全 文 ： 实
验
研
究
论
著
三叶青黄酮对 H-22荷瘤小鼠瘤体的抑制
作用及其机理研究
倪克锋1 丁志山2 黄 挺1 蒋福升2 林胜友3 吴良村3 黄 伶1
1.浙江中医药大学附属广兴医院(杭州市中医院) 杭州 310006 2.浙江中医药大学生命科学学院
3.浙江中医药大学附属第一医院
摘要:[ 目的] 观察三叶青总黄酮对 H-22 荷瘤小鼠瘤体的抑制作用 , 探讨其作用机理。[方法] 小鼠肝癌 H-22 细胞右前肢腋窝皮
下接种造膜 , 观察低 、中 、高剂量三叶青黄酮对荷瘤小鼠抑瘤率 、脾脏指数 、胸腺指数的影响 , 并通过定量 RT-PCR检测小鼠皮下
移植瘤 Fasp-3 、Cy tC 的表达情况。[ 结果] 低 、中 、高剂量三叶青黄酮对 H-22 荷瘤小鼠的瘤重抑制率分别为 34.28%、32.56%和
29.24%;皮下移植瘤 Fasp-3 、Cy tC m RNA 的表达低剂量组明显高于空白组(P<0.05)。[结论]三叶青黄酮可显著抑制肿瘤细
胞 , 这一作用与其能促进肿瘤细胞的促凋亡基因 Fasp-3 、Cy tC 的表达相关。
关键词:三叶青黄酮;肿瘤;细胞色素 C;半胱氨酸蛋白酶 3
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1005-5509(2008)06-0732-03
Inhibition Effect of Tetrastigma Hemsleyanum Diels et Gilg Flavone on H-22 Solid Tumors in Mice Ni Kefeng ,Ding Zhishan ,Huang
Ting ,e t al Zhej iangChinese Medical University , Hangzhou(310053)
Abstract:[ Objective]Observe H-22 solid tumor growth inhibition by Tetrastigma hemsleyanum Diels e t Gilg flavone(TDGF)and
analyse its mechanism.[ Methods] Solid tumor-bearing Kunming mice w ere obtained using mice hepa toma H-22 ce ll line , tumor
g rowth inhibition ratio of TDGF w as assessed and compared , thymus index and spleen index were also recorded to evaluate the
function o f TDGF ;Moreover ,the gene expression level of Fasp-3 ,CytC were detected through quantitate RT-PCR.[ Results] Low ,
modera te and high dose treatment g roups show ed inhibition H-22 solid tum or activity with inhibition ratio 34.28%, 32.56% and
29.24% respectively.Gene analysis show ed tha t low dose group can up-regulate Fasp-3 、CytC mRNA expression with significant
deviation compared with contro l group(P<0.05).[ Conclusion] TDGF can inhibit H-22 so lid tumor grow th in vivo ,w hich maybe e-
duced by up-regulating the expression of apoptosis-rela ted genes Fasp-3 and CytC.
