全 文 ：三叶青相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系的建立与优化
纪其雄1， 彭 昕1* ， 吴晓菁2， 杨雄志1
(1． 浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100;2． 太极集团浙江东方制药有限公司，浙江 绍兴 312000)
收稿日期:2014-04-02
基金项目:2013 年浙江省公益性技术资助项目 (2013C32103);2013 年浙江省教育厅高校科研项目 (Y201330174)
作者简介:纪其雄 (1965—) ，男，硕士，讲师，研究方向为药学细胞工程。E-mail:ji_qixiong@ 126． com
* 通信作者:彭 昕，副教授，研究方向为分子生物学。E-mail:pengx@ mail． zjpc． net． cn
摘要:目的 建立浙江和江西产的三叶青 (Tetrastigma hemsleyanum)SＲAP-PCＲ的反应体系和扩增程序。方法 应用
L9 (3
4)正交设计方法，以三叶青基因组 DNA为模板，研究了 Mg2 +、dNTP、引物和模板 DNA 4 种 PCＲ反应组分浓
度变化对扩增结果的影响，根据梯度 PCＲ仪引物的条带数量及清晰度选择退火温度。结果 优化后的 25 μL 反应体
系包含:10 × PCＲ buffer2. 5 μL，2. 5 mmol /L MgCl2，0. 15 mmol /L dNTP，0. 15 μmol /L 引物，1. 0 U Taq DNA 聚合酶，
50 ng DNA模板。扩增程序的最佳退火温度为 51 ℃。并筛选出 8 对扩增产物丰富，多态性好的引物。结论 正交设计
优化的三叶青 SＲAP反应体系，经过 10 份样品检验，证明该体系稳定可靠，多态性好，可用于三叶青遗传多样性
分析。
关键词:三叶青;相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应 (SＲAP-PCＲ);正交设计
中图分类号:Ｒ282. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2015)03-0562-05
doi:10. 3969 / j． issn． 1001-1528. 2015. 03. 022
Establishment and optimization of SＲAP reaction system for Tetrastigma hems-
leyanum
JI Qi-xiong1， PENG Xin1* ， WU Xiao-jing2， YANG Xiong-zhi1
(1． Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China;2． Taiji Group Zhejiang East Pharmaceutical Co．，Ltd，Shaoxing 312000，China)
ABSTＲACT:AIM To establish the SＲAP reaction system and PCＲ procedures for Tetrastigma hemsleyanum，
collected from Zhejiang and Jiangxi Province，China． METHODS The orthogonal design was applied for optimi-
zing seven factors in the SＲAP-PCＲ reaction system，including Mg2 + concentration，dNTP concentration，primer
concentration，template DNA dosage，and Taq DNA polymerase dosage． The annealing temperature was chosen on
the base of band number and resolution in gradient PCＲ apparatus． ＲESULTS The optimal reaction system for
ISSＲ analysis comprised 2. 5 mmol /L MgCl2，0. 15 mmol /L dNTP，0. 15 μmol /L primers，50 ng of template
DNA，and 1 U of Taq DNA polymerase in 25 μL total volume． Proper annealing temperature was 51 ℃ ． Eight
pairs of primer which had rich products and high polymorphism were selected． CONCLUSION SＲAP-PCＲ reac-
