全 文 ：◎研究原著 ◎ 中国临床药理学与治疗学中国药理学会主办
CN 34-1206 R , ISSN 1009-2501
E-mail:ccpt96@21cn.com
2006 Jun;11(6):669-672
2006-05-06收稿　2006-06-13修回
浙江省中医管理局科研基金资助项目(№2004C025)
冯正权 ,男 , 医学博士 ,主治医师 ,研究方向:中医药防治肿瘤转移复
发的分子机理。
Tel:0571-87070931 　E-mail:fzhq213@yahoo.com.cn
三叶青黄酮诱导 SGC-7901胃癌细胞凋亡的实验研究
冯正权 ,倪克锋1 ,何 煜2 ,丁志山2 ,朱 峰2 ,吴良村 ,沈敏鹤
浙江省中医院肿瘤科 ,杭州 310006 ,浙江;1浙江中医药大学 03级博士 , 2浙江中医药大学 , 杭州 310006 ,浙江
摘要　目的:观察三叶青黄酮对 SGC-7901人胃癌细
胞凋亡的诱导作用 ,初步探讨其可能的机制。方法:
体外培养 SGC-7901人胃癌细胞 ,并用 MTT 法检测
三叶青黄酮对肿瘤细胞生长的抑制作用 ,流式细胞
仪分析细胞周期 , 光镜和电镜观察细胞形态改变 ,
酶谱分析基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白的表达改
变。结果:三叶青黄酮能显著地抑制SGC-7901细胞
的生长 ,并且具有浓度依赖性 ,且细胞有明显的凋亡
特征性改变 ,并能降低细胞上清液中 MMP-2的含
量。结论:三叶青黄酮具有抗肿瘤细胞增殖和诱导
凋亡的作用 ,有潜在的抗肿瘤价值 , 值得进一步研
究。
关键词　三叶青黄酮;肿瘤;细胞凋亡;基质金属蛋
白酶 2
中图分类号:R965.1;R735.2
文献标识码:A
文 章 编 号:1009-2501(2006)06-0669-04
三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)具
有清热解毒 、祛风化痰 、活血止痛的功效[ 1] 。临床多
用于治疗小儿高热惊厥 、肺炎等症 ,现常用来防治各
类肿瘤。吴良村教授运用三叶青为主药用于肿瘤临
床 ,发现在抑制肿瘤生长 ,延缓病人的生命 ,改善生
命征象方面有独特的效果 。但作为临床常用药 ,三
叶青并没有得到应有的重视 ,既没有理化研究 ,也没
有质量标准。本研究前期对三叶青的成分进行提取
分离和鉴定分析 ,发现三叶青富含黄酮。大量的研
究表明 ,生物类黄酮大多具有良好的抗肿瘤作用 。
为进一步探讨三叶青抗肿瘤作用的机制 ,更好地开
发 、利用三叶青 ,本实验研究了三叶青黄酮对肿瘤细
胞增殖抑制 、诱导凋亡和细胞上清液基质金属蛋白
酶-2(MMP-2)浓度的影响 。
1　材料与方法
1.1　药品和细胞　三叶青购自浙江省中医院药房。
SGC-7901人胃癌细胞株购自中国科学院上海细胞
生物学研究所 ,由浙江中医药大学细胞实验室传代。
1.2　三叶青黄酮的提取 、分离和制备　称取三叶青
块根 1 000 g ,采用碱性稀醇提取法[ 2] 提取得三叶青
黄酮 7.6 g 。聚酰胺柱层析[ 2]后 ,分别用 10%、30%、
50%、70%、95%的乙醇洗脱 ,回收得浓缩物真空干
燥至恒重 ,分别标记为 HT10 、HT30 、HT50 、HT70 和
HT95。分别称取 HT10 、HT30 、HT50 、HT70 和 HT95
各 2 mg ,溶解于 200μl二甲基亚砜中 ,旋涡震荡 ,全
部溶解后 ,加入 800 μl RPMI1640培养液旋涡震荡混
匀后 放置于 4 ℃ 冰箱 保存备用 , 终 浓度为
10 mg·ml-1 。
1.3　细胞培养方法　将 SGC-7901 细胞接种于含
10%胎牛血清 、100 U·ml-1青霉素和 100 U·ml-1链
霉素的 PPMI1640培养液中 , 37 ℃、5% CO2 、饱和湿
度的培养箱中培养 ,每 2 ～ 3 d 换液 1次 ,长满后常
规胰蛋白酶消化法传代培养 。
1.4　MTT法观察三叶青黄酮对肿瘤细胞增殖的抑
制　用含 10%FBS 的 1640培养液培养的胃癌细胞
株 SGC-7901以 6×103 孔接种于 96孔板 , 37 ℃5%
CO2 的培养箱中培养 24 h 后 , 分别加入 HT10 、
HT30 、HT50 、HT70和 HT95 ,各自加入 5 、10 、15 、20和
25μl共 5个剂量 ,每剂量组 6 复孔 ,设不加任何药
物为对照。继续培养 48 h 后 ,观察细胞形态的变
