全 文 ：江苏农业学报(JiangsuJ.ofAgr.Sci.), 2011, 27(3):634～ 639
石　欣 , 李　亚 ,杨如同 , 等.中国楸树(CatalpabungeiC.A.Mey)种质资源遗传多样性的 ISSR分析 [ J] .江苏农业学报 ,
2011, 27(3):634-639.
中国楸树(CatalpabungeiC.A.Mey)种质资源遗传
多样性的 ISSR分析
石　欣 , 　李　亚 , 　杨如同 , 　汪　庆 , 　姚　淦
(中国科学院植物研究所 ,南京中山植物园 ,江苏 南京 210014)
收稿日期:2011-03-24
作者简介:石　欣(1986-),女 ,宁夏吴忠人 ,硕士研究生 ,主要从事观
赏植物资源利用研究。 (E-mail)sx2011@wo.com.cn
通讯作者:李　亚 , (E-mail)yalicnbg@yahoo.com.cn
　　摘要:　采用简单序列重复区间标记法(ISSR)分子标记技术 ,对中国楸树(CatalpabungeiC.A.Mey)10个类
型 156个单株进行了遗传多样性分析。从 46个简单重复序列引物中筛选出的 14个引物共扩增出 190条稳定的谱
带 , 其中多态性谱带 186条 ,多态性条带百分率达 97.89%。在物种水平上 , Nei′s基因多样性指数(H)为 0.290 9,
Shannon信息指数(I)为 0.446 3, 基因多样度 (Ht)为 0.296 7, 基因分化系数(Gst)为 0.397 1, 基因流(Nm)为
0.759 2。分析结果表明 ,楸树各类型间变异占总变异的 39.71%, 类型内的变异占总变异的 60.29%, 约为类型间
变异的 1.5倍 ,说明中国楸树类型内的变异在其遗传变异中占主导地位。楸树类型间的遗传相似系数介于 0.668 4
和 0.984 9之间 ,平均为 0.863 7。基于遗传相似系数的 UPGMA聚类分析 ,可将楸树 10个类型分为 4类。
关键词:　楸树;种质资源;ISSR;遗传多样性
中图分类号:　S687.9　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2011)03-0634-06
ISSRanalysisofgeneticdiversityofCatalpabungeiC.A.Meygermplasm
resourcesinChina
SHIXin, 　LIYa, 　YANGRu-tong, 　WANGQing, 　YAOGan
(InstituteofBotany, JiangsuProvinceandChineseAcademyofSciences, Nanjing210014, China)
　　Abstract:　Thegeneticdiversityof156individualsfrom10typesofCatalpabungeiwasanalyzedbyinter-simplese-
quencesrepeats(ISSR)techniques.Onehundredandninetylociweregeneratedwith14 simplesequencerepeatprimers
screenedfrom46primers, outofwhich186werepolymorphicandthepercentageofpolymorphicbandswas97.89%.At
thespecieslevel, Nei′sgenediversity(H)was0.290 9, Shannon′sinformationindex(I)was0.446 3, thegenediversity
(Ht)was0.296 7, thecoeficientofgenediferentiation(Gst)was0.397 1, andthegeneflow(Nm)was0.759 2.The
geneticvariationwithintypeswas60.29%, whichwasabout1.5 timesaslargeasthatamongtypes(39.71%).There-
sultsrevealedthatvariationwithintypeswasdominant.Thegeneticsimilarity(GS)ofthe10 typesofC.bungeiC.A.
Meyrangedfrom0.668 4 to0.984 9, andaveraged0.863 7.Basedonthegeneticsimilarity, clusteranalysisbyUPGMA
methodshowedthat10 typesofC.bungeiC.A.Meycouldbedividedinto4groups.
