全 文 ：[基金项目 ]广东省医学科研基金资助课题 ( A2004455) ;广东省湛江
市科技攻关项目 (湛科 2005-82)。
琼枝麒麟菜多糖对白血病细胞株 HL-60
凋亡的影响
吴显劲 1 ,欧超伟 1 ,孟庆勇 2
( 1广东医学院附属医院 ,广东湛江 524001; 2广东医学院分析中心 )
　　 [摘要 ]　目的　观察琼枝麒麟菜多糖 ( EGP)对白血病细胞株 HL-60凋亡的影响。方法　分别采用 100、 200、
400 mg /L的 EGP处理 HL-60细胞。 采用荧光显微镜观察 HL-60细胞形态、 M TT法测定细胞株的增殖抑制情
况 ,流式细胞仪测定细胞凋亡率 ,逆转录—聚合酶链反应 ( RT-PCR)检测凋亡相关基因 Bcl-2、 Fas表达情况。结果
　 200、 400 mg /kg的 EGP作用后 HL-60细胞出现典型的凋亡形态学变化 , HL-60细胞抑制率增加 ;凋亡抑制基
因 Bcl-2表达下调 ,促凋亡基因 Fas表达上调。 结论　琼枝麒麟菜多糖能诱导 HL-60细胞发生典型凋亡。
[关键词 ]　麒麟菜 ;多糖 ;细胞凋亡
[中图分类号 ]　 R733. 7　　 [文献标识码 ]　 A　　 [文章编号 ]　 1002-266X ( 2007) 17-0004-03
Effect of Eucheuma gelat inae polysaccharide on apoptosis of human leukemia HL -60cells
WU Xian -jin1 ,OU Chao-wei ,MEN G Qing -yong
( 1 Aff iliated Hospital of Guangdong Med ical College , Zhanjiang 524001, P . R . China)
　　 Abstract: [Objectiv e ] To study the effect o f Eucheuma gelatinae poly saccharide ( EGP) on apopto sis of hu-
man leukemia HL-60 cells. [Me thods ] HL-60 cells wer e trea ted with diffe rent concent rations o f EGP( 100, 200,
400 mg /L ) , fluo rescent mic roscope was used to observ e HL-60 cells mo rpho lo g y, the inhibito ry effect of EGP on
g row th o f HL-60 cells was assayed by M T T me thod, flow cy tom etor y w as used to analyze apoptosis ra te, bcl-2
and Fas mRN A expression were detected by RT-PCR. [ Results ] EGP ( 200 and 400 mg /L ) could inhibit HL-60
cells pro lifera tion-promo tion gene Fas, induce HL-60 cells apo to sis and dow n-regulate the expression of apopto-
sis-inhibito ry g ene bcl-2 and up-regula ted promotion gene Fas. [Conclusion ] EGP could induce HL-60 cells apop-
to sis.
Key words: Eucheuma gela tinae; polysaccharides; apopto sis
　　琼枝麒麟菜 ( Eucheuma gela tinae )是一类海洋
植物 ,含有丰富的多糖 ,广泛分布在我国南海海域。
近年来研究表明麒麟菜多糖具有抗病毒、抗辐射作
用 [1～ 3 ] ,但其抗肿瘤作用的研究鲜见报道。 2005年 10
月～ 2006年 12月 ,我们观察了琼枝麒麟菜多糖 ( Eu-
cheuma gela tinae polysaccharide, EGP)对白血病细
胞株 HL-60凋亡的影响 ,旨在探讨 EGP的体外抗肿
瘤作用 ,为我国海洋资源的开发提供实验依据。
1　材料与方法
1. 1　材料　 EGP从海南产琼枝麒麟菜中提取 ,藻体
经 95℃水浴提取、醇沉淀及流水透析后真空干燥制
得 ,由红外光谱鉴定呈 β -糖苷键型特征吸收峰 ,醋酸
纤维薄膜电泳检测为电泳纯 ,硫酸 -酚法测得总糖
含量为 83%。
1. 2　方法
1. 2. 1　细胞培养、分组及用药　人急性早幼粒细胞