tion system for T． hemsleyanum is established and optimized in this study，which is supported using 10 germ-
plasms，these results shows that the SＲAP-PCＲ reaction system is stable and can be used for the genetic analysis of
T． hemsleyanum．
KEY WOＲDS:Tetrastigma hemsleyanum;SＲAP-PCＲ;orthogonal design
三叶青 Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg 为
葡萄科崖爬藤属植物，是我国独有的珍稀药用植
物，是抗肿瘤常用药物［1-2］，也可用于治疗风湿性
关节炎、肝炎、高热及病毒性脑膜炎等多种疾病。
目前该植物野生资源濒临灭绝，其组培快繁技术虽
有包括本课题组在内的一些探索［3-6］，但技术尚不
够成熟，满足不了临床需求。用分子标记的方法研
究物种间亲缘关系及种内遗传多样性，可为品种鉴
别、良种选育、基因资源保护与利用等提供科学依
据。而三叶青遗传多样性的评价及 DNA 指纹图谱
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建立方面尚未见报道。
目前使用最广泛的 DNA 分子标记技术有
ＲFLP、ＲAPD、ISSＲ、AFLP、SNP 和 SＲAP等。其
中 SＲAP 标记 (sequence-related amplified polymor-
phism)是 2001 年由 Li 等［7］提出的基于聚合酶链
式反应 (PCＲ)的一种标记。基本原理是利用特殊
的引物设计方式实现对 OＲFs (开放阅读框架)的
扩增，正向引物中的核心序列 CCGG 锚定 OＲF 区
的外显子;反向引物中的核心序列 AATT锚定内含
子与启动子。因不同个体的内含子、启动子及其间
隔区长度不等而产生多态性，从而扩增出丰富的
SＲAP 多态性标记，具有多态性高，重复性好，操
作简单等特点，是一种比较理想的新型分子标记。
本研究拟对影响三叶青 SＲAP-PCＲ 反应体系的
Mg2 +，dNTP，模板 DNA 水平，TaqDNA 聚合酶，
引物浓度，退火温度等因素进行优化实验，旨在建
立适用于三叶青的 SＲAP-PCＲ反应体系，为今后进
一步开展三叶青种质资源遗传多样性研究、遗传图
谱构建和品种鉴定等工作奠定实验基础。
1 材料与仪器
本实验所有试剂及合成引物均购自上海生工生
物工程有限公司，10 个 SＲAP 正向引物和 10 个
SＲAP 反向引物序列见表 1。Eppendorf Master cycler
梯度 PCＲ 仪 (德国 Eppendorf 公司)，Gel Doc XＲ
+ 紫外凝胶成像分析仪 (美国 Bio-Ｒad 公司) ，高
速冷冻离心机 (杭州纳德公司) ，Sub-Cell 系统水
平电泳槽 (美国 Bio-Ｒad 公司)。
表 1 三叶青 SＲAP标记分析的待选引物序列
Tab. 1 Primer sequence for SＲAP analysis of T． hemsley-
anum
SＲAP引物序列
正向引物 (5-3) 反向引物 (5-3)
Me1 TGAGTCCAAACCGGATA Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Me2 TGAGTCCAAACCGGAGG Em2 GACTGCGTACGAATTTGC
Me3 TGAGTCCAAACCGGAAT Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
Me4 TGAGTCCAAACCGGACC Em4 GACTGCGTACGAATTAAC
Me5 TGAGTCCAAACCGGAAG Em5 GACTGCGTACGAATTGCA
Me6 TGAGTCCAAACCGGACA Em6 GACTGCGTACGAATTCAA
Me7 TGAGTCCAAACCGGACG Em7 GACTGCGTACGAATTGAC
Me8 TGAGTCCAAACCGGACT Em8 GACTGCGTACGAATTCAT
Me9 TGAGTCCAAACCGGAGG Em9 GACTGCGTACGAATTCTA
Me10 TGAGTCCAAACCGGAAA Em10 GACTGCGTACGAATTGTC
本实验所采用的三叶青材料，其中编号zj1 ～
zj6 的采自浙江丽水，编号 jx1 ～ jx4 的采自江西弋
阳，经丽水农科院吉庆勇高级农艺师和浙江医药高
