全 文 ：从啤酒酿造酵母中提取蔗糖酶及酶的性质研究
邹东恢 1,2，郭宏文 1,2
（1.齐齐哈尔大学食品学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；
2.黑龙江省普通高校齐齐哈尔大学农产品加工重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）
摘 要:采用 SDS抽提法从啤酒酵母中提取蔗糖酶，通过正交实验对 SDS浓度、提取时间、pH、提取温度等条件
进行优化，确定了最佳提取工艺条件是：SDS浓度 0.6mmol/L，温度 50℃，时间 10h,pH5.0。制得的粗酶经醇沉后，
采用Q-琼脂糖凝胶 FF 阴离子交换层析方法得到纯化的酵母蔗糖酶，纯化倍数为 16.8倍，并对蔗糖酶的酶性
质进行了研究。
关键词：酵母；蔗糖酶；SDS法提取；酶性质
中图分类号：TS261.11；TS261.9；TS201.2 文献标识码：B
Research on Extraction Technology and Enzyme Quality of Invertase From
Yeast
ZOU Dong-hui1,2,GUO Hong-wen1,2
（1.College of food Engineering, Qiqihar university，Qiqihar 161006,China；
2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Qiqihar university,Qiqihar 161006,China）
Abstract :The experiment extracted invertase from brewers yeast using SDS extraction. Through the orthogonal experiment on the SDS
concentration, pH value, extraction temperature, extraction time and other conditions,it optimized the extraction process，determine the
optimumextractionconditionswere:SDSconcentrationwas0.6mmol/L,temperaturewas50℃,timewas10h,pHvaluewas5.0.Th crude
enzyme obtained was precipitated by ethanol, and used Q-Sepharose FF anion-exchange column chromatography method of increasing
ionicstrengthtogetpurificatedyeastinvertase,purificationmultiplewasof16.8timesandresearchitsquality.
Key words: yeast；Invertase; SDS extraction; enzyme quality
0 前言
啤酒酵母也叫营养酵母，为酵母科、酿酒酵母
属，可作食用、药用和饲料酵母，还可以从其中提取
核酸、谷胱甘肽、蔗糖酶、细胞色素C等营养物质。蔗
糖酶（Sucrase,EC3.2.1.26）,又称为转化酶（Invertase），
属于水解酶类，蔗糖在蔗糖酶的催化下，水解为两
种还原糖D-葡萄糖和D-果糖。蔗糖酶在植物的运
输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用,并在渗透