Key words:Tetrastigma hem sleyanum Die ls e t Gilg flavone(TDGF);tumor;cy tochrome C(cy t c);cysteine proteinase3
基金项目:浙江省中医管理局立项资助项目(NO :2006C104)
Fund pro ject:Item suppor ted by Zhejiang Provincial TCM Adiministration(NO :2006C104)
三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et
Gilg),又名金丝吊葫芦等。来源为葡萄科崖爬藤属
植物 ,为浙江省主要药源植物之一。具有清热解毒 、
祛风化痰 、活血止痛的功效[ 1] 。临床多用于治疗小
儿高热惊厥 、肺炎等症 ,现常用来防治各类肿瘤 。吴
良村教授运用三叶青为主药用于肿瘤临床 ,发现在
抑制肿瘤生长 ,延缓病人的生命 ,改善生命征象方面
有独特的效果。但作为临床常用药 ,三叶青并没有
得到应有的重视 , 既没有理化研究 , 也没有质量标
准 。作者前期对三叶青的成分进行提取分离和鉴定
分析 ,发现三叶青富含黄酮 。为探讨三叶青抗肿瘤
作用的机制 ,更好地开发 、利用三叶青 ,本实验研究
了三叶青黄酮对 H-22荷瘤小鼠瘤体的抑制作用 ,并
从凋亡基因角度阐述其作用机理 。
1 实验材料和方法
1.1 三叶青总黄酮的提取和鉴定 取三叶青 3000g
采用 5%氢氧化钠稀乙醇浸泡5h ,连续浸提3次 。浸
提液加入稀盐酸酸化 , 得沉淀为三叶青提取物
22.7g 。取少许提取物经盐酸 -镁粉反应 、薄层层
析 、三氯化铝反应等鉴定分析呈黄酮类物质的显色
反应 ,放置于 4℃冰箱保存备用 。
1.2 细胞株及实验动物 小鼠肝癌 H-22 细胞株 ,
由浙江中医药大学生命科学院提供。昆明种小鼠 ,
雄性(清洁级),体重 20±2g ,购于浙江中医药大学实
验动物中心 ,基础饲料喂养及造模取材在浙江中医
药大学实验动物中心。
1.3 动物分组 健康雄性昆明小鼠 40只 ,体重 20
±2g ,称重后分组 、编号 ,随机分成 4组 ,每组 10只。
对照组(A 组)、三叶青低剂量组(B 组)、三叶青中剂
量组(C组)、三叶青高剂量组(D组)。
1.4 动物造模 取小鼠肝癌 H-22细胞株腹腔内接
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DOI :10.16466/j.issn1005-5509.2008.06.042
倪克锋,等: 三叶青黄酮对H-2荷瘤小鼠瘤体的抑制作用及其机理研究
种 8d的种鼠 ,无菌条件下用 5ml注射器抽吸出 1 ～
2ml牛奶状 、较粘稠的腹水 ,先用 0.4%苔盼蓝染色 ,
计活细胞率 >90%,再用白细胞稀释液计数瘤细胞
数 ,然后以灭菌 D-Hanks液稀释调整肿瘤细胞浓度
为 1×107 个/ml ,接种上述 40只小鼠 ,每只 0.1m l ,
右前肢腋窝皮下接种 。
1.5 给药方案 将三叶青总黄酮用无菌蒸馏水溶
解 ,稀释至所需浓度(50mg/ml , 100mg/ml , 300mg/
ml),于小鼠瘤细胞接种后 24h 开始每天灌胃给药 ,
每只 0.3ml(对照组给予等体积的 D-Hanks液)连续
给药 12d 。
1.6 小鼠体重变化观察记录 在注射药物的第 1
天开始每隔 1天于给药前称取小鼠体重 ,同时观察
小鼠活动进食情况。
1.7 计算肿瘤抑制率 、胸腺指数和脾指数 全部小
鼠于最后 1次给药后 24h ,颈椎脱臼法处死小鼠 ,解
剖称取瘤重 ,同时记录胸腺及脾重。计算肿瘤抑制
率 、胸腺指数和脾指数:肿瘤抑制率(TGS)=[(对照
组平均瘤重 —给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]
×100%;胸腺指数=胸腺重(mg)/10g 体重;脾指数
=脾重(mg)/10g 体重 。
1.8 RT-PCR检测凋亡相关基因 Casp-3 、Cy tC 的
