全 文 ：收稿日期:2002-08-09;修回日期:2003-01-22
基金项目:广州市科技攻关资助项目(98-Z-041-01)
作者单位:510182 广州医学院肿瘤研究所肿瘤生化
研究室
齐墩果酸抗人肺癌细胞增殖 、侵袭和
诱导细胞凋亡的研究
张东方 ,黄　炜 ,黄济群 ,张瑞玲 ,廖兆全
Study on proliferation inhibition and anti-invasion and apoptotic induction of
oleanolic acid in human lung cancer cell line
ZHANG Dong-fang , HUANG Wei , HUANG Ji-qun , et al
Cancer Inst itute , Guangzhou Medical College , Guangzhou 510182 , China
　　Abstract:Objective　To study the effects on proliferation inhibition , anti-invasion and apoptotic induct ion
of oleanolic acid(OA)in human lung cancer cell line (PGCL3), and search the mechanism of anti-invasion.
Methods　The proliferation inhibitive rate , the colony-formation rate in semi-solid agar , the invasive ability to
reconst ituted basement membrane , the chemotatic migrat ion ability , the adhesion abili ty to laminin , and the ac-
tivi ty of cathepsin B(CB)were tested to observe the effects of OA on invasion ability of PGCL3 cells.The apop-
tosis of the cells were examined w ith the methods of acridine orange/ethidium bromide fluorescent double stain
(AO/EB)and T UNEL .Results　Treated w ith OA , the proliferation of PGCL3 cells w as inhibited obviously ,
and the inhibition deg ree w as related to dose of the drug.IC50 of the proliferat ion inhibi tion w as 40.71μmol/L.
Treated w ith 35μmol/L and 45μmol/L OA , the invasion , adhesion and migrat ion abili ty , the secretion of CB
and the colony-formation rate in semi-solid agar of the PGCL3 cells compared w ith the control g roup were de-
creased significantly (P <0.05 and P<0.01).Apoptotic percentages of PGCL3 cells were obviously increased
af ter t reatment with OA in the above concentration fo r 48h(P <0.05 and P <0.01).Conclusion　Oleanolic
acid can inhibit the proliferation and invasive ability of the PGCL3 human lung cancer cells.The mechanism of
anti-invasion of the drug is to inhibit many points in invasive process , and does not limit any one only.
Key words:Human lung cancer;Oleanolic acid;Proliferation;Invasion;Apoptosis