调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥
着重要的作用[1]。
本实验采用 SDS 抽提法从啤酒酵母中提取蔗
糖酶，通过正交实验对SDS浓度、提取时间、PH值、
提取温度等条件进行优化，采用离子强度递增的方
法用Q-琼脂糖凝胶FF阴离子交换层析方法得到
纯化的酵母蔗糖酶，并对酶性质进行研究。
1 实验方法
1.1 主要实验试剂与仪器
TU-1810 紫外可见分光光度计：北京普析通用
仪器有限责任公司；THZ-82A 台式恒温振荡器：上
海跃进医疗器械厂；SHZ-B 水浴恒温振荡器：上海
跃进医疗器械厂；BSZ-100自动部分收集器：上海青
浦西仪器厂；TGL－16G型高速离心机：上海精密科
学仪器有限公司；Q Bio-Sep FF：北京生科瑞达科
技发展有限公司。使用试剂均为分析纯。
1.2 实验原料
文章编号:1002-8110（2013）01-0069-04
收稿日期：2013-03-25
作者简介：邹东恢（1967-），男，齐齐哈尔人，副教授，硕士。在齐齐哈
尔大学食品工程学院从事生物工程教学与科研工作，发表科技论文
20余篇。
69
第40卷 第4期
2 0 1 3 年 7 月
酿 酒
LIQUOR MAKING
Vol.40.№.4
July，2013
啤酒酵母来自某啤酒厂。啤酒酵母离心(7000r/min)
15min 收集菌体。将收集到的菌体用蒸馏水洗涤,离
心,洗涤,数次,直到菌体呈白色,倾出上清液，将不含
杂质的干净的酵母保存待用。
1.3 实验方法与步骤
准确称取离心分离后酵母 10g，加入 60mL
0.6mmol/L 的 SDS 溶解，pH5.5，40℃水浴 12h 后取
出，4℃、10000r/min离心20min，取上清液即为粗制
酶液，4℃保存[2]。
1.4 葡萄糖标准曲线的制定
以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，
绘制标准曲线，获得线性回归方程。直线方程为：
Y=0.5528X+0.0116，回归系数为0.9983。
1.5 蛋白质标准曲线的制定
以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，
绘制标准曲线，获得线性回归方程。回归系数为
0.9996，直线方程为：Y=0.0080X+0.0261。
1.6 蔗糖酶酶活的测定
葡萄糖和果糖具有还原性，可与3，5－二硝基
水杨酸共热后还原成棕红色物质，在一定范围内，
葡萄糖的含量和反应液的颜色强度成正比例关系。
稀释酶液 0.5mL，加入 0.3mL pH 4.6、0.1mol/L 的
NaAc-HAc缓冲液，0.2mL 0.1mol/L的蔗糖，37℃准
确反应15min，后加0.125mL 1mol/L的NaOH中止
反应[3]。在该条件下，蔗糖酶液1min转化底物蔗糖
生成1μg葡萄糖为定义为1个活力单位，用DNS
法在540nm波长下测定形成的还原糖量。
1.7 粗酶的初步分离
在提取出的粗制酶液中加入乙醇使其质量分数
达 30% ，4℃ 放 置 过 夜 ，4℃ 、10000r/min 离 心
15min，，取上清液，再追加乙醇使其终质量分数达
50%，4℃放置1h，4℃、11000r/min离心15min，弃上
清液，沉淀用双蒸水溶解，4℃保存。
经SDS抽提法提取，质量分数50%的乙醇沉淀
所得的酶液用透析法（pH 7.3、0.05mol/L Tris-HCl
缓冲液）充分透析，所得透析液4℃保存[4]。
1.8 蔗糖酶的纯化
采用Q-琼脂糖凝胶 FF阴离子交换柱层析纯
化粗酶液。
2 结果与分析
2.1 SDS抽提法提取啤酒酵母中蔗糖酶工艺条件
优化
在单因素试验的基础上，选取 SDS 浓度、pH
值、提取温度、提取时间考察其对酵母蔗糖酶抽提