等专科学校杨雄志教授鉴定为 Tetrastigma hemsleya-
num Diels et Gilg。
2 方法
2. 1 基因组 DNA 的提取与检测 三叶青基因组
DNA提取采用改良 CTAB法［8］，经 1%琼脂糖凝胶
电泳和微量核酸蛋白检测仪检查总 DNA 浓度及其
完整性，并用双蒸水稀释至 50 ng /μL 备用。
2. 2 SＲAP-PCＲ 扩增程序及反应体系 扩增程序
为:95 ℃预变性 5 min，(94 ℃ 40 s，40 ℃ 1 min，
72 ℃ 1 min)5 循环， (94 ℃ 40 s，50 ℃ 1 min，
72 ℃ 1 min)35 循环，72 ℃延伸 10 min。PCＲ 产
物经含 0. 05% EB 的 2. 2% 琼脂糖凝胶电泳分离，
电极缓冲液为 1 × TAE，电泳电压 5 V /cm，紫外凝
胶成像分析仪内观察、拍照。原初扩增反应体系
为:25 μL PCＲ 反应，10 × 缓冲液 2. 5 μL，2. 5
mmol /L MgCl2，1U Taq 酶，25 ng 模板 DNA，0. 2
μmol /L引物，0. 1 mmol /L dNTP。
2. 3 退火温度的筛选 先根据原初的 PCＲ 反应条
件进行引物的初筛，选择能看到清晰条带的引物组
合 Me3 和 Em5 对退火温度进行考察。
2. 4 SＲAP-PCＲ 反应体系的正交试验设计 采用
L9(3
4)正交设计，对 Mg2 +、引物、dNTP 和模板
DNA进行四因素三水平筛选，见表 2，每个处理 3
个重复，用 Quantity one 分析软件对实验结果按照
特异性条带强弱进行处理，特异条带强、清晰度
高、背景低的记为 9 分，与之相反最差的记分为
1，其他的与其相比取整数值，对其从高到低依次
打分［9-10］。
表 2 SＲAP -PCＲ 反应 L9(3
4)正交设计
Tab. 2 L9(3
4)orthogonal design for the factors and levels
of SＲAP -PCＲ reaction
处理
组合
因素
Mg2 +浓度 /
(mmol·L －1)
引物浓度 /
(mmol·L －1)
dNTP /
(mmol·L －1)
模板DNA
量 /ng
得分
重复 1 重复 2 重复 3
1 1. 5 0. 15 0. 15 25 2 1 1
2 1. 5 0. 2 0. 2 50 5 6 5
3 1. 5 0. 25 0. 25 75 4 4 3
4 2 0. 15 0. 2 75 6 5 7
5 2 0. 2 0. 25 25 3 3 4
6 2 0. 25 0. 15 50 7 7 6
7 2. 5 0. 15 0. 25 50 8 9 8
8 2. 5 0. 2 0. 15 75 9 8 9
9 2. 5 0. 25 0. 2 25 1 2 2
2. 5 体系稳定性和多态性验证 利用以上筛选出
来的优化扩增条件对 10 份三叶青材料对反应体系
的稳定性和多态性进行验证，每个材料重复 3 次。
3 结果与分析
3. 1 退火温度筛选实验结果 退火温度过低可能
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引起引物与模板错配，非特异性产物扩增，温度过
高引物不能与模板牢固结合，DNA 扩增效率下降。
由梯度 PCＲ仪自动生成的 8 个不同退火温度对引
物组合 Me3 和 Em5 扩增结果的影响见图 1，从图
中可以看出，虽然各温度均能扩增出条带，但条带
数量及清晰度有明显区别，43 ～ 45. 7 ℃时主要扩
增出分子质量大的一些条带，而且条带较为弥散，
53. 8 ～ 56 ℃较高温度时主要扩增出分子质量小的
条带，条带清晰，但副带逐渐减少，48. 4 ～ 51 ℃
时扩增出的条带数量最多而且条带清晰度较高，考
虑较高退火温度有利于减少杂带的产生，因此，选
择 51 ℃为三叶青 SＲAP扩增最佳退火温度。
泳道 1． DNA marker 泳道 2 ～ 9． 退火温度分别为 43 ℃，44 ℃，
45. 7 ℃，48. 4 ℃，51. 0 ℃，53. 8 ℃，55. 1 ℃，56 ℃
Lane 1． DNA marker Lane 2-9． The annealing temperature was 43 ℃，
44 ℃，45. 7 ℃，48. 4 ℃，51. 0 ℃，53. 8 ℃，55. 1 ℃，56℃，re-
spectively
图 1 退火温度对三叶青 SＲAP扩增的影响
Fig. 1 Effect of annealing temperature on T． hemsleya-
num SＲAP amplification
3. 2 正交试验结果 三叶青 SＲAP-PCＲ 正交试验
结果见表 2，表 3 和图 2。利用 SPSS 17. 0 将上述
记分结果进行方差分析和多重比较分析，结果表
