的极性［8］。因此选用
70%乙醇浸提黄酮最为适宜。
2. 1. 3 提取时间
在提取溶剂体积分数 70% 乙醇，提取温度
60℃，液料比 15 mL /g，提取时间为 1、2、3、4、5 h 条
件下，研究提取时间对黄酮提取率的影响。由图 1b
可以看出，黄酮提取率与提取时间基本呈正相关，说
明适当延长提取时间，可以提高黄酮的提取率。但
时间超过 4 h后，黄酮提取率趋于稳定。因此，确定
提取时间为 4 h。
2. 1. 4 提取温度
在提取溶剂体积分数 70%乙醇，提取时间 4 h，
液料比 15 mL /g，提取温度为 50、60、70、80、90℃的
条件下，研究温度对黄酮提取率的影响。由图 1c 可
以看出，在 50 ～ 60℃的范围内，黄酮提取率随温度
的增加迅速提高，70℃以后黄酮提取率开始缓慢下
降。究其原因，可能是高温促进了黄酮的氧化分解，
或使部分热溶性物质释放，干扰了测定的准确
性［9］。因此，选用 60℃为最佳提取温度。
2. 1. 5 液料比
在提取溶剂体积分数 70%乙醇，提取时间 4 h，
提取温度 60℃，液料比为 8、10、15、20、25 mL /g的条
件下，研究液料比对黄酮提取率的影响。
从图 1d可以看出，液料比从 8 mL /g开始，随着
溶剂体积的增加，黄酮提取率迅速增长，这是因为山
核桃果皮粉末与提取溶剂的接触面增大，黄酮类化
合物容易渗透出来［10］。液料比达到 15 mL /g 时，黄
酮提取率的增加速度开始减缓，液料比达到 20 mL /g
时，黄酮提取率仍有增加但增加的幅度有限。尽管
继续增加溶剂体积还可以提高黄酮提取率，但过多
的溶剂不仅增加了后续操作的负荷也增加了提取成
本。因此，选用液料比 15 mL /g为宜。
图 1 不同提取条件对黄酮提取率的影响
Fig． 1 Influence of different condition on extraction ration of flavone
2. 1. 6 正交试验结果
通过单因素试验，选出适宜的提取溶剂体积分
数、提取时间、提取温度和液料比进行正交试验，试
验结果如表 3 所示。
由正交试验结果得知，影响黄酮化合物提取率
的因素由大至小顺序为 A、D、C、B，即:提取溶剂体
积分数、液料比、提取温度、提取时间。根据各因子
K值可知，最佳组合方案为 A2B3C1D2，即提取溶剂
971第 12 期 陈向明 等:山核桃外果皮黄酮提取与纯化
体积分数为 70%乙醇，提取时间为 4 h，提取温度为
60℃，液料比为 15 mL /g时，所得黄酮提取率最高可
达 1. 14%。将黄酮粗提液减压浓缩至最小体积，冷
冻干燥得黄酮粗提样品，测得黄酮纯度为 62. 70%。
表 3 正交试验结果分析
Tab． 3 Results analysis of orthogonal experiments
试验
序号
溶剂体
积分数
A
提取
时间
B
提取
温度
C
液料比
D
提取
率 /%
1 1 1 1 1 0. 65
2 1 2 2 2 0. 89
3 1 3 3 3 0. 78
4 2 1 2 3 1. 06
5 2 2 3 1 0. 86
6 2 3 1 2 1. 14
7 3 1 3 2 0. 84
8 3 2 1 3 0. 80
9 3 3 2 1 0. 72
K1 0. 773 0. 850 0. 890 0. 743
K2 1. 020 0. 850 0. 863 0. 957
K3 0. 787 0. 880 0. 827 0. 880
R 0. 247 0. 030 0. 063 0. 214
2. 2 纯化条件
2. 2. 1 洗脱溶剂对黄酮解吸的影响
(1)黄酮静态解吸附性能比较
在 8 只 200 mL碘量瓶中按液固比 3 mL /g 分别
加入质量浓度为 1. 5 mg /mL 的黄酮粗提液和硅胶，
静置吸附 30 min 后抽滤，测定滤液中黄酮残余量。
用体积分数 20%、40%、60%、80%甲醇和体积分数
20%、40%、60%、80%乙醇各 200 mL，每瓶分 5 次洗
脱，收集洗脱液测定吸光度，计算黄酮洗脱量。重复
3 次取其平均值，结果如表 4 所示。
表 4 不同溶剂解吸黄酮试验结果
Tab． 4 Desorption results of different solvents
试验
指标
甲醇体积分数 /% 乙醇体积分数 /%
20 40 60 80 20 40 60 80
吸附量 /mg 3. 075 3. 108 3. 126 3. 114 3. 135 3. 087 3. 133 3. 092