表达 取保存在液氮中的瘤组织 ,分别以 T rizol试
剂提取总 RNA ,具体操作严格按试剂盒说明进行 。
提取后以紫外光分光光度计测定其纯度并定量 ,在
1%的甲醛变性凝胶上电泳验证 RNA 完整性。逆转
录以 AMV 逆转录酶提供的体系为标准 ,在 PCR管
中配制逆转录反应液 ,轻轻混匀 ,室温放置 10min后
移入 42℃恒温槽中 。42℃保温 1h进行逆转录反应 。
反应结束后在冰水中冷却 2min。所得到的反应液即
可用于 PCR反应。
取上述的逆转录产物 5μl作为 PCR 反应的模
板 ,在 PCR管中配制反应液 ,加入事先设计的目的
基因 Casp-3 、Cy tC 的预测引物 ,并以 Actine 基因作
为内参进行 PCR反应 ,反应体系为 50μl。扩增条
件:94℃预变性 5min 后 , 94℃/30s 、55.5℃/50s 、
72℃/1min , 反应 30 个循环 , 最后一轮 72℃延伸
5min ,4℃保存 。扩增产物取 5μl 在 1%琼脂糖(含
EB 0.5 ng/ml)上电泳 ,紫外灯下观察结果并照相 ,
吸光度扫描仪扫描后 PCR条带用软件进行定量分
析 ,每一个基因的表达量用 actine 内参进行标准化 ,
结果为基因表达量对 actine 内参的比值 ,以上结果
重复 3次 ,取平均值 。
1.9 统计学处理 采用 SPSS 11.0软件分析 ,不同
药物浓度组间的比较采用完全随机设计的方差分
析 ,各药物浓度组与对照组的比较采用 Dunnett t检
验 ,以α=0.001和 0.05为检验水准。
2 结果
2.1 三叶青黄酮对 H-22小鼠体重变化的影响 全
部小鼠均有皮下肿瘤生长 ,未见死亡。各组小鼠体重
变化相仿 ,均呈逐渐上升趋势(见图 1)。与对照组比
较 ,三叶青黄酮给药各组小鼠体重增长慢 ,其中低剂量
组体重增长最少 ,各组比较无统计学差异(P>0.05)。
图 1 荷瘤小鼠体重变化观察
2.2 三叶青黄酮对 H-22小鼠瘤体的抑制作用 全
部小鼠均有皮下肿瘤生长 ,各组小鼠体重和皮下肿
瘤的重量见表 1。统计分析显示 ,三叶青总黄酮各剂
量组动物体重与对照组及各剂量组间比较均无显著
性差异(P>0.05);但各剂量组的瘤重与对照组比较
有显著差异(P <0.05),其中低剂量组效果最佳(P
<0.001),抑瘤率达 34.28%;中剂量组次之(P <
0.05),抑瘤率为 32.56%;高剂量组相对最差(P <
0.05),抑瘤率为 29.24%,各剂量组间两两比较无显
著差异(P>0.05)。
表 1 三叶青黄酮对H-22小鼠抑瘤率 、脾指数 、胸腺指数 、相关基因表达(与对应内参的比值)的影响(x±s , n=10)
体重(g) 瘤重(g) 抑瘤率(%) 脾脏指数 胸腺指数 CytC Casp-3
对照组 27.31±4.62 0.81±0.19 85.34±12.20 17.40±9.30 0.39±0.021 0.21±0.184
低剂量 24.81±3.02 0.54±0.15 ＊ 34.28 105.87±36.43 ■ 21.07±7.60 0.98±0.057＊ 0.51±0.101 ■
中剂量 25.38±3.20 0.55±0.10 ■ 32.56 87.55±10.04 14.42±5.53 0.89±0.014＊ 0.47±0.051 ■
高剂量 25.09±3.69 0.58±0.14 ■ 29.24 80.68±10.13 18.14±4.94 0.30±0.092 0.36±0.079
与对照组比 , ＊P<0.001;■0.001
数的影响 各组小鼠脾脏指数和胸腺指数如表所
示 ,与对照组比较 ,低剂量三叶青总黄酮能显著增加
荷瘤小鼠的脾脏指数(P<0.05);中 、高剂量组对脾
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倪克锋,等: 三叶青黄酮对H-2荷瘤小鼠瘤体的抑制作用及其机理研究
指数的影响与对照组相仿(P >0.05);低 、高剂量组
胸腺指数较对照组有上升趋势 ,但与对照组无显著
差异(P>0.05);中剂量组反而有轻度下降 ,但与对