白血病细胞系 ( HL-60)细胞由广东医学院生化研究
所传代保存 ,采用常规培养。培养液为含 10%的小牛
血清 ,青、链霉素各 1× 105 U /L的 RPM I1640,在饱
和湿度在恒温 37℃、 5% CO2的培养箱中培养 72 h ,
每 2～ 3 d换液传代培养。将 HL-60细胞悬液调整为
2× 108 /L ,接种于 96孔培养板 ,每孔 100μl,实验组
分别加入 100、 200、 400 mg /L的 EGP,对照组不加
药 ,每组 8个复孔 ,饱和湿度条件下 , 37℃、 5% CO2
的培养箱中培养 ,于 24, 48, 72及 96 h在各孔加入
M TT10μl继续培养 4 h,终止培养前每孔加入二甲
亚砜 100μl, 37℃过夜。
1. 2. 2　相关指标检测　① HL-60细胞形态　采用
Hoechst33258荧光染色 ,观察不同浓度 EGP处理后
48 h HL-60形态学变化。② HL-60细胞抑制率: 用酶
联免疫检测仪测定各孔在 570 nm处的吸光度 ( A570)
值 ,按下式计算细胞抑制率: 抑制率 (% )= ( A对照 -
A实验 ) /A对照× 100%。③ HL-60细胞凋亡率 [4 ]:收集 1
4
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× 106个细胞 ,经冷 PBS洗 2次 , 70%乙醇固定 ,碘化
丙锭染色 ,流式细胞术 ( FCM)检测 DNA含量 ,并计算
凋亡率。④ HL-60细胞 Bcl-2及 Fas的 mRNA的表达
量: 凋亡基因 Bcl-2、 Fas及内参由大连宝生物工程公
司合成。内参 GAPDH(扩增产物长为 226 bp)其上游
引物为: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游
引物为: 5′-GAAGATGGTGAT GGGAT TC-3′。 Bcl-2
(扩增产物长为 304 bp) ,其上游引物为 5′-G TGGAG-
GAGCTCTTCAGGAG-3′, 下 游 引 物 为: 5′-AG-
GCACCCAGGGTGA TGATGCAA-3′。 Fas(扩增产
物 长 为 318 bp )其 上游 引 物为: 5′-T TCTGC-
CAT AAGCCCTGTCC-3′, 下游 引 物为: 5′-GGT-
GT TGCTGGT GAGT GTGC-3′。采用 RNA抽提试剂
盒 (华美公司 )抽提总 RNA,以 RT-PCR试剂盒 (华美
公司 )对所提总 RNA中 Bcl-2和 FasmRNA进行扩
增 ,并用图像分析仪对特异性扩增片段进行半定量分
析。 RT-PCR扩增条件为: 50℃、 30 min, 95℃、 15
min,活化 Ho tStar Taq DN A聚合酶进行逆转录及扩
增。 Fas、 Bcl-2的反应参数均为 94℃ 45 s, 56℃45 s, 72
℃ 45 s, 32循环 ,最后 72℃、 10min。PCR产物进行凝胶
电泳 ( 2% ) ,电压 5 V /cm, LEB染色 , 1～ 2 h在紫外透射
反射分析仪上观察拍照并灰度扫描计算灰度值。
1. 2. 3　统计学方法　采用 SPSS 11. 5统计软件 ,多
个样本均数比较采用单因素方差分析 ,多样平均数
间比较用方差齐性分析 ,总体方差齐同时选择 Bon-
ferroni法分析 ;方差不齐时选择 Tamhane s T2法分
析。检验水准 α= 0. 05。
2　结果
2. 1　细胞形态　实验组观察到染为高亮蓝色的典
型凋亡小体 ,其细胞核明显固缩、凝聚和断裂 ;随
EGP剂量增加 ,出现凋亡小体细胞明显增多。对照组
细胞核染色均匀。
2. 2　细胞抑制率　见表 1。 　由表 1可见 , EGP对
HL-60细胞的抑制作用在 200～ 400 mg /L和 24、
48、 72 h具有剂量和时间依赖性。 与对照组比较 ,
100、 200和 400 mg /L的 EGP对 HL-60细胞株的抑
制率明显增加 (P < 0. 05和 P < 0. 01)。
表 1　两组不同时间 HL-60细胞株的抑制率 (% ,x± s)
组别 24 h 48 h 72 h
实验组
　 100 mg / L 2. 89±7. 11* 6. 46± 9. 71* 4. 35± 4. 42*
　 200 mg / L 7. 46±7. 84* * 32. 00± 4. 52* * 64. 76± 2. 39* *
　 400 mg / L 15. 43±6. 81* * 37. 75± 10. 45* * 77. 84± 5. 25* *
对照组 0. 00±0. 00 0. 00± 0. 00 0. 00± 0. 00
　　注:与对照组比较 ,* P < 0. 05,* * P < 0. 01