　　摘　要:目的　研究齐墩果酸抗人肺癌细胞增殖 、侵袭和诱导细胞凋亡的作用 ,并探讨其抗侵袭作用的
机理 。方法　用细胞增殖抑制试验 、软琼脂集落形成试验 、对重建基底膜的侵袭试验 、趋化运动试验 、对层粘
连蛋白的粘附试验以及组织蛋白酶 B活性测定观察齐墩果酸对 PGCL3细胞侵袭能力的影响 ,用吖啶橙-
溴乙啶荧光双染法和 TUNEL 法检测细胞凋亡。结果　齐墩果酸可降低 PGCL3细胞增殖能力并呈剂量依
赖性 , IC50为40.71μmol/L ;35μmol/L 和 45μmol/L 齐墩果酸均能抑制 PGCL3细胞的侵袭能力(P <0.01)且
有剂量依赖性 。抗侵袭作用机理的分析结果显示上述浓度的该药物对细胞的运动 、粘附及组织蛋白酶 B分
泌均有明显的抑制作用(P <0.05和 P <0.01);软琼脂集落形成率也显著降低;上述浓度的药物处理 48 h均
使PGCL3细胞凋亡率显著升高(P <0.01)。结论　齐墩果酸有抗 PGCL3 人肺癌细胞增殖和侵袭作用 ,并
有诱导PGCL3细胞凋亡的作用。其抗侵袭机理不是对侵袭的某一环节的阻断 ,而是对侵袭各个基本环节都
有抑制作用。
关键词:肺癌;细胞培养;齐墩果酸;增殖;侵袭;凋亡
中图分类号:R73-36+1　　文献标识码:A　　文章编号:1000-8578(2003)03-0180-04
0　引言
齐墩果酸(oleanolic acid , OA)有护肝抗炎作用 ,
临床上用于急慢性肝炎的治疗 ,对于肝功能的恢复有
较好的效果。近年来发现齐墩果酸有抑制小鼠腹水
癌细胞增殖 、恢复照射后的造血功能[ 1] ,有诱导人急
性早幼粒细胞白血病(HL-60)和小鼠粒细胞白血病
(M1)细胞分化的作用[ 2] 。本研究探讨齐墩果酸对高
转移人肺癌(PGCL3)细胞增殖 、侵袭和凋亡的影响 。
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1　材料与方法
1.1　细胞株和主要试剂　克隆化高转移人肺巨细胞
癌细胞(PGCL3)从北京医科大学病理系引进;RPM I-
1 640培养基是GIBCO公司产品;层粘连蛋白(LN)、
纤粘连蛋白(FN)和基底膜胶(matrigel)由北京医科
大学提供;齐墩果酸 、溴乙啶 、吖啶橙和 Na-CBZ-l-Ly-
sine-p-ni trophenyl ester 为 S IGMA 公 司 产 品 ,
TUNEL-POD试剂盒为武汉博士德生物工程公司产
品。
1.2　细胞培养和药物处理　PGCL3细胞接种于含
10%小牛血清 pH 7.4的 RPM I-1 640培养基中 , 置
37℃、5%CO2培养箱中培养 ,至指数生长期进行实
验。齐墩果酸经细胞毒性试验和增殖抑制试验确定
药物浓度为35μmol/ L 和45μmol/ L ,设两个浓度的药
物处理组和一个对照组 ,每组 3瓶 ,每瓶接种 1×105
个细胞 ,接种 24h后加药 。
1.3　细胞增殖抑制率测定和软琼脂集落形成试验　
25 ～ 65μmol/L 齐墩果酸处理 96h ,收集细胞经台盼
蓝染色 ,进行细胞计数 ,计算细胞增殖抑制率 。
细胞增殖抑制率=(对照组细胞数-药物组细胞
数)/对照组细胞数×100%。
软琼脂集落形成试验按常规方法进行。
1.4　侵袭试验　参照 Albini等[ 3]所用方法 ,将作为
化学趋化物的 NIH3T3 细胞培养上清液0.2ml加入
Boyden小室的下室 ,在上下室之间用孔径 8μm 的聚
碳酸酯微孔滤膜分开 ,该膜预先铺上 Matrigel 溶液
50μl(含 Matrigel 120μg),并在 37℃聚合 30min以重
建基底膜。将各组已处理 96h 的细胞收集后分别加
入上室 ,每室加0.5m l(含 5×104 个细胞),在 37℃、
5%CO2 培养箱孵育 6h后取出滤膜 ,擦去未穿过的细
胞 ,固定后经Giemsa染色 ,计数穿膜的细胞数。
1.5　运动试验　参照 Kanto r 等[ 4] 所用方法 ,除用
7.5μg/ml FN代替 Matrigel溶液铺膜以促进细胞粘
着于膜上外 ,其余操作步骤和计数方法与侵袭试验相
同。
1.6　粘附试验　在参照 Kumagai 等人[ 5] 所用的方
法上进行改良 ,将各组处理 96h 的细胞制成无血清
RPM I-1 640的细胞悬液 ,接种于已包被 LN 的 96孔
板的孔内 ,每孔含 LN 10μg ,每孔加0.2ml细胞悬液
(含1 000个细胞)置 37℃、5%CO2 培养箱孵育 60min
后 ,倒置显微镜下计数细胞总数 ,弃去未粘附的细胞 ,
PBS轻洗 2次 ,镜下计数粘附细胞 ,计算粘附百分率 。
1.7　组织蛋白酶 B(CB)活性测定用酶动力学方法