Keywords:　CatalpabungeiC.A.Mey;germplasmresource;ISSR;geneticdiversity
　　楸树(CatalpabungeiC.A.Mey), 为紫葳科 (Bignoniaceae)梓属(CatalpaScop.)植物 ,高大落叶
乔木 ,原产中国 [ 1] 。由于其适应性强 、生长快 、材质
好 ,自古素有 “木王”美称 ,是理想的复合农林业建
设树种 ,丰产性较强的用材树种和著名的园林观赏
树种 [ 2] 。作为中国优良乡土树种之一 ,楸树的生态
634
幅度较宽 ,分布遍及暖温带及亚热带 ,在山东 、江苏 、
河南 、安徽省分布较多 [ 3] 。但是由于其野生种群甚
少 ,加之楸树自花不育 ,二千六百多年的栽培历史中
又以无性繁殖为主 ,一个地区往往只有一个单一无
性系存在。在栽培进程中 ,由于不同地区的土壤 、气
候等外界条件的差异 ,引起了种内分化。但长期以
来对楸树资源缺乏系统研究整理 ,品系混乱 、种质不
清 ,给楸树的进一步研究和开发利用带来不便 。
姚庆渭教授曾在 20世纪 70年代对东亚和北美
产的楸树属 7个种进行了研究 ,并建议将原产中国的
楸树和灰楸分出来 ,另建为楸树组 ,这样将全属分为
梓树组 、楸树组和大梓树组 3个组[ 4] 。 1978年潘庆
凯从生产利用角度 ,首次对楸树组种以下分类单位进
行了详尽的描述 [ 5] 。 1983 ～ 1985年 ,河南省楸树研究
协作组 ,在全国范围内对楸树组资源开展了调查 、收
集和整理工作 ,根据大量标本和资料 ,依据形态变异
对楸树组进行分析整理 ,其中将中国的楸树种以下划
分为 11个类型[ 3] ,这也是迄今为止 ,中国对于楸树资
源调查及分类方面最为系统的研究。近年来 ,对楸树
的相关研究主要集中于生物学特性 、生理生态及栽培
繁殖等方面。谭燕双等基于叶绿体 trnL-F基因间区
的楸树属部分种植物的分子系统学研究结果 ,为楸树
组种内类型的分类提供了分子生物学参考 [ 6] 。李建
华根据叶绿体 ndhF基因和核糖体 DNA序列推断梓
属(紫葳科)的系统发育[ 7] 。但有关楸树种质资源遗
传多样性方面的研究相对比较少 ,在分子水平上对楸
树种内遗传多样性的研究还未见报道。
ISSR(Inter-simplesequencesrepeats)即简单序
列重复区间标记法 ,是由 Zietkiewicz等 1994年提出
的一种 DNA标记技术[ 8] 。由于 ISSR引物碱基数量
多 ,退火温度高 ,可重复性好 ,非特异性扩增少 ,真核
生物富含 SSR序列且变异最快 ,故 ISSR扩增出的
条带多且多态性要比 RAPD、SSR、RFLP等更加丰
富[ 9] 。目前已广泛应用于植物生物学分类 、进化 、
品种鉴定 、遗传作图 、基因定位 、遗传多样性 、进化及
分子生态学等研究中[ 10-16] 。
为进一步明确楸树种质多样性以及楸树各类型
间的遗传关系 ,本研究采用 ISSR分子标记技术 ,对
中国楸树 10个类型 156个单株进行遗传多样性分
析 ,以期通过在分子水平上的研究 ,揭示楸树不同类
型间的遗传关系 ,为楸树种质资源 DNA指纹图谱的
建立及品种鉴定提供分子生物学依据 ,为楸树种质
资源的保护 、利用及新品种的培育提供参考 。
1　材料和方法
1.1　材料
根据潘庆凯划分的楸树类型[ 3] , 2010年 6月份 ,
在河南省洛阳市林业科学研究所楸树种质资源圃 ,采
集当年生长正常的嫩叶 , 10个类型共 156个单株(表
1),置变色硅胶中干燥保存 ,用于提取 DNA。
表 1　156份楸树种质资源类型及来源
Table1　Typesandoriginsof156CatalpabungeiC.A.Mey
编号 类型 个体数 原产地
1 楸树 Catalpabungei 59 安徽 、北京 、河南 、湖北 、山东
2 金丝楸 C.bungeiJinsi 53 安徽 、河南 、山东 、湖北 、江苏
3 三裂楸 C.bungeiSanlie 11 安徽 、河南 、山东 、江苏
