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野生热带灵芝Ganoderma tropicum(Jungh.) Bres.菌种分离与驯化研究



全 文 :收稿日期:2008-09-17
基金项目:国家科技基础条件平台建设子项目(2005DKA21006);海南省教育厅高等学校科研资助项目
(Hjkj200614)
作者简介:刘国民(1955-),男 , 湖南祁东人 ,海南大学苦丁茶研究所教授 ,博士 , 博士生导师.
第 27卷 第 1期 海 南 大学 学 报自 然 科学 版 Vol.27No.1
2009年 3月 NATURALSCIENCEJOURNALOFHAINANUNIVERSITY Mar.2009
  文章编号:1004-1729(2009)01-0024-06
野生热带灵芝 Ganodermatropicum(Jungh.)Bres.
菌种分离与驯化研究
刘国民 1, 2 ,吴兴亮1 ,李娟玲1, 2 ,潘学峰 1, 2 ,王 康 2
(1.热带生物资源教育部重点实验室 海南大学;2.海南大学 苦丁茶研究所 , 海南 海口 570228)
摘 要:以新鲜的野生热带灵芝子实体为材料 ,经过表面消毒后 , 分别接种到米饭培养基 、CA培养基和 PDA
培养基上.结果表明 , 在这 3种供试培养基上均能获得纯化的菌丝体.米饭培养基上的菌丝体的生长速度最
快;其次为 PDA培养基;CA培养基的菌丝体生长最慢.对子实体 、担孢子和菌丝体的形态特征进行了系统的
形态学观察 ,证实所分离和驯化的菌种为热带灵芝 [ Ganodermatropicum(Jungh.)Bres.] .用木屑作为主要原
料制备培养料对热带灵芝进行了驯化栽培 , 实验结果表明 ,冬季较低温条件下形成的子实体多为鹿角状畸形
芝;而在 2月份中旬以后较高温度下形成的子实体多为正常的掌状子实体.笔者据此认为 ,在海口地区 , 热带
灵芝宜在春末至秋末气温较高的季节栽培.
关键词:热带灵芝;驯化;米饭培养基;CA培养基;PDA培养基
中图分类号:Q949.32    文献标识码:A
自 Donk(1948)建立灵芝科(Ganodermataceae)以来 ,目前全世界已报道的灵芝科大型真菌有效种类
共 200余种 [ 1] ,分别为灵芝属(GanodermaP.Karst.),假芝属(AmaurodermaMurril),鸡冠孢芝属(Had-
dowiaSteyaert)和网孢芝属(HumphreyaSteyaert)[ 2] .我国有记载的灵芝有 103种 ,其中 14种已被人们所利
用[ 1] .
灵芝在我国古代早就作为滋补强壮 、扶正培本的珍贵药材.东汉年间的 《神农本草经》、宋代的 《重修
政和经史证类备用本草 》以及明代的《本草纲目》等古典医书对灵芝的药用功效均有记载 ,认为灵芝具有
“益心气” 、“坚筋骨” 、“利关节 ”和 “治耳聋 ”等功效 [ 1] .现代科学也已经证实 ,灵芝富含具有药用功效成分
和保健作用的多种有效成分 ,具有明显的镇静 、镇痛 、强心 、止咳 、祛痰 、平喘 、降压 、降血糖 、降血压等功
效 ,可以增强冠状血管循环功能 ,促进肝脏合成血清蛋白 ,而且有抗肿癌和抗辐射损伤的作用 ,长期服用 ,
有美容 、抗衰老和益寿延年之功效 [ 1-9] .
海南的灵芝资源种类较丰富 ,在我国已报道的 103种灵芝中 ,海南已发现 79种 ,约占全国灵芝种类的
70%[ 1] .由于灵芝的显著药用功效和保健作用 ,国内外兴起了一股兴盛不衰的灵芝保健食品开发热 ,导致
人们对野生灵芝的过度采摘 ,再加上生态环境的人为破坏 ,某些灵芝种类目前在我国已十分罕见了.海南
岛的情况也不例外 ,近年来 ,海南岛的野生灵芝数量较之以前大为减少 ,其中包括热带灵芝(Ganoderma
tropicum(Jungh.)Bres.).