2. 3　细胞凋亡率　流式细胞仪检测结果显示 , HL-
60细胞随 EGP浓度的增加亚二倍体峰 ( Ap峰 )所占
比例增加 , 100、 200、 400 mg /L EGP处理组凋亡率分
别为 3. 6%± 1. 7%、 9. 4%± 3. 7%、 36. 6%± 3. 4% 。
2. 4　 Bcl-2 mRNA及 Fas mRNA表达量　两组
Bcl-2及 Fas m RNA的表达量见表 2。
表 2　两组 HL -60细胞株 Bcl -2mRNA及 Fas mRNA
表达量 (灰度值 , x± s )
　组别 Bcl-2 mRN A /β-actin Fas mRN A /β-actin
实验组
　 100 mg /L 2. 86± 0. 32* 1. 12± 0. 22*
　 200 mg /L 2. 53± 0. 16* * 1. 53± 0. 26* *
　 400 mg /L 1. 52± 0. 18* * 1. 92± 0. 31* *
对照组 4. 01± 0. 38 0. 71± 0. 25
　　注:与对照组比较 ,* P < 0. 05,* * P < 0. 01
3　讨论
目前治疗白血病的主要手段为大剂量联合化
疗 ,其副作用大、复发率高 ,尤其是对机体的造血与
免疫功能有极大损害。既抗癌又扶正固本是迫切需
要解决的问题。海藻提取物为天然生理活性质 ,具有
毒性小、药源丰富和作用广泛的特点 ,不仅可提高免
疫功能 ,增强造血能力和清除自由基 ,而且具有抗肿
瘤作用 [5 ]。 Sogawa等发现 ,海生微藻类多糖可直接
作用于肿瘤细胞 ,诱导细胞分化、凋亡。
凋亡是一种独特的细胞死亡类型 ,是一种受基
因调节的细胞自主控制过程。因激活的核酸内切酶
催化染色质 DNA的裂解是发生细胞凋亡的关键步
骤 ,故细胞发生凋亡时出现明显的核固缩、凝聚、断
裂 ,形成凋亡体 ,细胞 DNA电泳时出现明显的 DNA
条带 ,在流式细胞仪 DNA定量分析图上出现显著的
凋亡峰。通过分析凋亡特征 ,可定性定量分析细胞凋
亡的情况。本研究证实 , 200 mg /kg和 400 mg /kg的
不仅可促进细胞出现典型的凋亡形态学变化 ,对
HL-60细胞的抑制作用在 200～ 400 mg /L的范围内
和 24、 48、 72 h具有剂量和时间依赖性 , 200～ 400
mg /L的范围内随 EGP浓度的增加亚二倍体峰 ( Ap
峰 )所占比例增加。
目前普遍认为细胞凋亡存在两条主要途经: 即
内源性途径 (亦称线粒体途径 )和外源性途径 (即死
亡受体 Fas介导的途径 ) ,在这两条途径中基因 Bcl-2
和 Fas起关键性作用 [6, 7 ]。 Bcl-2基因表达的 Bcl-2蛋
白可控制线粒体中致凋亡因子释放 ,在维持细胞生
理性分化、发育和细胞数量的动态平衡中具有重要
作用。本实验研究结果表明 , EGP可诱导离体量 HL-
60细胞发生凋亡 ,随着 EGP浓度的增加 , Bcl-2 mR-
NA的表达量逐渐减少 ,而 Fas m RNA的表达逐渐
增多。故 EGP对 HL-60细胞凋亡的可能机理是影响
5
山东医药 2007年第 47卷第 17期
了细胞中的 Bcl-2和 Fas的表达 ,从转录水平上影响
其 mRNA表达 ,通过内源性凋亡途径诱导细胞凋亡
和 EGP,促进 Fas受体与配体的结合 ,通过核因子
κB信号转导途径引起外源性细胞凋亡 ,此与 Maksi-
mow M等 [8 ]的报道相一致。
综上所述 , EGP可诱导 HL-60细胞发生典型凋
亡 ;其机理可能为抑制 Bcl-2 m RNA表达 ,增加
FasmRNA表达。
[参考文献 ]
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其水解产物的抑菌作用 [ J ]. 暨南大学学报 (自然科学版 ) , 2002,
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[2 ]吴显劲 ,孟庆勇 .琼枝麒麟菜多糖对γ射线照射小鼠脾细胞周期
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[ 3]吴显劲 ,孟庆勇 . 琼枝麒麟菜多糖对辐射损伤小鼠脾细胞免疫功
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[ 8 ] Maksimow M, Soderst rom TS, Jalkanen S, et al. Fas costimula-
tion of naiv e CD4 T cell s i s cont rol led by NF-kappaB signaling
and caspas e activi ty [ J ]. Leukoc Biol , 2006, 79(2): 369-377.