化 。加入MTT 孵育 4 h ,吸弃上清液 ,加入二甲亚砜
150μl震荡 10 min , 570 nm 处测 OD 值 ,计算抑制
率 。
·669·
1.5　三叶青黄酮诱导肿瘤细胞凋亡的观察
1.5.1　光学显微镜观察　在 6孔培养板中放入盖
玻片 ,每孔接种 6×105 个 SGC-7901细胞 , 24 h 后 ,
分别加入 HT10 、HT30 、HT50 、HT70和 HT95 ,加入量
分别为 80 、160 、240和 320μl ,设不加任何药物为对
照 ,继续培养 48 h ,盖玻片上细胞进行苏木素-依红
染色 ,光镜下观察并照相 。
1.5.2　透射电镜观察　在 100 ml 培养瓶中接种 6
×106 个 SGC-7901 细胞 , 24 h 后分别加入 HT10 、
HT30 、HT50 、HT70和 HT95 ,浓度和对照组设立同上 。
处理 24 h 后收集细胞:弃去培养瓶内的上清液 ,用
D-Hank s 液冲洗瓶壁 3 次 ,用滴管轻轻地吹打瓶
壁 ,使瓶壁上细胞全部脱落 ,然后 ,将其移至离心管 ,
1 000 r·min-1离心弃去上清液 , 加 2.5%戊二醛
5 ml ,轻轻地吹打使细胞分散 , 0 ℃ ～ 4 ℃ 静置
30 min 后 , 1 000 r·min-1离心 10 min;弃去上清液 ,
铲下细胞团块 , 包在擦镜纸中 , 用 pH 7.4 的
0.1 mol·L-1磷酸缓冲液浸洗3次 ,间隔 15 min;将细
胞加 1%四氧化锇固定 1 h ,脱水 、包埋制成超薄切
片 ,透射电镜下观察照相 。
1.5.3　流式细胞仪检测细胞凋亡(Annexin Ⅴ PI)　
用HT50(加入量为 160 μl)处理 SGC-7901 细胞(0.5
×106 ～ 1×106),分别于 12 、24 、48 h 收集细胞 ,用预
冷PBS 洗2次后参照Annexin Ⅴ试剂盒产品说明书
方法操作并上 FACScan流式细胞仪定量检测。重复
3次 ,所得资料经CellQuest软件分析。
1.6 　酶谱法检测细胞上清液基质金属蛋白酶
MMP-2的表达　将培养的 SGC-7901细胞以 6×103
孔接种于 96 孔板 , 37 ℃5% CO2 的培养箱中培养
24 h后 ,加入 HT50 ,加入量分别为 5 、10 、15 、20 和
25 μl ,每剂量组 6复孔 ,设不加任何药物为对照。继
续培养 48 h。
根据 Kleiner等[ 3] 方法并加以改进 ,取细胞培养
上清液 30μl 分别于上样含 10 mg·ml-1明胶的
7.5%的聚丙烯酰胺凝胶于 40 mA 直流电下电泳至
溴酚蓝染料达到凝胶底部 ,停止电泳。
取出凝胶用 2.5%Triton 100 洗 3 次 , 每次
30 min ,然后将凝胶置于凝胶孵育液中 37 ℃孵育
20 h。考马斯亮蓝染色 2 h ,脱色至合适的亮度。凝
胶成像系统观察拍照并保存。
1.7　统计学处理　采用 SPSS 11.0软件 ,不同药物
浓度组间的比较采用完全随机设计的方差分析 ,各
药物浓度组与对照组的比较采用 Dunnett t 检验 ,以
α=0.05 为检验水准。
2　结果
2.1　三叶青黄酮对 SGC-7901细胞增殖的抑制作用
从图表 1可以看出 ,不同浓度乙醇层析分离的三叶
青黄酮(HT10 、HT30 、HT50 、HT70和 HT95)均能抑制
SGC-7901细胞的增殖;随着药物浓度的增加 ,其生
长抑制作用增强 ,呈剂量-效应关系。其中 HT50抑
制细胞增殖作用最强 ,随着加入药物浓度的增加 ,其
对 SGC-7901 细胞生长抑制率分别为 24.7%、
44.4%、59.8%、64.6%和 74.7%。还可以看到 5种
黄酮类化合物的抑制肿瘤细胞增殖强度从大到小分
别为HT50>HT30>HT70≥HT95>HT10。
图 1　三叶青提取物对 SGC-7901增殖抑制作用
2.2　三叶青黄酮促进 SGC-7901细胞凋亡
2.2.1　光学显微镜检测　三叶青黄酮处理 SGC-
7901细胞后 ,细胞发生凋亡 。细胞涂片染色光学显
微镜下观察:凋亡细胞体积变小 、变形 ,细胞间连接
消失 ,细胞核固缩 、核碎裂 、可见凋亡小体 ,细胞数目
也有所减少 ,而对照组 SGC-7901细胞形态学无明显
变化(图 2)。
2.2.2　电子显微镜检测　对照组细胞着色浅 ,核仁
丰富 ,细胞形态完整;三叶青黄酮用药组胃癌细胞可
见细胞体积变小 ,细胞质浓缩 ,出现许多称为气穴现