效果的影响，采用四因素三水平正交表L9（34），做正
交试验。因素及水平的设计见表1，正交试验结果见
表2。
通过正交实验表可知：比较四个因素的极差，对
提取效果影响大小依次为：A>C>D>B,最佳工艺条件
为A2C3D1B2。即SDS浓度0.6mmol/L，温度50℃，时
间10h, pH5.0,此条件下提取效果最佳。
2.2 酵母蔗糖酶的纯化分离
将 SDS 抽提法提取出的蔗糖酶活性高的粗制
酶液经质量分数50％的乙醇沉淀，溶解透析后，过
Q-琼脂糖凝胶FF阴离子交换柱。
经酶活性和蛋白质含量测定，表明此峰具有蔗
糖酶活性，而且蔗糖酶活性和酶液的蛋白质含量成
正比，为蔗糖酶活性峰。收集Q-琼脂糖凝胶FF阴
离子交换柱层析后具有较高蔗糖酶活性的峰的各管
流出液，真空干燥浓缩，得到纯化的酵母蔗糖酶[5-6],
纯化曲线见图1，经过Q-琼脂糖凝胶FF阴离子交
换柱层析后，SDS抽提法所得的蔗糖酶的纯化倍数
表1 蔗糖酶抽提正交实验水平因素表
因素
1
2
3
SDS浓度（A）
0.3mmol/L
0.6mmol/L
0.9mmol/L
pH（B）
4.0
5.0
6.0
温度（C）
30℃
40℃
50℃
时间（D）
10h
12h
14h
表2 SDS抽提法提取啤酒酵母中蔗糖酶正交试验结果
实验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
优方案
SDS浓度（A）
1
2
3
2
3
1
3
1
2
447.4
476.3
468.2
9.7
A2
pH（B）
1
2
3
1
2
3
1
2
3
462.3
465.2
464.4
1.0
B2
温度（C）
1
1
1
2
2
2
3
3
3
457.3
465.7
68.9
3.9
C3
时间（D）
1
2
3
3
1
2
2
3
1
470.4
462.3
459.2
3.7
D1
酶活（U）
145.8
156.4
152.4
157.2
159.2
149.3
156.6
152.6
142.7
70
第四期 2013酿 酒
邹东恢，等：从啤酒酿造酵母中提取蔗糖酶及酶的性质研究第四期 2013
是相应酶液的16.8倍。
2.3 酵母蔗糖酶的性质研究
2.3.1 pH对酶活力和酶稳定性的影响
2.3.1.1 pH对酶活力的影响
测定了蔗糖酶在 pH3~6 之间的酶活力，pH 为
5.0时，蔗糖酶酶活力最高。pH超过5.0，酶活力逐
渐下降。
2.3.1.2 pH对酶稳定性的影响
酶溶液在各种不同pH缓冲溶液中于30℃保温
1h后，测定pH对酶稳定性的影响，结果表明，蔗糖
酶在pH3.0~6.0之间是稳定的。pH超过6.0时，酶
活力迅速下降，pH为8.0时，酶基本无活力。
2.3.2 温度对酶活力和酶稳定性的影响
2.3.2.1 温度对酶活力的影响
在最适pH条件下，分析了在20℃、30℃、40℃、
50℃、60℃五个温度下酶促反应的速度。当温度为
40℃时，蔗糖酶酶活力最高。超过40℃时，酶活力呈
现逐渐下降的趋势[7-8]。
2.3.2.2 温度对酶稳定性的影响
最适pH条件下，20℃~80℃保温1h后，分析剩
余酶活力，结果表明，蔗糖酶在20℃~60℃之间是稳
定的，超过60℃时，酶活力迅速下降，80℃时，酶活
力基本丧失。
2.3.3 化学物质对酶活力的影响
35℃保温1h，测定化学物质对蔗糖酶酶活力的
影响。由下图可知，CuCl2对蔗糖酶有激活作用，而
AgCl对蔗糖酶则其抑制作用，NaCl，KCl,FeSO4对蔗
糖酶活性无明显作用，但相对活力都保持在70%以
上。
2.3.4 酶动力学常数的测定
Km值是酶的特征性常数,以蔗糖浓度的倒数为
横坐标，以相应管生成还原糖的毫克数的倒数为纵
坐标，作图法求出酵母蔗糖酶的 Km 值, Km=0.
