全 文 ：西北植物学报 1 9 9 2一 08 , 1 2 ( 3 ) : z选9一 2 5 2
A c t a B o t
.
B o r e a l一 O c e i d e n t . S i n .
,
水冬瓜种子薄切片的制备和染色技术
姚雅琴 胡东维
(西北农业大学 ,
蒋选利 杨淑性
陕西杨陵 7 1 2 1 0 0 )
摘 要
对 外 壳 坚 硬 、 内 部 组织柔软的小粒种子的薄切片制备与染色技术做了研究 。 结 果
表明 , 先将不同发育时期的水冬瓜种子分别用浓硫酸处理一定时间后 , 种皮透性增加 , 容易
按常规方法制成各种组织完备的薄切片 , 采用次甲基兰与复红染色 , 各种不同的细胞成分具
有良好的分色效果 。
关位润 薄片制备 , 染色方法 , 种子结构 , 水冬瓜 , 硫酸处理 .
.
A M E T HO D O 厂 P R E P A R A T IO N AN D S T A IN O F T H IN SE C T IO N S F O R
T HE S E E D S O F ID E S IA P O L Y C A R P A V A R
.
V E S T IT A D IE L S
Y a o Y a q i n
,
H u D o n g w e i
,
J i a n g X “ a n l i a n d Y a n g S h u x i n g
( N o r t h田 e ; t e r ” A夕 r i e u l t u r a l U n i o e r s i t夕 , Y a ” g l i n g , S h a a . x i 7 12 20 0 )
A b s t r a e t
A P r e P a r a t i o n a n d s t a i n m e t h o d o f t h i n s e e t i o n s f o r s m a l l
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T h e r e s u l t
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D i e l s a t d i f f e r e n t s t a g e s o f d e v e l o P m e n t
, a f t e r b e i n g i m m e r s e d i n e o n
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u r i e a e i d f o r d i f f e r e n t t i m e t o i n e r e a s e t h e p e r m e a b i l i t y
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s e e d s t r u e t u r e b了 u s u a l 一n e t h o d , a n d t h a t s t a i n i n g i n M e t h y l e n e B l u e
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, 水冬瓜 ( I d e s i a 户 0 1夕 c a r p a v a r . o e s t` t a D i e l s )属于木本油料植物 。 我国的台湾 、
不友写 l o a s年 1 1月履网
2 3 0 西 北 植 物 学 报 12卷
陕西 、 西南地区以及甘肃南部均有分 一布 , 朝鲜 、 日本也有 。 该 植物种子含油量较高 , 可
食钊 , 也可制吧 飞、 润 滑油和洞由代月品等。 该遭物材质较软 , 易加工 , 可供板料器 具
之用 , 也是园林泉 化和行道树木 , 是 一种经济价值较高的植物 。 因而 , 近年来 , 越来越
多丸人研究该值物冷生物学持征 , . 化 一孕成分以及开发利用等〔 ` 一 , ’ 。 但 由于该值物为小 粒
种子 , 种皮坚硬 , 种仁柔软 , 难以用石蜡包埋常规法机片 , 从而给种子的研究带来极大
的不便 。 本研究为水冬瓜种子及其类以的材料提供了一种简单易行 , 并具有良好效果的
薄 切片制备方法 。
1
. 材料与方法
各个发育阶段的种子 , 均取自陕西省林业科学研究所 。
1
.
1 样品制备
将种子在 F A A 固定液中固定数天后 , 根据不同时期采集的种子用浓硫酸按 表 1
处 理 ( 表 l 中硫酸处 理 时 间是在预实验的基础上设立的 ) 。 处理后的样品 , 用水冲
洗数次后 , 在 4 %戊二醛中固定 24 小时 , P B S 冲洗 , 1 % 0 5 0 4 后固定 8 小时 , 然
后用丙酮 ( 3 0 % , 50 % , 70 % , 80 % , 90 % ) 逐级脱水 , 每次 40 分钟 ; 再 用 10 0 %
丙酮脱水两次 , 每次 1 . 5 小时 , 最后用 E P O N 8 12 环氧树脂包埋 。
衰 1 各个发 , 阶段种子的硫 . 处理时间
T a b l e 1 T h e im m e r s e d t i m e s i n H : 5 0 一 f o r t h e s e e d s a t d i f f e r
·
e n t s t a g e s o f
d e v e l o Pm e n t
_ 采样日期 .
U o l l e e t i n g D a t e
2 / 6 1 4 /6
硫酸处理时间
I口 m e r s e d t i m e 4
, 6 , 一…一…一“ ` 8 ` ’ 2 ` } ’ 5 ` “ ” ` ” 0 ` { “ 0 ’ “ 0“ 。 ’
_ 采样 日期 .