测定。取各组药物处理 24h 后换无血清培养液培养
24h ,取上清液 100μl加激活液(含0.03M 二硫苏糖醇
和0.03M EDTA-NA2 溶液)200μl , 摇匀 , 25℃放置
15min使酶激活;加入 3ml 反应缓冲液(含0.003M
EDTA-NA2的0.025M pH 5.1醋酸缓冲液),混匀 ,加
底物 N-苄氧羰基-L-赖氨酰对硝基苯酯溶液 100μl
(5mg/L 的 DMSO 溶液),立刻混匀后每隔 1min 测
ΔA326nm 值 ,至反应变慢为止 , 然后进行酶活性计
算。酶活性单位是 25℃、pH 5.1的条件下 ,每分钟水
解 1μmol 底 物为一个酶活性单位 (U)。 U =
(ΔA326nm 测-ΔA326nm 空白)/7.58×10-3 。
1.8　细胞凋亡测定　检测细胞凋亡的吖啶橙(AO)-
溴乙啶(EB)荧光双染法按 Zhi-Jun等[ 6]的方法进行 ,
TUNEL DNA 片段末端标记法按武汉博士德生物工
程公司 TUNEL-POD试剂盒说明书方法进行。
1.9　统计学处理　用 SPSS 软件进行组间 t检验。
2　结果
2.1　齐墩果酸对 PGCL3细胞增殖的影响
药物处理 24h , PGCL3 细胞存活率与对照组无
明显差异 ,处理 3d以上对细胞增殖均有明显抑制作
用 ,见图 1。25 、35 、45 、55 和 65μmol/L 齐墩果酸处
理 96h , PGCL3 细胞增殖抑制率分别为 29.6%、
43.2%、54.5%、84.1%和97.3%,经计算 ,齐墩果酸
的 IC50为40.71μmol/L ,以下分别选取 35 、45μmol/L
的齐墩果酸作为实验浓度。
图 1　齐墩果酸对 PGL3 细胞生长的影响
2.2　齐墩果酸对 PGCL3 细胞软琼脂集落形成能力
的影响
35μmol/L 、45μmol/L ,齐墩果酸处理 4d PGCL3
细胞软琼脂集落形成数均低于对照组(P<0.05),见
表 1。
　　表 1 齐墩果酸对细胞集落形成能力的影响
组别 集落形成数 与对照组比较
对照组 308.7±24.2
35μmol/ L 168.3±10.4 P<0.05
45μmol/ L 118.6±11.0 P<0.05
2.3　齐墩果酸对 PGCL3细胞侵袭能力的影响
35μmol/L 、45μmol/L 齐墩果酸处理 4d后对 PG-
CL3细胞的穿膜侵袭能力均有显著抑制作用(P <
·181·肿瘤防治研究 2003年第 30卷第 3期
0.05和 P <0.001),且具有浓度依赖性 。上述浓度齐
墩果酸处理 2h ,细胞的侵袭能力无明显改变(P >
0.05),见表 2 、3。
2.4　齐墩果酸对 PGCL3细胞运动能力和粘附能力
的影响
药物处理 96h ,观察 PGCL3细胞的穿膜运动能
力和粘附能力 ,可见药物处理组的穿膜运动能力和粘
附能力均显著下降 ,(P <0.001)且具有浓度依赖性 ,
见表 4 、5。
　　表 2 齐墩果酸对细胞侵袭能力的影响
组别 穿膜细胞数 与对照组比较
对照组 504.0±20.9
35μmol/ L 339.0±11.5 P<0.001
45μmol/ L 118.6±11.0 P<0.05
　　表 3 齐墩果酸处理 2h 对细胞侵袭能力的影响
组别 穿膜细胞数 与对照组比较
对照组 291.6±12.1
35μmol/ L 278.6±10.6 P>0.05
45μmol/ L 271.3±12.3 P>0.05
　　表 4 齐墩果酸对细胞运动能力的影响
组别 穿膜细胞数 与对照组比较
对照组 271.6±10.4
35μmol/ L 84.7±4.2 P<0.001
45μmol/ L 60.0±4.2 P<0.001
　　表 5 齐墩果酸对细胞粘附能力的影响
组别 粘附细胞数 与对照组比较
对照组 32.0±4.4
35μmol/ L 22.3±0.5 P<0.001
45μmol/ L 12.2±1.3 P<0.001
2.5 　齐墩果酸对 PGCL3 细胞分泌组织蛋白酶 B
(CB)的影响
PGCL3细胞经药物处理 72h后换无血清培液培
养 24h ,培养液上清中组织蛋白酶 B 活性测定结果 ,
齐墩果酸处理组细胞分泌的 CB活性显著降低(P <
0.001),见表 6。
　　表 6 齐墩果酸对细胞分泌 CB活性的影响
组别 CB活性(u/ ml) 与对照组比较
对照组 5.0±1.3
35μmol/ L 3.6±1.0 P<0.05
45μmol/ L 3.4±1.2 P<0.05
2.6　齐墩果酸诱导人肺癌细胞凋亡的作用
齐墩果酸处理 PGCL3细胞 48h ,AO/EB荧光双
染法和 TUNEL 法测定细胞凋亡率 ,结果可见药物处