4 光叶楸 C.bungeiGuangye 11 河南
5 槐皮楸 C.bungeiHuaipi 5 河南
6 圆基长果楸 C.bungeiYuanjichangguo 7 安徽 、河南 、山东
7 长果楸 C.bungeiChangguo 3 河南 、山西
8 心叶楸 C.bungeiXinye 5 安徽 、河南
9 密枝楸 C.bungeiMizhi 1 河南
10 南阳楸 C.bungeiNanyang 1 河南
类型英文名称系作者按照《国际栽培植物命名法规 》 [ 17]拟定。
1.2　总 DNA的提取及检测
每个单株随机选取3 ～ 5片干燥的叶片 ,剪碎混匀
后 ,取适量于液氮中研磨成粉末 ,采用北京百泰克生物
技术有限公司生产的 Cat#DP3112植物基因组 DNA提
635石　欣等:中国楸树(CatalpabungeiC.A.Mey)种质资源遗传多样性的 ISSR分析
取试剂盒(离心柱形)提取 DNA, 1.2%琼脂糖凝胶(含
0.5mg/LEB)电泳检测 DNA纯度 ,并根据荧光强度确
定 DNA的浓度 ,置于 -20℃保存备用。
1.3　ISSR扩增及其产物检测
ISSR引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合
成 , TaqDNA聚合酶 、dNTPs以及 DL2000 marker均
购自 TaKaRa(宝)生物工程公司;所用仪器为 Ep-
pendorfMastercyclerGradientPCR扩增仪。
ISSR引物筛选:随机选取 3个样本的 DNA,从
46个 ISSR随机引物中筛选出条带清晰且重复性好
的引物 14个 ,用于所有供试样品的扩增。
PCR扩增体系:ISSR扩增反应总体积为 20.0
μl,其中包括 1 UTaqDNA聚合酶 、2.0μl10×PCR
bufer、1.5 μl25 mmol/LMgCl2、1.0 μl2.5 mmol/L
dNTPs、1.0 μl10 μmol/L引物和 40.0 ngDNA模
板 。PCR反应程序为:94℃预变性 3min;然后进行
35个循环反应 ,反应条件为 94 ℃变性 30 s, 54 ～ 56
℃退火 40s, 72℃延伸 1.0 min;最后于 72 ℃延伸 5
min。
PCR扩增产物检测:扩增产物在 1.5%琼脂糖
(含 0.5 mg/LEB)凝胶上进行电泳 , 以 2 000 bp
Marker作为分子量标准对照。用上海复日 FR-200A
全自动紫外成像仪系统观察结果并照相。
1.4　数据记录与统计处理
统计 14个引物电泳图谱中清晰的条带用以分
析 。ISSR电泳图谱中 ,根据凝胶同一位置上 DNA
条带的有无进行统计 ,有带且重复出现的记为 “ 1” ,
无带记为 “0”,并据此形成 ISSR表型数据矩阵 ,采
用 POPGENEVersion1.32软件进行下列遗传参数
分析:Neis基因多样性指数(Neisgenediversity)H、
Shannon信息指数 (Shannon′sinformationindex)I、
等位基因数(Observednumberofaleles)Na、有效等
位基因数(Efectivenumberofaleles)Ne、总的基因
多样度(Genediversityamongtypes)Ht、类型内的基
因多样度(Genediversitywithintypes)Hs、类型间基
因分化系数(Coeficientoftypesgenediferentiation)
Gst、类型间基因流 (Geneintercourseamongtypes)
Nm、多态性条带百分率 (Percentageofpolymorphic
bands)PPB。根据遗传相似系数用 MEGA软件对
各类型进行 UPGMA聚类分析 。
2　结 果
2.1　ISSR扩增产物的多态性分析
　　通过引物筛选 ,从 46个 ISSR随机引物中筛选
出扩增条带清晰且重复性较好的 14个引物 ,用于
10个类型楸树 156单株的 ISSR分子标记分析 , 14