象(cavitations)的空泡结构 ,细胞核呈月牙状 ,染色质
浓缩凝聚成块 、固缩 、边缘化 ,凋亡晚期细胞核裂解
成碎块 、产生凋亡小体(图 3)。
2.2.3　流式细胞术检测　以 HT50低浓度(加入量
为 160 μl)处理SGC-7901细胞后 ,分别于12 、24 、48 h
后进行Annexin V PI染色 ,流式细胞仪检测 ,结果显
示SGC-7901细胞凋亡率(Annexin Ⅴ+ , PI-)分别为
10.17%、13.89%和 19.22%, 而对照组分别为
·670· Chin J Clin Pharmacol Ther 2006 Jun;11(6)
1.05%、1.53%、2.28%;三叶青黄酮诱导 SGC-7901
细胞凋亡的发生表现为时间-效应关系 ,流式细胞检
测进一步证实三叶青黄酮具有明显诱导 SGC-7901
细胞发生凋亡的活性。图 4显示作用 48 h 后HT50
处理组和对照组细胞凋亡情况 ,可见 HT50处理组
右下象限细胞较对照组明显增多。
图 2　光学显微镜下 SGC-7901 细胞形态学(HE, ×400)
图 3　电子显微镜下 SGC-7901 细胞形态学(×3700)
图 4　流式细胞术检测细胞凋亡情况
2.3　三叶青黄酮能降低 SGC-7901 细胞上清液中
MMP-2 的浓度 　酶谱成像结果(如图 4 所示),
MMP-2为位于蓝色背景上最下方的透亮带 ,其上方
的两条透亮带考虑为MMP-7 、MMP-9 ,从图上可以清
晰地看到 MMP-2随着 HT50给药浓度的递增 ,其亮
度和面积呈逐级下降趋势。
图 5　HT50 对 SGC-7901 细胞上清液中 MMP-2 浓度的影响
1 、2 、3 、4、5和 6分别为对照组加入 5、10 、15 、20和 25μl HT50黄酮组
3　讨论
本实验经层析分离各浓度乙醇洗脱 ,成功获得
了 5种不同的三叶青黄酮 ,对其影响 SGC-7901胃癌
细胞增殖 、凋亡及可能机理进行了初步探讨 。发现
5组均具有直接抑制肿瘤细胞增殖作用 ,且呈浓度-
效应正相关。HT50 、HT30抑制作用强 。光学显微镜
·671·中国临床药理学与治疗学 2006 Jun;11(6)
和电子显微镜检测显示细胞出现比较典型的凋亡形
态特征;流式细胞术 Annexin Ⅴ PI双染色进一步观
察到三叶青黄酮能促进 SGC-7901细胞调亡 ,结果提
示三叶青黄酮促进 SGC-7901 胃癌细胞的凋亡是其
抑制肿瘤细胞生长的主要途径之一 。
研究发现Ⅳ型胶原酶尤其是 MMP-2与肿瘤的
关系尤为密切 ,在大多数恶性肿瘤细胞和临近基质
细胞中MMP-2表达明显增高 ,而肿瘤组织中MMP-2
水平与肿瘤及其预后具有相关性[ 4, 5] 。本研究选择
MMP-2为肿瘤细胞侵袭 、转移相关蛋白指标 ,通过酶
谱分析技术观察三叶青黄酮对细胞上清液 MMP-2
蛋白的影响 ,初步探讨其作用机理 。
酶谱分析技术在鉴定蛋白复合物中的成分上有
一定的优势 ,因为其基于一个蛋白复合物中不同蛋
白的分子量和迁移率能够鉴定出其中的金属蛋白
酶 ,并可通过图像分析处理对酶进行定量分析 。遗
憾的是本研究没有MMPs的 Marker ,不能通过图像
分析处理系统对酶进行定量分析。三叶青黄酮能下
调肿瘤细胞上清液中基质金属蛋白酶 MMP-2 蛋白
的浓度 ,并呈剂量-效应正相关 ,说明通过下调MMP-
2的表达而抑制肿瘤的生长 、侵袭和转移 ,可能也是
三叶青黄酮抗肿瘤的主要途径之一 。作者前期研究
发现吴良村教授治疗肿瘤验方中另一常用药物黄
芩 ,体外对人乳腺癌细胞 BAP37有一定抑制增殖作
用 ,并能下调 TIMP2的表达[ 6] 。因此 ,本研究设想调
控肿瘤细胞MMPS TIMPS表达可能是该方的主要作
用靶点 。为进一步认识中药组方抗肿瘤机理的研究
提供了新的思路。为临床应用推广中药组方治疗肿
瘤提供了可靠的实验依据。
参 考 文 献
1　中国医学科学院药物研究所 , 北京医学院 , 南京药学院 ,
等.中药志(第二册)[ M] .北京:人民出版社 , 1984:219
2　肖崇厚主编.中药化学[ M] .上海:上海科学技术出版社 ,
2000:265-329
3　Kleiner DE , Stetler StevensonWG.Quantiative zymography:de-
tection of piogram quantities of gelatinase[ J] .Anal Biochem ,
1994;218:325-32