C o l l e e t i n g D a t e………`。 ` 3 1 / 7 5 / 8 1 2 / 9 成熟 R i p e硫酸处理时间I m m e r s e d t i m e `。 , 。。 , , 、 {。。 , , 、 , _ 5’、 1 , 、 2 、 。、 魂h s h 6 h
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. 日 /月 , D / M 。 。 .
1
.
2 切 片
用玻璃刀在 L K B V 型超薄切片机上切片 。 薄切片厚度为 1一 2 卜m 左右 , 切 好
的片子用镊子小心地夹住 , 从刀 口移下放在载玻片上加热 , 使片子展平 贴在载玻片上 。
超薄切片的厚度为 50 0一 60 OA 左 右 , 捞在具有 F o r m v ar 膜的铜网上 。
1
.
3 染 色
( 1 ) 薄切片染色 染液配方 : A液 : 次甲基兰 lg , 天青 B lg , 翻酸钠 g1 , 加
燕馏水至 10 Om l , B液 : 0 . 2 5%翻酸钠水溶液 , C 液 : 0 . 5%碱性复红溶液 。
薄切片的染色过程 : 先在载有薄 切片的玻璃片上滴 1滴 A 液 , 在 60 ℃条件下染色
l 分钟后 , 用蒸馏水冲洗干净 , 再取 B液 、 C液 各 1 滴棍合 , 继续在 60 ℃条件下 染半
息期 姚雅琴等 : 水冬瓜种子薄切片的制备和染色技术 2 5 1
分钟 , 最后用蒸馏水冲洗干净 , 烤干 。
( 2 ) 超薄切片染色 采用常规染色方法 。
2 结 果
2
.
1 硫酸处理效果
硫酸处理实验表明 , 6 月 2 日以前采的样 , 由于种皮木质化程度低或未木质化 , 不
需要用硫酸处理 , 而 6 月 2 日以后采的样品 , 经硫酸处理时间随种子的发育而加长 。 硫
酸处理的最佳时间见表 2 。 硫酸短时间处理不会导致种皮结构的破坏 , 但较老的种 一 r 处
理时间较长 , 种皮细胞的胞间层破坏 , 同时伴随着次生壁由外向内逐渐破坏 ( 图版 I ,
6 )
。
裹 2 各个阶段种子的硫咬处理 . 佳时间
飞’ a b l e 2 T h e o p t i m u m i m m e r s e d t im e f o r t h e s e e d s a t d i f f e r e n t
5 t a g e s o f d e v e l o P nr e n t
采样 日期 .
C o l l e e t i n g d a t e
硫酸处理最佳时间
O P t im u m t im e
2 / 6 1或/ 6 2 8 / 6 1 7 / 7 牙3 / 7 3 1 / 7 5 / 8 1 2 / 9 咚熟
r ! P e
2 尹 4 产 8 , 3 0
’
3 0
尹
4 0 l h Z h 6 h
· 日 /月 , D / M o n .
2
.
2 染色效果
由于一般染料不易渗入环氧树脂中 , 所以对树脂包埋的切片不能采用常规染色法 。
本实验使用的染色方法 , 基本上是按 K . C hi e n 用于动物结缔组织染色方 法 进 行 的
“ ’ , 但具体操作及处理时间则根据我们样品的特性作了改良。 采用本方法染色 , 可得到
良好的多层 次复合染色效果 。 其中核为淡兰色 , 核仁深 兰色 , 胞间层 、 纤维素初生壁 、
淀粉粒 、 角质层呈红色 , 糊粉粒中的蛋白质拟晶体不着色 , 木质化的细胞壁呈兰绿色 。
6 月 2 日采集的种子表明 , 外珠被 2 一 3 层细胞大而松散 , 壁呈红色 , 核小 , 液泡大 。
而 内珠被 3 层细胞小排列紧密 , 细胞质丰满 , 核大 , 壁呈兰色 。 内外珠被细胞壁的成分
已育了分化 。 珠心细胞中含有大量的淀粉粒 , 呈红色 ( 图版 I , 1 ) 。 6 月 14 口采集的
种子的外珠被仅一层细胞 明显 , 细胞壁呈绿色 , 角质层呈红色 。 内珠被细胞进一步伸长
且分为 3 层 , 同时细胞壁加厚 , 外层小而扁平 , 呈兰色 , 中间为大型 栅状 细胞 也 呈 兰
色 , 无细胞 间 隙 。 内层为稍大的扁平细胞 , 呈绿色 , 珠心与珠被间有丫层红色的角质
层 , 珠心细胞中仍有红色的淀粉粒存在 ( 图版 I , 2 ) 。 成熟种子的胚与胚乳 内含有大
t 蛋白质拟晶体 。 蛋白质拟晶体不着色 , 其外围 由红色无定形蛋白质包被 ( 图 版 I
3
、
4 )
。 蛋白质拟晶体在电镜下的形态 ( 图版 I , 5 ) , 从图版 I , 4 中还可清晰地
看到胚乳内的蛋白拟晶体大于胚内的蛋白拟晶体 。
3 结 论
( 1 ) 硫峻是一种强氧化刘 , 在处理 过程 , ! , 一定要严格控 制时间 。
( 2 ) 虽然经硫酸处理 , 但处理后的样品均种皮仍比一般的样品渗透性差 。 因此 ,