个引物的序列及其扩增结果见表 2,图 1显示了引
物 22对部分样品的扩增结果 。从表 2可以看出 ,引
物 4扩增出的条带最少 ,仅 9条;引物 46扩增出的
条带最多 ,为 18条;14条引物共扩增出 190条稳定
的谱带 ,其中多态性谱带 186条 ,多态性条带百分率
达 97.89%。除了引物 1、引物 4、引物 74外 ,其余
11个引物扩增产物的多态性条带百分率均达到
100.00%。
表 2　14个 ISSR引物对 10个类型楸树的扩增结果
Table2　Amplificationresultsof10typesofC.bungeiC.A.Meywith14ISSRprimers
引物 碱基序列 退火温度 (℃) 扩增条带数 多态性条带数 多态性比例 (%)
1 (AC)8T 56 11 9 81.82
2 (AC)8AT 56 15 15 100.00
4 (AC)8AG 56 9 8 88.89
22 (AC)8AA 56 17 17 100.00
23 (AC)8TA 56 13 13 100.00
25 (AC)8CA 56 12 12 100.00
26 (AC)8CC 56 17 17 100.00
34 (AG)8AA 56 10 10 100.00
42 (AC)8CG 56 13 13 100.00
45 (AC)8GC 56 14 14 100.00
46 (AC)8GG 54 18 18 100.00
58 (AG)8GA 56 14 14 100.00
65 (AG)8CC 54 17 17 100.00
74 (ACTG)4 56 10 9 90.00
636 江 苏 农 业 学 报 　2011年 第 27 卷 第 3期
1～ 7:金丝楸;8～ 17:光叶楸;18～ 22:槐皮楸;23 ～ 28:三裂楸;29 ～ 43:楸树;44 ～ 48:心叶楸;49～ 52:圆基长果楸;53 ～ 55:长果楸;56:密枝
楸;57:南阳楸。
图 1　引物 22对楸树 10个类型中部分单株的 ISSR扩增结果
Fig.1　Amplificationproductsofsomeindividualsof10typesofC.bungeiC.A.Meygeneratedwithprimer22
2.2　楸树遗传多样性及遗传变异分析
根据 ISSR扩增结果计算出的遗传参数 。由表
3可见:从各类型来看 ,多态性条带百分率变化范围
为 36.32% ～ 94.21%, 根据 PPB值 ,各类型的多态
性为楸树 >金丝楸 >光叶楸 >三裂楸 >圆基长果楸
>长果楸 >心叶楸 >槐皮楸;各类型 I值变化范围
为 0.200 1 ～ 0.435 0,依据 I值 ,各类型的遗传多样
性为金丝楸 >楸树 >光叶楸 >三裂楸 >圆基长果楸
>长果楸 >心叶楸 >槐皮楸;各类型 H值变化范围
为 0.134 5 ～ 0.285 5,依据 I值 ,各类型的遗传多样
性为金丝楸 >楸树 >光叶楸 >三裂楸 >长果楸 >圆
基长果楸 >心叶楸 >槐皮楸 ,根据以上 3个参数 ,楸
树各类型遗传多样性的排列结果基本一致 。从排列
结果可以看出 ,金丝楸的遗传多样性最高 ,楸树仅次
于金丝楸 ,槐皮楸和心叶楸的遗传多样性相对最低 。
在物种水平上 ,多态位点百分率(PPB)是 97.89%,
Nei′s基因多样性(H)和 Shannon信息指数(I)分别
是 0.290 9和 0.446 3。在类型水平上 , 多态位点百
分率(PPB)为 67.76%, Nei′s基因多样性 (H)和
Shannon信息指数(I)分别为0.223 6和 0.337 5。总
体而言 ,楸树总体的遗传多样性水平较高 。因密枝
楸和南阳楸取样时各只有一个单株 ,没有计算其遗
传多样性参数。
其余遗传参数计算结果显示 ,群体总的基因多
样度(Ht)为 0.296 7,类型内的基因多样度(Hs)为
0.178 9,类型间的基因多样度为0.117 8,表明楸树
类型内的基因多样度相对较高。各个类型之间的基
因分化系数 Gst为 0.397 1, 即在物种水平上 , 有