理使 PGCL3细胞凋亡率明显增加(P <0.05和 P <
0.01),见表 7 。
　　表 7 齐墩果酸对 PGCL3细胞凋亡的影响
组别 细胞凋亡率(%)
AO/ EB 法 TUNEL法
对照组 4.48±0.96 8.20±1.90
35μmol/ L 7.38±0.83■ 14.76±3.52＊
45μmol/ L 11.47±1.08＊ 22.91±5.31＊
　　t 测验 , ■P<0.05 , ＊P<0.01
3　讨论
本研究发现齐墩果酸既有抑制PGCL3细胞增殖
作用 ,又有抗侵袭和诱导凋亡作用 。
本研究结果显示齐墩果酸能明显抑制 PGCL3人
肺癌细胞增殖 ,其机理之一可能是诱导癌细胞恶性表
型逆转 ,本研究证明齐墩果酸使 PGCL3 细胞软琼脂
集落形成率显著下降 ,通常认为癌细胞在半固体琼脂
上形成集落的多少与其恶性程度呈正相关 。另一方
面由于该药物有诱导PGCL3细胞凋亡而使其细胞数
量减少。细胞凋亡是遵循一定程序的生理性细胞死
亡 ,其形态特征是以细胞核的变化为先导 ,早期出现
核固缩 ,最后细胞碎裂成凋亡小体;细胞凋亡的生化
特征是 Ca2+、Mg2+依赖的核酸内切酶激活使 DNA
断裂 ,本研究用反映细胞凋亡形态特征的 AO/EB荧
光双染法和高灵敏度特异反映细胞凋亡生化特征
———DNA聚合酶介导的原位缺口平移法 、TdT 介导
的 dUTP缺口末端标记(TUNEL 法)探测 DNA 的断
裂 ,证明该药物有诱导PGCL3细胞凋亡的作用 ,这可
能是细胞增殖抑制机理的另一方面。齐墩果酸属于
三萜类化合物 , Ito 等[ 7 ,8]最近发现新三萜类化合物
能诱导骨肉瘤细胞和 HL-60人早幼粒白血病细胞凋
亡 ,并提出凋亡机理与胱冬酶-8(Caspase-8)激活有
关。齐墩果酸诱导 PGCL3细胞凋亡尚未见报道 ,其
机理有待进一步探讨。
癌症的侵袭和转移是一个多步骤 、多因素 、多基
因的发展过程 。从分子水平可将这种过程人为分成
三步:粘附 ,肿瘤细胞与胞外基质中层粘连蛋白(LN)
和纤维连接蛋白(FN)相粘附;趋化运动 ,肿瘤细胞沿
着趋化剂的浓度梯度迁移;降解 ,即肿瘤细胞释放各
种水解酶类(组织蛋白酶 B 等),破坏其粘附部位的
组织 ,使肿瘤细胞得以向纵深移动远距离转移。在此
过程中 ,细胞粘附 ,细胞外基质降解以及细胞运动是
转移能否发生的决定环节。组织蛋白酶 B 与多种肿
瘤细胞的侵袭能力有关 ,恶性肿瘤细胞与正常细胞相
比 ,其组织蛋白酶 B活性显著增加 ,且转移性肿瘤细
胞的增加更明显。齐墩果酸体外抗侵袭作用尚未见
报道 ,本研究采用 Albini等人用天然基底膜胶重建基
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底膜的模型[ 3](肿瘤细胞体外侵袭模型)进行肿瘤细
胞侵袭定量实验 ,发现齐墩果酸具有明显抑制 PG-
CL3细胞侵袭的作用 。为了探讨其抗侵袭的机理 ,本
研究对癌细胞侵袭的三个基本环节 ———粘附 、运动和
降解进行分析研究发现 ,上述浓度药物处理后 , PG-
CL3细胞对层粘连蛋白的粘附能力 、趋化运动能力和
组织蛋白酶 B 的分泌均显著下降 ,并呈量效关系。
可见齐墩果酸抗 PGCL3细胞侵袭的作用是多方面
的 ,即侵袭作用的机理包括粘附 、运动和降解能力的
抑制 ,而不是对某一环节的阻断作用。这和细胞分化
诱导剂维甲酸和丁酸钠的抗侵袭作用十分相似。
Lotan[ 9]总结维甲类(含维甲酸)抗肿瘤侵袭和转移的
机制 ,认为是由于促进恶性细胞分化 ,从而抑制参与
侵袭的蛋白酶的产生 ,抑制肿瘤细胞的迁移和新血管
的生成等 。黄炜等[ 10]发现细胞分化诱导剂丁酸钠对
PGCL3细胞的粘附 、运动和侵袭均有明显的抑制作
用。以上研究均表明 ,细胞分化诱导剂对侵袭作用的
各个环节都呈抑制作用 ,而不是对个别环节的阻断作
用。齐墩果酸抗 PGCL3细胞侵袭的作用也具有上述
细胞分化诱导剂抗侵袭作用的特点 ,说明其抗侵袭作
用机理也是由于细胞分化所致。本研究用齐墩果酸
处理 PGCL3细胞2h后PGCL3细胞侵袭能力没有影
响 ,也说明该药物不直接阻断癌细胞的侵袭过程 ,只
有较长时间的处理才表现抗侵袭作用 ,因为细胞分化
需要经历复杂的基因表达调控的历程 。从本研究发
现的该药抗侵袭作用特点和软琼脂集落形成率变化
情况 ,说明齐墩果酸的抗侵袭作用可能是通过诱导细
胞恶性表型逆转即诱导细胞分化而实现的。因此 ,通
过诱导细胞分化来抑制癌细胞的侵袭 ,似乎是比较合
理的对策 。
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(李奇明校对)
·183·肿瘤防治研究 2003年第 30卷第 3期