l 西 北 植 物 学 报念52 12卷
样品从固定 31J 渗透 均各个处哩过星听需 _ 时 司 , 应 土处理常规样品咬 5 一 6 倍 J
( 3 ) 用次甲基生 , 复红 葵色 , 可使核 乏兰色 , 核仁 飞深兰色 、 糖 、 淀吩位 、 纤维
素 、 角质呈红色 , 木质素呈 兰录色 , 蛋白质改晶体下着色 。 这 是一 仲浪育效勺 染 色 方
法 。
( 4 ) 本方法对于 制乍结沟致密 、 种皮坚硬 为小样品 , 不 仅方法简单 , 经齐有欢 ,
而且还便于将光镜信息与透射电镜信息综合起来分析 。
今 考 文 献
魏明山 , 梁布上 . 水冬吸 种子化笋开充与利用 . 西北 值勿研究 , 1 98 3 , 2 ( 2) : 87 一 8 ,
昊艳彼 . 关于水冬瓜油的哩化成分和室内精炼初步试验 。 陕西油脂科技 , 1 9 8 0 , ( 3 )
张学忠等 . 汉中地又水冬瓜油食用 :’q 题研究 . 秦巴山又生物科学沦文集 ( 张学忠等主编 ) .
西安 . 陕西科学技术出版社 , 1 9 8 .7 3 8一移
孙敬三 , 钱迎嘴` 植物细胞学研究方法 · 北 京: 科学出版吐· 1 9 8 7
C h i e n K
. 峨o t五 A n n . P r o e . E M S A . W a s h i n g t o n : 一9 5 2
S K 阿罗拉上编 . 豆内的七孕和生物化学 , 北京 : 科学出版社 , 1 9 8 71 96 一 14
,孟28
三峨66
E
. 胚
C u
. 角质层
图 版 说 明
1
。 内珠波 E l 。 外珠波 N . 珠心 S t . 淀扮拉 C yr . 蛋白拟晶体
S C
. 种皮
1
.
6 月 2 日采集的种子结沟。 x 350 2 . 6月 14 日采集为种子绪构 。 、 3 5〕 3 . 戍熟胚的结
构。 x Z肠 4 . 成熟种子胚与胚乳局部结沟放大。 x g。〕 5 . 成热种子蛋白拟晶沐透射电 镜 下 的
结构。 x 14。。。 6 . 成熟种子种皮结构 。 x 4 20
E x P l
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E 皿 s r了0 E n d . E n 10 : , 。 r m 1 1 . I n n 3 r I n t e 互以 m e n t E l . E 艺 t e r n a l I n t e g -
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.
N膝 e e l l u s s 士. S t a r e h g r a i n C r y . C r了 s t a l l i n C u . C u t i e l e E S . E m
b r了 0 S a e S C . S e e d C o a t
F i g
.
1
.
T h e s t r 认 e t以 r e o f t h e s e e d s f i x e d i n J认 n e . x 3 5〕 F i王. 忿 . T h e s : r u -
e t u r e o f t h e s e e d s f i二 e d i n J u n e 1 4 . x 3 5 0 F i g 。 s 。 T h e s t r u e t u r e o f t h e m a t u r a l
e 口 b r了0 . x 2 25 F i g . 4 . T h e e e l [5 o f e m b r y o a n d e n d o s p e r m i n t h e m a t u r a l s e e d .
K 000
.
F i` . 5 . T h e T E M p h o 七。 乙 r a p h s h o贾 i n g t h e e r y s t a l t云n i吐 t卜e m a t u r a l s e e d .
城 1一 0 00 F i g ` 6 . T h e s e e d e o a t s t r u e t u r e o f t h e m a t u r a l s e e d . x 4 z o
姚雅琴等 : 水冬瓜种子薄切片的制备和染色技术
Y a o Y a q i n e t a l
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: A m e t h o d o f P r e p a r a t i o n
S e e t i o n s f o r t h e S e e d s o f I d e
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