4　Matrisian LM.The matrix-degrading metalloproteinase [ J] .
Bioessays , 1992;14:455-63
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cancer sera[ J] .Br J Cancer , 2004;90:1414-21
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表达 TIMP2 的实验研究[ J] .中国临床药理学与治疗学 ,
2005;10:705-7
Experimental study on effect of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg
flavone on inducing apoptosis of SGC-7901 cell line iv vitro
FENG Zheng-quan ,NI Ke-feng1 ,HE Yu2 ,DING Zhi-shan2 , ZHU Feng2 ,WU Liang-cun ,SHEN Min-he
Department of Oncology , Zhejiang Province Horpital of TCM , Hangzhou 310006 Zhejiang , China;12003 Ph.D Class ,
2
Zhejiang Universing of TCM , Hangzhou 310006 , Zhejiang , China
ABSTRACT　AIM:To study the effect of Tetrastigma
hemsleyanum Diels et Gilg flavone(TDGF)on inducing
SGC-7901 tumor cell apoptosis and to approach its mech-
anism.METHODS:MTT assay was carried out to evalu-
ate TDGF s activity;cell morphology change was moni-
tored through optical microscope and electron microscope;
cell apoptosis was detected by flow cytometry with Annex-
in Ⅴ PI staining assay;the concentration of MMP-2 pro-
tein in the supernatant of tumor cell culture was also mea-
sured by zymography essay .RESULTS:Tetrastigma
hemsleyanum Diels et Gilg flavone inhibited SGC-7901
cell proliferation in a concentration-related manner , and
SGC-7901 cells had the characteristic changes of apoptosis
in morphology.Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg
flavone could also down-regulate the concentration of
MMP-2. CONCLUSION: Tetrastigma hemsleyanum
Diels et Gilg flavone promotes tumor cell apoptosis signifi-
cantly , which may be related to down-regulating the ex-
pression of MMP-2.So TDGF is a new promising anti-tu-
mor TCM drug.
KEY WORDS　Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg
flavone;tumor;apoptosis;matrix metalloproteinase-2
·672· Chin J Clin Pharmacol Ther 2006 Jun;11(6)