39.71%的遗传变异存在于类型间 ,而 60.29%的遗
传变异存在于类型内。说明楸树类型间发生了一定
的遗传分化 ,但是类型内部表现出更高水平的遗传
分化 ,约是类型间遗传分化的 1.5倍。类型间基因
流 Nm为 0.759 2,基因流小于 1表明楸树 10个类
型间的基因交流有限。总体而言 ,中国楸树类型内
的变异在其遗传变异中占主导地位。
表 3　楸树 8个类型的遗传多样性分析
Table3　Geneticdiversityamong8typesofC.bungeiC.A.Mey
类型 PPB Na Ne H I
1 94.21 1.942 1 1.450 6 0.271 8 0.417 8
2 93.68 1.936 8 1.483 0 0.285 5 0.435 0
3 72.63 1.726 3 1.407 1 0.243 0 0.367 5
4 81.05 1.810 5 1.454 5 0.264 9 0.399 2
5 36.32 1.363 2 1.230 1 0.134 5 0.200 1
6 59.47 1.594 7 1.340 4 0.201 1 0.303 5
7 52.63 1.526 3 1.352 4 0.203 3 0.300 4
8 52.11 1.521 1 1.315 7 0.184 7 0.276 7
类型水平 67.76 1.677 6 1.379 2 0.223 6 0.337 5
物种水平 97.89 1.978 9 1.483 7 0.290 9 0.446 3
类型 1～ 8见表 1。 PPB:多态性条带百分率;Na:等位基因数;Ne:有效等位基因数;H:Nei′s基因多样性指数;I:Shannon信息指数。
637石　欣等:中国楸树(CatalpabungeiC.A.Mey)种质资源遗传多样性的 ISSR分析
2.3　楸树种内类型间遗传关系的聚类分析
楸树 10个类型间的遗传距离和遗传相似系数
见表 4。由表 4可知 ,供试楸树 10个类型的 Nei′s
遗传相似系数的变化为 0.668 4 ～ 0.984 9,平均值
为 0.863 7。其中楸树和三裂楸间的遗传相似系数
最大 ,为 0.984 9;密枝楸和南阳楸间的遗传相似系
数最小 ,为 0.668 4。总体上来看 ,各类型间的遗传
相似系数相对较高 ,说明各类型之间亲缘关系很近 ,
遗传分化较小 ,即各类型之间在基因水平上的差异
不明显。
表 4　楸树 10个类型群体间的 Nei′s遗传距离(对角线下方)和相似系数(对角线上方)
Table4　Nei′sgeneticdistance(belowdiagonal)andsimilaritycoeficient(abovediagonal)of10typesofC.bungeiC.A.Mey
类型 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 0.981 1 0.984 9 0.957 5 0.843 9 0.977 1 0.961 9 0.950 1 0.786 9 0.781 9
2 0.019 1 0.963 7 0.960 6 0.879 1 0.963 0 0.941 9 0.948 8 0.787 5 0.783 4
3 0.015 2 0.037 0 0.953 0 0.822 9 0.952 5 0.949 4 0.914 4 0.773 1 0.753 2
4 0.043 4 0.040 2 0.048 2 0.876 2 0.927 2 0.938 3 0.899 1 0.762 8 0.733 1
5 0.169 7 0.128 9 0.194 9 0.132 2 0.843 1 0.809 5 0.814 7 0.694 7 0.681 6
6 0.023 2 0.037 7 0.048 6 0.075 6 0.170 7 0.950 6 0.965 3 0.778 8 0.820 8
7 0.038 8 0.059 9 0.051 9 0.063 7 0.211 3 0.050 7 0.930 7 0.789 5 0.774 3