热带灵芝是我国已被人们所利用的 14种灵芝之一 [ 1] ,具有保肝健肝之功效 [ 10] ,福建民间常用来治冠
心病 ,亦被用于制作灵芝糖浆 [ 7] .鉴于近年来热带灵芝资源的减少趋势 ,笔者拟从野生热带灵芝中分离出
纯化的菌种并对其进行扩大繁殖 ,并在人工条件下进行驯化栽培 ,以便为热带灵芝的种质保存和生物学
特性研究等领域提供第一手资料 ,并为热带灵芝今后的产业开发(大批量人工栽培)提供科学依据和技术
支撑.
DOI :10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2009.01.005
1 实验材料与方法
1.1 材料 野生热带灵芝(Ganodermatropicum(Jungh.)Bres.)新鲜子实体(见图版 1:1)采自海口市海
南师范大学校园内的相思树(AcaciaauriculiformisA.Cunn.exBenth.)腐朽树桩上.经表面消毒后 ,切取
子实体小块作为接种材料.
1.2 方法
1.2.1 初代培养基成分(用于菌种分离) 
1.2.1.1 PDA培养基 按以下配比和方法制备:取去皮马铃薯 200 g,切成小块 ,加水 1000 mL煮沸 30
min,滤去马铃薯 ,将滤液补足至 1000 mL,加葡萄糖 20 g,琼脂 15g,溶化后分装 , 0.14 MPa灭菌 30min.
1.2.1.2 CA培养基 NaNO3 3g+MgSO4· 7H2O0.5g+KCl0.5g+FeSO4· 4H2O0.1g+K2HPO4 1g+
蔗糖 30g+琼脂 13 g+蒸馏水 1000mL.
1.2.1.3 米饭培养基 大米 20 g·瓶 -1 +营养液 30 mL·瓶 -1(以生产组培苗用的培养瓶为例计量).其
中营养液配方为:水解酪蛋白 10 g· L-1 +KH2PO4 2 g· L-1 +盐酸硫胺素 10 mg· L-1 +肌醇
100 mg·L-1 +蔗糖 10g·L-1 +柠檬酸钠 1 g·L-1 +盐酸吡哆素 5mg·L-1.
1.2.2 继代增殖培养基成分 用于已分离纯化的菌种之扩大繁殖以及为驯化栽培制备菌种.
1.2.2.1 米饭培养基 配方及制备方法同 2.2.1.3.
1.2.2.2 液体培养基 MS+肌醇 100 mg·L-1 +烟酸 0.5mg·L-1 +盐酸硫胺素 2.0 mg·L-1 +盐酸吡
哆素 1.0mg·L- +甘氨酸 2.0mg·L-1 +6-BA1.0mg·L-1 +IBA1.0mg·L-1 +蔗糖 30g· L-1 , pH5.8.
1.2.3 驯化栽培培养料配方及制备方法 木屑 w=78.9%;麦麸 w=10%;玉米粉 w=5%;谷糠 w=5%;
KH2PO4 w=0.1%;石灰 w=1%;其含水量约为 65%(以手抓料 ,紧握时有水滴挤出 ,松手后 ,培养料能自动
散开为度).将各种成分充分混匀后 ,每袋装料 1.2 kg,在 0.14/MPa, 121℃条件下灭菌 2h,冷却后备用 [ 11] .
1.2.4 菌种的分离(组织分离法) 取生长旺盛的新鲜子实体切成约 2 cm×2 cm小块 ,参照植物组织培
养的方法进行表面消毒(ρ=2g· L-1的 HgCl2溶液处理 12min后 ,用无菌水冲洗 3 ~ 4次),在超净工作台
上切取约 0.2cm×0.2cm的小块 ,分别接种到 CA, PDA和米饭培养基上.待新的菌丝体长出后 ,选取无杂
菌的菌瓶进行扩大培养 ,然后将人工培养基上所得的菌丝体作为菌种 ,接种到袋装培养料中进行人工栽
培.如能从袋装培养料中长出子实体 ,且所得子实体及其中的担孢子的形态与野生热带灵芝的形态一致 ,
即证明该菌种已分离提纯 ,可以作为种菌保存 ,或用于继续扩大培养和驯化栽培研究.