015mol/L。
● ●
● ● ●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
● ●
吸
光
度
O
D 0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
10 20 30 40 50 60 70 80
时间/min
图1 Q-琼脂糖凝胶FF阴离子交换柱层析
吸
光
度
A 0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
pH
图2 pH对酶活力的影响
吸
光
度
A 0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH
图3 pH对酶稳定性的影响
吸
光
度
A 0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
20 30 40 50 60
温度/℃
图4 温度对酶活力的影响
吸
光
度
A 0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90
温度/℃
图5 温度对酶稳定性的影响
相
对
酶
活
力
/% 140
120
100
80
60
40
20
0
H2O NaCl KCl FeSO4 AgCl CuCl2
化学物质（1%）
图6 化学物质对酶活力的影响
71
己酸菌是一种在己酸积累过程中起决定作用
的窖泥功能菌。己酸菌细胞形态呈鼓锤状，革兰氏
染色阴性。己酸菌是白酒生产中重要的产酸菌，它
代谢产生的己酸与白酒固态发酵过程产生的酒精生
成己酸乙酯，是浓香型白酒的主要香气成分。
本实验室从优质老窖泥中分离筛选得到一个高
产己酸菌株，利用分子生物学手段对种属其进行分
类鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品
高产己酸菌株GK13 湖北工业大学保藏
3 结论
3.1 通过 SDS抽提法提取啤酒酵母中的蔗糖酶，采
用正交实验得到最佳提取条件是：SDS 浓度
0.6mmol/L，温度50℃ 时间1 h, pH5.0。采用乙醇醇
析法分级初步纯化蔗糖酶后，用Q-琼脂糖凝胶FF
阴离子交换柱层析法对蔗糖酶进行纯化分离，纯化
倍数为16.8倍。
3.2 对蔗糖酶进行了酶学性质研究，得出了蔗糖酶
在pH5.0时酶活力最高，蔗糖酶在40℃时酶活力最
高，20℃~60℃之间性能较稳定；通过在酶液中加入
不同化学物质对酶活力的不同影响得出：Cu2+对蔗
糖酶酶活有激活作用，相反Ag+则起抑制作用，而
K+、Na+、Fe2+对蔗糖酶酶活基本无影响；测定了蔗糖
酶动力学常数Km值为0.015mol/L。
[参考文献]
[1]Gibson Sl.Plant sulgar-response pathways:Part of a complex regu-
latory web.Plant Physiol 2000，124:1532-1539.
[2]Iraqi D，Tremblay FM.Analysis of carbohydrate metabolism enzymes
and cellular contents of Sugars and proteins during spruce somatic
embryogenesis suggests a regulatory role of exogenous sucrose in
embryo development.J ExP Bot.2001，52:2301～2311.
[3]郭霭光，郭泽坤.生物化学实验技术[M].高等教育出版社，2007.
[4]李楠，庄苏星，丁益.酵母蔗糖酶的提取方法[J].食品与生物技术学
报，2007，（26）4：83～84.
[5]潘慧娟，应奇才.离心沉淀色谱法分离纯化香菇多糖[J].中华医药
学杂志，2004，3（2）：84～86.
[6]何兵存，王义娜.微波辅助提取香菇多糖的工艺研究[J].中国农学
通报2007，23（11）：162～165．
[7]董彩霞，黄建华，祝勇,等.酶解法提取香菇多糖的探讨[J].光谱实验
室，2005，22(5)：947～950．
[8]顾国贤.酿造酒工艺学[M].北京：中国轻工业出版社1999.
12
9
6
3
-100-50 0 50 100 150 200
1/[S]
1/
V
●
●
●
● ●
图7 酵母蔗糖酶的Km值
利用16s rDNA测序对一株高产己酸菌株的鉴定*
郭艺山 1，苏江滨 1，陈茂彬 2**
（1.广州甘蔗糖业研究所，广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东 广州，510316；
2.发酵工程教育部重点实验室,湖北工业大学生物工程学院，湖北 武汉，430068）
摘 要:从优质老窖泥中分离得到的一株高产己酸的梭状芽孢杆菌。经 16s rDNA序列测定鉴定为酪酸梭菌
（Clostridium butyricum）。
关键词：己酸；16s rDNA；鉴定
中图分类号：TS262.3；TS261.13；TS261.16 文献标识码：B
*基金资助：国家自然科学基金(31071594)；广东省自然科学基金
（10451031601006220）
收稿日期：2013-06-26
作者简介：郭艺山（1984-），福建漳州人；工学硕士；助理工程师；专业及研
究方向：发酵工程，工业微生物发酵与代谢调控。
**通讯作者：陈茂彬（1965-），男，汉族，湖北麻城人，教授、博士，主要从事
酿酒微生物发酵及分析研究；hgchenmaobin@163.com。
文章编号:1002-8110（2013）04-0072-04
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72
第40卷 第4期
2 0 1 3 年 7 月
酿 酒
LIQUOR MAKING
Vol.40.№.4
July，2013