明，Mg2 +浓度、dNTP、引物浓度及模板 DNA 浓度
均对扩增结果有显著的影响 (P ＜ 0. 05)。均方差
显示各因素对结果影响的主次顺序为:DNA 模板
浓度 ＞ Mg2 +浓度 ＞引物浓度 ＞ dNTPs，进一步对各
因素的不同水平进行多重比较，见表 4，Mg2 +浓度
三个水平之间差异均达到显著水平，P 值分别为
0. 000 (1. 5 与 2 mmol /L 之间)、0. 000 (1. 5 与
2. 5 mmol /L之间)和 0. 003 (2 与 2. 5 mmol /L 之
间)，结合表 2 中 PCＲ 结果均值可知 2. 5 mmol /L
为最适合 Mg2 +浓度。引物浓度在 0. 25 μmol /L 与
其它两个水平之间有显著差异，P 值分别为 0. 001
(0. 15 和 0. 25 μmol /L 之间)和 0. 000 (0. 2 与
0. 25 μmol /L 之间)0. 15 和 0. 2 μmol /L 之间为
0. 069，没有显著差异，结合表 4 中不同处理水平
结果均值可知引物 0. 15 或 0. 2 μmol /L均为较佳浓
度，考虑成本确定引物最佳浓度为 0. 15 μmol /L。
0. 15 和 0. 25 mmol /L dNTP浓度之间没有显著差异
(P值为 0. 139)，结合表 4 中不同处理水平结果均
值可知 0. 15 mmol /L为最适 dNTP浓度。模板 DNA
浓度三个水平间均有显著差异，P 值分别为 0. 000
(25 与 50，25 与 75) ，0. 032 (50 和 75 之间) ，结
合表 4 中不同处理水平结果均值可知 50 ng 为最适
模板用量。综上所述，Mg2 +浓度 2. 5 mmol /L，引
物浓度 0. 15 μmol /L，dNTPs 0. 15 mmol /L，DNA模
板 50 ng为三叶青 SＲAP-PCＲ的最佳反应体系。
泳道 1． DNA marker 泳道 2 ～10． 分别对应表 2中的实验组合 1 ～9
Lane 1． DNA marker Lane 2 － 10． correspond to Tab． 2
图 2 L9(3
4)正交设计 SＲAP扩增结果
Fig. 2 Electrophoresis of L9(3
4)orthogonal design
表 3 正交试验中各因素方差分析
Tab. 3 Analysis of variance for factors of orthogonal design
变异来源 自由度 均方 F值 显著水平
Mg2 +浓度 2 19. 370 52. 30* 0. 000
引物浓度 2 6. 481 17. 50* 0. 000
dNTPs 2 2. 815 7. 60* 0. 004
DNA模板浓度 2 54. 481 147. 10* 0. 000
误差 18 0. 370 0
注:* P ＜ 0. 05
表 4 各因素不同处理水平结果均值差异显著性
Tab. 4 Significance among the means of different factor levels
因素
水平
1 2 3
Mg2 +浓度(mmol /L) 3. 44a 5. 33b 6. 22c
引物浓度(μmol /L) 5. 22a 5. 78a 4b
dNTP(mmol /L) 5. 56a 4. 33b 5. 11a
模板 DNA量(ng) 2. 11a 6. 78b 6. 11c
注:同一行不同小写字母表示不同水平间结果差异显著，
P ＜ 0. 05
3. 3 引物筛选 在优化 PCＲ 反应体系的基础上，
以扩增出的条带清晰度高，多态性好，重复性好为
原则，从 100 对引物中筛选出 8 对引物组合
(表 5)。
3. 4 体系稳定性和多态性验证 从图 3 可见，引
物组合 Me3 和 Em5 可以 10 份种质材料中扩增出清
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图 3 三叶青 SＲAP优化体系的稳定性检测图谱 (Me3-Em5 引物组合)
Fig． 3 SＲAP-PCＲ profiles of 10 DNA samples from T． hemsleyanum with primer combination Me3-Em5
表 5 筛选出的三叶青 SＲAP标记分析的引物组合
Tab. 5 Primer sequence screened for SＲAP analysis of
T． hemsleyanum
SＲAP 引物序列
正向引物 (5-3) 反向引物 (5-3)
Me3 TGAGTCCAAACCGGAAT Em5 GACTGCGTACGAATTGCA