1.2.5 驯化栽培中的接种方法
1.2.5.1 液体接种法 当经过高温高压灭菌后的袋装培养料冷却到 30 ℃左右时抢温接种.用注射器把
菌液注入袋料内 ,每袋料约 50 mL种菌液 ,然后立即用透明胶带把插针孔封死.接种过程在超净工作台上
进行.
1.2.5.2 固体接种法 当经过高温高压灭菌后的袋装培养料冷却到 30 ℃左右时抢温接种.接种时打开
袋口 ,将用米饭培养基所培养的菌种接入袋装培养料内 ,接种后按原样扎紧袋口.接种过程在超净工作台
上进行.
1.2.6 培养条件 菌种分离及扩大繁殖期间 ,培养室温度为(25±2)℃;每天光照 10h,光照强度约 1500
lx.驯化栽培过程中 ,接种后 30 d内将菌袋置于塑料筐中(每筐 4层),于植物组织培养室内培养 ,以后转
入盖有双层 70%遮阳网的荫棚下的培养架上 ,并用塑料膜罩覆盖培养架保湿增温.每 2 d揭开膜罩在菌
袋上喷雾增湿 ,并促使培养环境中空气清新.膜内相对湿度控制在 90%左右 ,温度随室外气温昼夜变化而
有波动 ,但最高温度控制在 35 ℃以内.
2 结果与分析
2.1 初代培养与菌种分离结果 用作供试材料的子实体经表面消毒并分别接种到 PDA, CA,米饭培养
基上 ,约经 1周培养后 ,可观察到在不同的培养瓶中 ,陆续有白色菌丝形成;随着培养时间的延长 ,菌丝逐
渐增多加厚形成菌苔 ,并从接种材料处向四周扩展.
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白色菌丝及菌苔出现的早迟 ,以及菌丝的扩展速度 ,均与培养基的种类密切相关.但即使是同一种培
养基 ,不同培养瓶中白色菌丝出现的快慢 ,以及菌苔的扩展速度 ,均不是完全同步的.总体上说 ,米饭培养
基上白色菌丝出现最早 ,菌苔扩展最快;其次为 PDA培养基;CA培养基多数培养瓶中出现菌丝的时间要
比米饭培养基和 PDA培养基晚 2 ~ 3 d,菌丝生长速度最慢 ,菌苔向周边扩展的速度亦最慢(图版 2).
3种培养基中 ,各有 20%左右的菌瓶出现杂菌污染.也就是说 ,在这 3种培养基上 ,菌种的分离纯化率
均接近 80%.清除被杂菌污染的菌瓶 ,并淘汰菌丝生长弱的菌瓶 ,将颜色纯正 、菌丝体生长势旺势的菌瓶
作好标号 ,用其作为母种分别扩大繁殖 ,并将部分米饭培养基制备的菌瓶作为菌种 ,直接接到驯化栽培用
的袋装培养料中 ,进行驯化栽培初步试验.
2.2 菌丝体在继代培养中的生长表现 在以 PDA培养基和 CA培养基进行继代培养以观察菌丝体在继
代培养中的生长表现时 ,笔者是用培养皿平面培养基进行试验的 ,菌种为在米饭培养基上培养 30 d的热
带灵芝菌丝体 ,每个培养皿转接半粒米饭大小的菌种 ,置于培养皿平面培养基的正中央.转接后对菌丝体
生长 、菌苔扩展以及菌苔颜色变化等情况作定期观察 ,所得结果如表 1所示.
由表 1可以看出 ,同一瓶菌种同期接种在 CA和 PDA2种培养基上进行继代培养 , CA培养基上一直
没有观察到菌苔形成 ,而在 PDA培养基上 ,菌丝体则能正常生长与增殖 ,表现为在接种后第 6天可观察到
直径为 0.5 cm左右的菌苔 , 7 ~ 15 d范围内菌苔直径迅速扩展 ,以后扩展的速度减慢.CA培养基在初代
培养(分离培养)阶段已显示出对热带灵芝菌丝体培养不太适用 ,因为菌丝生长速度是 3种供试培养基中
最慢的.在继代培养中 , CA培养基上一直未观察到菌苔形成.其原因可能是 CA培养基的化学成分过于简
单 ,不适应热带灵芝菌丝体的生长发育 ,但确切的原因尚需作进一步的研究才能作最后结论.