照组无显著差异(P>0.05);只有低剂量组与中剂量
组比较胸腺指数有显著差异(P<0.05)。
2.4 三叶青黄酮对相关基因表达的影响 各剂量
组三叶青黄酮对凋亡相关基因 Cy tC 和 Casp-3 mR-
NA 表达量与内参表达量的比值见表 1和图 2。与
对照组相比 ,低剂量组与中剂量组均能明显增加 H-
22细胞 CytC mRNA 的表达(P<0.001);高剂量组
反而有轻微下调 , 但统计学分析无显著差异(P >
0.05)。低剂量组 CytC mRNA 的表达量要高于中
剂量组 ,但两两比较统计学分析无显著差异(P >
0.05)。低 、中剂量组均能显著增加 H-22细胞 Casp-
3 mRNA 的表达 ,与对照组比较统计分析有意义(P
<0.05);而高剂量组与各组两两比较均无显著差异
(P>0.05)
图 2 左图为 CytC mRNA 的表达情况 , 右图为 Casp-3
mRNA 的表达发问。图中条带从左到右依次为对照组 、低剂
量组 、中剂量组和高剂量组 ,图中 Mark 为 100bp
3 讨论
作者前期通过系统溶剂分离法 ,发现三叶青块
根中醇提乙酸乙酯萃取物含量高 ,抗肿瘤作用强 ,经
鉴定分析主要作用物质为黄酮 ,而体外实验证实了
三叶青黄酮对体外的肿瘤细胞有较强的抑制结果。
近年来 ,线粒体在细胞凋亡机制中的作用越来
越引起人们的重视 ,一方面是由于线粒体膜间隙的
细胞色素 C释放至胞质后触发 caspase级联 ,导致细
胞死亡;另一方面 ,线粒体外膜上的 Bcl-2蛋白家族
调控细胞色素 C自线粒体的释放。也就是说细胞色
素 C 在细胞凋亡过程中起重要作用的不只是影响能
量代谢 , 更重要的是细胞色素 C 自线粒体的释放 。
凋亡过程中细胞色素 C 通过线粒体外膜释放 ,在
A TP/dA TP 的参与下 ,在胞质中与 Apaf-1结合形成
寡聚体 ,Apaf-1通过其氨基端和 procaspase-9 的功
能前区相互作用 ,导致 caspase-3激活 ,并进一步激
活下游的 caspases[ 2-4] 。而 Bcl-2 蛋白家族是通过释
放细胞色素 C 执行凋亡指令[ 5] 。
Caspases是一组与秀丽隐杆线虫同源的执行哺
乳动物细胞凋亡的主要蛋白酶家族 ,通常它们以无
活性的酶原(procaspase)形式存在于胞质内 ,当有致
凋亡刺激存在时被激活 。Caspase-3是 caspase 家族
最重要的凋亡执行者(executioner)之一 ,它可自身切
割 ,在凋亡的执行阶段 ,负责对全部或部分关键性蛋
白的酶切作用(激活或灭活)。Nagata 实验室在胞质
内找到一种能将染色质切割的核酸酶 ,该酶需首先
藉 Casp-3 激 活 , 故 称 caspase-activ ated DNase
(CAD)。CAD能在 DNA上识别一定的序列并在该
处使其断裂而成“梯形染色质”(chromatin ladder),
一般认为这是凋亡的典型表现。因此细胞色素 C 和
Casp-3是哺乳动物细胞凋亡信号传导过程的关键因
素。因此 ,作者选择 Cy tC 和 Casp-3为指标 ,对三叶
青黄酮的体内抗肿瘤作用及机理进行研究 ,并初步
观察了其对 H-22荷瘤小鼠免疫器官的影响 。
本试验发现三叶青黄酮抗肿瘤作用并不呈剂量
依赖性 ,综合分析低剂量的作用要优于高剂量 ,说明
在抗肿瘤的药理实验中 ,药物在体内的代谢受多重
因素调控 ,单一体外试验的结果可能存在一定的局
限性 。结合实验中小鼠的体重变化情况(用药各组
体重要轻于对照组),分析其原因可能在于:①三叶
青黄酮的抗肿瘤作用可能是双向调节的 ,存在反馈
负反馈机制;②给药浓度过高影响了实验结果;③三
叶青黄酮通过其它途径发挥了较强的作用影响了结
果;④三叶青黄酮中可能含有毒性作用的杂质;⑤三
叶青黄酮可能有毒性作用。
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(收稿日期 2008-08-19)
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