洗脱量 /mg 0. 428 1. 362 1. 548 1. 378 0. 275 1. 872 2. 668 1. 544
洗脱率 /% 13. 92 43. 82 49. 52 44. 25 8. 77 60. 64 85. 16 49. 94
由表 4 可知，乙醇对黄酮的解吸效果总体上要
比甲醇好，体积分数 40%、60%、80%乙醇的洗脱率
分别为 60. 64%、85. 16%、49. 94%，其中体积分数
60%乙醇的洗脱率达到 85%以上，体积分数 20%乙
醇的洗脱率只有 8. 77%。说明乙醇是黄酮的适宜
洗脱剂，其体积分数为 40% ～80%。
(2)黄酮动态解吸附性能比较
在 5 cm ×60 cm玻璃色谱柱中，按液固比 3 mL/g
硅胶装柱，缓慢均匀地加入质量浓度为 1. 5 mg /mL
的黄酮粗提液于色谱柱，静置吸附 30 min 后抽滤，
测定滤液中的黄酮残余量。用体积分数为 0%(蒸
馏水)、20%、40%、60%、70%、80%、90% 乙醇各
200 mL 分 5 次进行梯度洗脱，以 2 mL /min 的流速
分段收集测定，得出洗脱剂体积分数与黄酮洗脱量
的动态解吸曲线，如图 2 所示。
图 2 黄酮动态解吸曲线
Fig． 2 Desorption curve of dynamic state on flavone
从黄酮解吸的动态曲线可知，体积分数 40%、
60%、70%乙醇均能有效洗脱硅胶色谱柱吸附的黄
酮，尤以体积分数 70%乙醇洗脱率最高，体积分数
20%和体积分数 80%乙醇也能少量洗脱吸附黄酮，
分别是 1. 21 mg 和 1. 28 mg。虽然蒸馏水与体积分
数 90%乙醇未能洗脱下黄酮，却能将黄酮中混有的
水溶性和醇溶性的杂质去除，起到纯化黄酮的作用。
经测定，洗脱下的黄酮总量为 33. 00 mg，总黄酮的
回收率达到 89. 46%。
2. 2. 2 洗脱流速对黄酮解吸的影响
按检测黄酮动态吸附性能方法装柱 5 支并上
样。选用体积分数 70%乙醇作洗脱剂，洗脱剂用量
各 100 mL，以 1、2、3、4、5 mL /min 的流速分别洗脱。
每收集 10 mL流出液测定黄酮洗脱量，评价 5 种洗
脱流速与黄酮质量的解吸关系，结果如图 3 所示。
图 3 不同洗脱流速下黄酮洗脱量与洗脱剂体积关系曲线
Fig． 3 Relation curves of flavones desorption and eluent
volume under different fluid speeds
试验表明，洗脱流速与黄酮洗脱量呈负相关关
系。首先，洗脱流速为 1 mL /min 时黄酮洗脱量最
多，流速为 2 ～ 5 mL /min 时黄酮洗脱量依次减少。
其次，洗脱流速为 1 ～ 2 mL /min 时的黄酮解吸峰出
现早，而 3 ～ 5 mL /min的解吸峰出现迟。另外，流速
慢的洗脱剂用量少，流速快的洗脱剂用量多。因为
081 农 业 机 械 学 报 2 0 1 1 年
流速慢使洗脱剂在硅胶柱上保留较长的时间，有利
于充分解吸附，流速快使洗脱剂尚未来得及解吸硅
胶上的黄酮便流出。从图 3 可以看出，流速 1 ～
2 mL /min的洗脱效率高，洗脱剂用量分别在 80、
90 mL时就将吸附黄酮大部或全部洗净;流速 3 ～
5 mL /min的洗脱效率较低，100 mL 洗脱剂全部用完
尚有黄酮未洗净。理论上洗脱剂用量越多吸附物洗
脱越彻底，但洗脱剂用量过多不仅造成浪费也会影
响后处理［11］。本试验确定 2 mL /min 为最佳解吸流
速，尽管 1 mL /min 流速黄酮解吸量最多，但相应也
延长了黄酮的收集时间。将上述收集液合并后减压
浓缩到最小体积，冷冻干燥得黄色固体粉末，测得黄
酮纯度为 84. 40%。
3 结论
(1)用体积分数 70%乙醇浸提山核桃外果皮、
液料比 15 mL /g、浸提温度 60℃、浸提时间 4 h时，黄
酮提取率达 1. 14%，粗提样品中的黄酮纯度为
62. 70%。
(2)用硅胶色谱柱层析，在液固比 3 mL /g、吸
附时间 30 min、70%乙醇洗脱、流速 2 mL /min 的条
件下，洗脱效果最好，黄酮回收率达 89. 46%;纯化
后的黄酮纯度为 84. 40%，比纯化前黄酮纯度提高
了 34. 6%。
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