表 1 野生热带灵芝菌丝体在继代培养过程中的表现
观察日期(月 /日) 在 CA培养基上的培养表现 在 PDA培养基上的培养表现
4/22 无明显变化 , 未观察到菌丝形成 可见白色菌苔 ,直径长约 0.5 cm
4/25 同上 菌苔有所扩展 ,直径平均为 3.9 cm,呈纯白色
4/28 同上 菌苔进一步扩展 ,直径平均为 8.0 cm,纯白色
5/1 同上 菌苔直径平均达 9.0 cm, 白色
5/4 同上 菌苔直径平均达 11.0cm, 菌苔大部分白色, 杂有少量褐色斑纹或斑块
5/7 同上 菌苔直径达 12.0 cm, 已覆盖培养基的整个表面(培养皿直径 12.0cm), 菌苔中央为白色 ,周围的斑纹或斑块颜色较前次观察时加深.
5/9 同上 菌苔顺着培养皿周壁向上扩展 ,斑纹或斑块转为褐色
    注:接种日期为 4月 19日.
2.3 驯化栽培实验结果
2.3.1 不同接种方法的栽培结果 在驯化栽培中 ,第 1批接种时我们采用了固体接种(用米饭培养基制
备菌种)和液体接种(用液体培养基制备菌种)2种方法.这 2种接种方法均可成功地将菌种接种到袋装
培养料中 ,并产生菌丝体 ,进而发育形成子实体.一般在接种后 7 ~ 8d即可相继在一些菌袋的膜内培养料
表层见到成片分布的白色菌丝体 ,这些白色块状菌丝体随着培养时间的延长 ,逐渐扩散到整个菌袋的培
养料中.此时 ,即可把菌袋移至出芝房(荫棚下的培养架上)继续培养 ,并随即进行出芝期的相应管理.
在我们的实验中 , 2种接种方法比较起来 ,液体接种法出现白色块状菌丝体的时间要晚 2 ~ 3 d,且菌
丝体在培养料中的扩展速度亦相应地比采用米饭培养基的处理要慢一些.笔者对这一现象的分析是:①
我们采用的液体菌种培养时间偏长(25 d),错过了最佳的接种时期;②采用固体法接种 ,菌种(带菌丝体的
米饭培养基)接入的量较多 ,且用无菌玻璃棒将菌种插入了培养料中间及底层 ,所以 ,接种后 ,菌丝体扩展较
快.由此可以看出 ,接种方法 、接入的菌种量以及菌种的质量均会在一定程度上影响到驯化栽培的效果.
3.4 气候对热带灵芝驯化过程的影响 本实验中采用了反季节栽培与正常栽培 2种处理以比较气候条
件(主要是气温)对热带灵芝驯化过程的影响.第 1批材料为反季节栽培 ,于 10月 25日接种(固体接种
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法;用米饭培养基制备菌种), 12月中旬开始出芝.出芝后 ,子实体的生长发育过程正处于 12月份和 1月
份的冬季低温阶段 ,由于温度条件不能满足热带灵芝子实体正常生长发育的需要 ,故首批驯化栽培的热
带灵芝 ,在冬季低温条件下表现为出芝较慢 ,而且出芝后子实体生长发育缓慢 ,所形成的子实体大都为一
些鹿角状的畸形芝(图版 1:3 ~ 6).
第 2批驯化栽培的材料于 12月 5日接种 , 2月中旬开始出芝 ,出芝后气温已明显回升 ,能较好地满足
热带灵芝子实体生长发育对温度的要求.所以 ,第 2批驯化栽培的材料子实体生长发育正常 ,能产生正常
的掌状菌盖 ,很少畸形芝(图版 3).
由以上实验结果可以看出 ,热带灵芝的菌丝体生长发育 ,出芝过程 ,以及出芝后子实体的生长发育均
需要一个高温高湿的环境条件.在海口地区进行热带灵芝的人工栽培时 ,如无有效的控温控湿设施 ,宜将
出芝时间安排在春末至秋末这段时间;有控温控湿条件的单位则可以进行反季节栽培 ,但必须能做到将
温度有效地控制在不同发育阶段所需的最适温度范围.