8 0.051 2 0.052 5 0.089 5 0.106 3 0.205 0 0.035 3 0.071 8 0.779 4 0.857 4
9 0.239 7 0.238 9 0.257 4 0.270 7 0.364 3 0.250 0 0.236 3 0.249 3 0.668 4
10 0.246 0 0.244 1 0.283 4 0.310 5 0.383 3 0.197 4 0.255 9 0.153 8 0.402 8
类型 1～ 10见表 1。
　　UPGMA聚类分析结果(图 2)显示 ,供试 10个
类型楸树分为 4类:密枝楸 、南阳楸和槐皮楸各单独
聚为一类 ,其余的聚为第 4类。第 4类又可以分为
2组:圆基长果楸和心叶楸聚为一组;另一组中楸树
和三裂楸的亲缘关系最近 ,首先被聚在一起 ,随后依
次是金丝楸 、光叶楸 、长果楸 。
类型 1～ 10见表 1。
图 2　基于 ISSR分析的楸树 10个类型的聚类图
Fig.2　Dendrogramof10typesofC.bungeiC.A.MeybasedonISSRanalysis
3　讨 论
本研究中虽然使用的 ISSR引物数量不多 ,但
14个引物扩增出了 190条片段 。从 ISSR扩增产物
的电泳图谱可以看出 ,供试种源的主条带较为一致 ,
说明供试种源间具有比较近的遗传背景。另外 ,各
类型的多态性条带百分率较高 ,说明 ISSR分子标记
法可用于楸树的遗传多样性分析 ,并能检测到大量
638 江 苏 农 业 学 报 　2011年 第 27 卷 第 3期
的多态性位点 ,有效区分楸树种质资源。
Hamrick等对 165个属 、449个物种共 653种植
物的统计结果表明:物种水平的基因多样性(H)为
0.150,多态位点百分率(PPB)为 51.3%,居群水平
的基因多样性 (H)为 0.113, 多态位点百分率为
(PPB)34.6%[ 18] 。对于楸树来说 ,无论是多态位点
百分率(97.89%),还是基因多样性指数(0.290 9)
均高于 Hamrick等所统计的植物的平均水平 ,这表
明楸树的遗传多样性是比较丰富的。
楸树 10个类型间基因分化系数 (Gst)为
0.397 1,表明供试的类型间存在一定的遗传分化 。
但是 60.29%的遗传变异存在于各群体内部 ,约为
类型间变异的 1.5倍 ,说明中国楸树类型内的变异
在其遗传变异中占主导地位 。类型间的基因流
(Nm)为 0.759 2,表明楸树 10个类型间的基因交流
有限 、遗传物质交换较少 ,这可能与楸树的生物学性
质有关 ,如花期的不一致 、花粉量少且活力较弱 、雄
蕊败育等原因。
10 个楸树类型之间的 遗传相似系数为
0.668 4 ～ 0.984 9,平均值为 0.863 7,类型间的遗
传距离普遍不大 ,只有少数类型间表现出比较显著
的遗传分化 。说明楸树各类型间的遗传基础较窄 ,
类型间亲缘关系很近 ,依据形态所划分的楸树各类
型在基因水平上的差异比较小 。
综上所述 ,本研究结果表明 10个类型的楸树在
基因水平上的遗传相似度比较高。多态性位点统计
结果显示楸树遗传多样性比较丰富 ,主要是以类型
内的变异为主 ,例如 ,楸树内部出现有花色的变异 、
金丝楸内部出现有明显的叶型变异。本研究调查还
发现 ,潘庆凯当年依据形态划分的楸树的类型中 ,有
些在引种驯化十几年的过程里 ,其特异性性状在逐
步消失 。例如 ,三裂楸的叶裂特征已经不明显 ,趋于
常态;长叶楸及长柄楸 2个类型的形态特征已经消
失 ,因此本研究中没有包括这 2个类型的材料 。因
此 ,本研究认为引起楸树外部形态变异的主要因素
可能是地理环境以及生态 、气候等因素 ,而基因变异
所占的比例较小 。
本研究的结果揭示了楸树种内各类型间的亲缘
关系 ,对于指导楸树品种分类 、选育 ,增加后代的遗
传变异 ,培育出杂交优势强 、综合性状好的优良品种
具有重要的意义 。
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