(收稿日期: 2007-02-16)
· 经验交流·
羊水粪染 102例临床分析
杜献玲 1 ,程　艳 2
( 1睢县中医院 ,河南睢县 476900; 2郑州市第五人民医院 )
　　羊水粪染是产科分娩过程中的常见并发症。 2000年 1月
～ 2005年 12月 ,我院共收治羊水粪染产妇 102例 ,现对其临
床资料分析报告如下。
临床资料: 102例发生羊水粪染产妇 (观察组 ) ,年龄 20～
30岁 ,平均 25. 2岁 ;初产妇 66例 ,经产妇 36例 ;孕周 < 37周
5例 , 37～ 39+ 6周 45例 , 40～ 41+ 6周 46例 ,≥ 42周 6例。合并
脐带因素 32例 ,合并妊娠并发症 12例 (妊娠高血压征 6例 ,
羊水过少 6例 )。均经产前阴道羊膜镜检查 ,或剖宫产、分娩过
程中的人工破膜或自然破膜后的肉眼直观确诊。 其中Ⅱ度污
染 (羊水呈黄绿色 ) 48例 ,Ⅲ度污染 (羊水呈棕黄色 ) 54例。 发
生胎儿宫内窘迫 26例 ( 25. 49% ) ,新生儿窒息 2例 ( 1. 96% ) ,
脐带绕颈 16例 ( 15. 68% ) ,脐带扭曲 11例 ( 10. 78% )。本组剖
宫产 35例 ,其中 14例未临产直接剖宫产 , 21例因产程中发
现羊水粪染后手术终止妊娠 ;阴道分娩 67例 (胎头吸引器助
产 12例 ,产钳助产 1例 )。本组 88例因羊水粪染终止妊娠 , 58
例 < 1 h终止妊娠者 ,其新生儿 1 min Apgar评分 < 8分者 15
例 ( 25. 86% ) , 31例 1～ 2 h终止妊娠者 16例 ( 51. 61% )新生
儿 1 min Apgar评分 < 8分。 1～ 2 h终止妊娠者新生儿 1 min
Apgar评分 < 8分的比率高于 < 1 h终止妊娠者 , P < 0. 01。 1
例孕 31+ 4周重度窒息、新生儿 1 min Apgar评分 < 6分者放
弃治疗 , 6例转儿科治疗 ,余 95例均正常出院。
讨论: 长期以来 ,产科领域对羊水粪染的临床意义存在争
议。部分学者研究认为 ,胎粪排入羊水可能是一种正常的生理
现象 ,是胎儿成熟的表现 ;但目前多数学者也认为 ,羊水粪染
是胎儿宫内缺氧的一种表现。当胎儿血氧含量 < 0. 3时 ,即有
胎粪排出 ,若羊水Ⅱ度以上粪染则提示胎儿宫内窘迫。本组资
料显示 ,羊水粪染组胎儿宫内窘迫率明显高于正常分娩胎儿 ,
说明羊水粪染与胎儿窘迫的发生关系密切。 羊水粪染发生率
一般占孕妇的 8% ～ 15% ,且随着胎龄的增加而上升 ,足月儿
中羊水粪染占 10% ～ 15% ,过期儿中占 25% ～ 50% ,本组发
病率较低 ( 5. 58% ) ,且胎龄≥ 40周者较胎龄 < 40周者羊水粪
染率上升。
临床上引起胎儿宫内缺氧、羊水粪染的原因常见的有脐
带因素 (绕颈、过短、过度扭曲等 )、羊水过少、妊娠高血压综合
征、胎位异常 (臀位 )等。本文羊水粪染合并脐带绕颈者明显高
于对照组 (P < 0. 01) ,故临床工作应加强对脐带并发症的产
前诊断 ,减少因脐带异常引起胎儿宫内缺氧、羊水粪染发生。
另外 ,本研究结果还提示新生儿结局与羊水粪染程度密切相
关 ,Ⅱ 度以上的羊水污染 ,新生儿不良结局发生率明显增加 ,
故临床上应高度重视Ⅱ度以上的羊水污染 ,产程中应加强胎
心监护 ,对羊水Ⅱ度粪染 ,同时出现胎心监护异常者 ,应及早
终止妊娠。 作者认为 ,必须在短时间内结束分娩 ,本组病例中
1 h内结束妊娠的新生儿 Apgar评分明显高于 1 h后结束妊
娠的新生儿。对羊水Ⅲ度粪染者提示胎儿有明显缺氧 ,应尽快
终止妊娠 ,对Ⅰ 度粪染者则应严密监测胎心变化 ,不必过早干
预 ,以免扩大剖宫产率。 对胎粪污染的新生儿 ,尤其重度污染
者 ,应立刻清理呼吸道 ,做好新生儿复苏准备 ,及时发现和诊
治新生儿胎粪吸人综合征 ,降低新生儿死亡率。
(收稿日期: 2007-04-01)
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