Me5 TGAGTCCAAACCGGAAG Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Me5 TGAGTCCAAACCGGAAG Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
Me6 TGAGTCCAAACCGGACA Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Me6 TGAGTCCAAACCGGACA Em5 GACTGCGTACGAATTGCA
Me7 TGAGTCCAAACCGGACG Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Me7 TGAGTCCAAACCGGACG Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
Me10 TGAGTCCAAACCGGAAA Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
晰度高、多态性较高、重复性好的 DNA 条带。这
表明经过优化后建立的 SＲAP-PCＲ 反应体系稳定
可靠。
4 讨论
SＲAP是近年来出现的一种新型分子标记技
术，它既克服了 ＲAPD重复性差的缺点，又克服了
ＲFLP、AFLP成本昂贵、技术复杂的缺点，目前广
泛用于物种 DNA 指纹图谱构建［11］、品种鉴别［12］、
亲缘关系分析［13］、遗传多样性分析［14］及分子辅助
遗传育种等。但作为一种基于 PCＲ 的技术，结果
受到反应体系和扩增程序的影响，为提高其稳定性
和可靠性，对其反应条件进行优化是非常必要的。
扩增程序的设置中退火温度的确定通常是至关
重要的因素之一，退火温度过高严重影响扩增产物
数量及条带数，而退火温度过低则可能增加模板与
引物之间非特异性的结合。本研究采用单因子梯度
实验的方法确定了所筛选出引物的最佳退火温度。
多项研究［15-16］表明，PCＲ 反应体系中各因素之间
往往存在着交互效应，因此，本研究采用正交设计
法对 PCＲ反应体系中各影响因素进行了筛选。大
多数实验［12，15］表明合适用量的 Taq 酶对 PCＲ 反应
结果没有显著影响，且本研究对 Taq酶用量做了初
步梯度实验，未发现其对 PCＲ 结果有明显影响，
因此，本次正交设计中未将其纳入影响因素的研究
对象。正交试验的方差分析结果表明其余四个因素
中 DNA模板浓度对 PCＲ扩增影响最大，DNA用量
为 25 ng时虽然主带清晰，但副带数量明显最少，
DNA 用量在 75 ng时，条带数目虽然最多，但是背
景模糊，条带清晰度不高，在适中水平 50 ng 时背
景干扰低、谱带多态性高、主带清晰、副带明显。
可能是当 DNA 用量过少时一些低拷贝的基因片段
扩增量不足，而 DNA 用量过高时，非特异性条带
的扩增增强，因此背景模糊，主带清晰度降低，与
王新民在杉木上［15］的研究结果一致，然而这与怀
地黄［11］、山葡萄［12］实验中得出的模板浓度对 IS-
SＲ-PCＲ 扩增结果的影响最不显著的结论不同，这
可能是由于本实验中所采用的模板浓度恰在其扩增
的阈值范围，也可能是因为所采用的植物基因组不
同，与引物配对的区域和严格程度不同。Mg2 +是
保证 Taq 酶活性必需的激活剂，浓度过低会导致产
物产量降低，过高则会引起非特异性扩增，适宜的
浓度一般为 0. 5 ～ 2. 5 mmol /L。本实验中，Mg2 +浓
度过低时，出现条带缺失、亮度减弱等现象，而
Mg2 +浓度较高时，虽未出现明显的非特异性条带，
但背景明显模糊，扩增出的条带清晰度明显下降。
引物浓度过低会影响产物形成，但过高容易形成引
物二聚体或引起其他非特异性扩增，虽然本研究所
选较适中的浓度范围内条带数量不足以产生明显变
化，但条带的亮度和清晰度出现了一定程度的变
化，引物浓度过低或过高都使条带较弥散模糊，可
能是因为降低了模板与引物特异性的配对。
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dNTP 是 PCＲ 反应中靶序列扩增的原料，浓度
过低不足以完成设定的循环数就提前终止反应，影
响扩增结果，而浓度过高则可能导致 PCＲ 错配，
从而出现非特异性扩增，同时浓度过高也会与 Taq
酶竞争 Mg2 +，造成酶活性降低，出现无扩增产物
的现象［12］。本研究虽然 dNTP 的浓度对结果的影
响也达到显著的水平，但其是四个因素中最次要的
因素，它对 PCＲ 结果的影响仅在于条带亮度的区
别，对条带的数量及背景的清晰度没有显著影响，
与西洋杜鹃［14］的 SＲAP研究上所得出的结论一致。
确定了最佳反应条件后采用了 10 份样品对其
进行验证，得到了清晰稳定的扩增图谱，虽然样品
数量有限，且 10 份样品仅来源于浙江和江西两个
种源地，但该图谱中所扩增出的 10 条带中，多态
性条带仍有 4 条，多态性比率达到 40%，因此，
本实验优化的 SＲAP-PCＲ反应适合后续用于三叶青
遗传多样性分析及遗传图谱的构建。
参考文献:
［1］ Xu C J，Ding G Q，Fu J Y，et al． Immunoregulatory effects of
ethyl-acetate fraction of extracts from Tetrastigma Hemsleyanum
Diels et． Gilg on immune functions of ICＲ mice［J］． Biomed
Environ Sci，2008，21:325-331．
［2］ 王小莉，曾 娟，周 辉． 三叶青提取物对肺癌细胞株
A549 的影响［J］． 肿瘤药学，2012，2(5) :347-349．
［3］ Dai Y J，Shen Z G，Liu Y，et al． Effects of shade treatments on
the photosynthetic capacity，chlorophyll fluorescence，and chlo-
rophyll content of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg［J］．
Environ Exp Bot，2009，65:177-182．
［4］ 彭 昕，张 剑，何军邀，等． 三叶青松散型和致密型愈
伤组织悬浮培养及黄酮积累的比较研究［J］． 中草药，
2012，43(3) :577-580．
［5］ Peng X，Zhou S L，He J Y，et al． Influence of rare earth ele-
ments on metabolism and related enzyme activity and isozyme
expression in Tetrastigma hemsleyanum cell suspension cultures
［J］． Biol Trace Elem Ｒes，2013，152(1) :82-90．
［6］ 彭 昕，汪荣斌，何军邀，等． 三叶青颗粒状愈伤组织悬
浮培养系的建立及培养条件的优化［J］． 中成药，2012，34
(5) :961-964．
［7］ Li G，Quiros C F． (2001)Squence-related amplified polymor-
phism (SＲAP) ，A new marker system based on a simple PCＲ
reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica
［J］． Theor Appl Genet，103:455-461．
［8］ Wang M，Oppedijk B J，Lu X，et al． Apoptosis in barley aleu-
rone during germination and its inhibition by abscisic acid［J］．
Plant Mol Biol，1996，32(6) :1125-1134．
［9］ 孙清信，陈 坚，张 辉． 紫云英 ISSＲ 引物的筛选及
PCＲ 反应体系的优化［J］． 植物遗传资源学报，2012，13
(5) :870-878．
［10］ 廖 丽，郭巧生． 夏枯草 ISSＲ分子标记技术的建立与体系
优化［J］． 中草药，2009，40(7):1131-1135．
［11］ 谷凤平，周春娥，路淑霞，等． 怀地黄 SＲAP 分子标记体
系的建立与 DNA 指纹图谱的构建［J］． 河南师范大学学
报:自然科学版，2009，37(3) :175-177．
［12］ 金炳奎，宗成文，曹后男，等． 山葡萄 SＲAP 技术体系的
建立及其在品种鉴定中的应用［J］． 吉林农业大学学报，
2013，35(2) :198-205．
［13］ 李永平，康建坂，林 珲，等． 10 个佛手瓜栽培品种亲缘
关系的 SＲAP分析［J］． 福建农林大学学报:自然科学版，
2012，41(6) :590-594．
［14］ 吴月燕，陶巧静，李 波，等． 西洋杜鹃 SＲAP 体系优化
及遗传多样性分析［J］． 浙江农林大学学报，2013，30
(6) :844-851．
［15］ 王新民，郑仁华，陈金慧，等． 杉木 SＲAP-PCＲ 体系优化
［J］． 南京林业大学学报:自然科学版，2014，38(1) :
15-20．
［16］ 牛 田，张 林，王厚新，等． 春兰 SＲAP-PCＲ 反应体系
的建立和优化［J］． 农学学报，2013，3(11) :25-29．
665
2015 年 3 月
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中 成 药
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