3.5菌种的鉴定与保存 由野生的热带灵芝分离提纯菌丝体 ,经扩大繁殖后 ,接种到袋装培养料上 ,形成
了与野生热带灵芝形态相同的子实体和担孢子(图版 3和图版 2:10).经袋装培养料人工栽培所获得的子
实体和由其产生的担孢子 ,其形态特征如下:
子实体 无柄到有柄 ,木栓质到木质.菌盖半圆形 、圆形 、扇形 、肾形 、近漏斗形或不规则形 ,往往在菌
盖上面有小菌盖 , 3 ~ 18 cm×4 ~ 18 cm,厚 0.5 ~ 2.5 cm,表面黄褐色 、红褐色到紫红色 ,有似漆样光泽或
较弱 ,同心环纹不明显 ,边缘较薄 ,颜色变浅至黄白色或淡褐色;菌肉均匀的褐色 ,厚 0.5 ~ 2 cm,无黑色
壳质层;菌管长 0.1 ~ 0.5 cm,褐色;孔面污白或淡褐色至褐色;管口近圆形或不规则 ,每毫米 4 ~ 5个.菌
柄中生 、侧生 、偏生或近无柄 ,长 1.5 ~ 7cm,粗 1 ~ 3 cm,近椭圆形或粗细不等 ,与菌盖同色或较深 ,有较强
的似漆样光泽.皮壳构造呈拟子实层型 , 淡褐色 ,组成菌丝顶端膨大或稍膨大呈棍棒状 , 顶端通常宽
4 ~ 6 μm,长 17.5 ~ 2 μm.菌丝系统三体型:生殖菌丝透明 ,薄壁 ,直径 2.5 ~ 4 μm;骨架菌丝体淡褐色 ,厚
壁到实心 ,树状分枝 ,骨架干直径 4 ~ 5 μm,分枝末端形成鞭毛状无色绕菌丝;缠绕菌丝厚壁 ,分枝 ,直径
1 ~ 2 μm.
担孢子 卵圆形 ,近椭圆形或顶端平截.双层壁 ,外壁透明 ,平滑;内壁淡褐色 , 有小刺 , (8.8 ~
10.5)μm×(5 ~ 7)μm(图版 2:10).
上述形态特征可以直接证实 ,在实验中所分离的菌种确实已纯化 ,而且可以依据 《中国灵芝图鉴 》[ 1]
和《中国灵芝新编》[ 2]将其种名鉴定为热带灵芝 Ganodermatropicum(Jungh.)Bres.,故可以将驯化栽培
中所使用的菌种作为热带灵芝 G.tropicum的种菌长期保存起来 ,以备日后科研 、教学和产业开发之所需.
与此同时 ,我们已决定将该菌种提交中国西南野生生物种质资源库长期保存.
3 讨论与小结
3.1 关于菌种的分离方法 大型真菌的菌种分离方法主要有孢子分离法和组织分离法 2种方法.本实
验中采用的是一种类似于植物组织培养中对外植体进行表面消毒然后分割接种的组织分离法.实验结果
证明 ,这种方法能够较容易地获得纯净的灵芝菌种.只要有超净工作台的单位 ,均可方便采用这种方法分
离菌种.事实上 ,用这种方法分离热带灵芝的菌种 ,成功率高达 80%.因此 ,组织分离法完全可以作为灵芝
科大型真菌菌种分离的一种常用方法.
3.2 关于热带灵芝的适宜栽培季节 药用灵芝的人工栽培 ,此前仅限于灵芝 [ Ganodermalucidum(Cur-
tis:Fr.)P.Karst.]和紫芝(G.sinense.J.D.Zhao, L.W.HsuetX.Q.Zhang.)等极少数菌种.如果在
有良好的控温控湿设施条件下 ,一年四季均可进行人工栽培 ,就不存在一个适宜栽培季节的问题.但在多
数情况下 ,生产上栽培灵芝并不具备良好的控温控湿条件 ,因而选择适宜的栽培季节至关重要.不同种类
的灵芝 ,以及不同的地区对栽培季节的要求有所不同.通常 ,原产热带地区 ,或在自然条件下通常是在高
温高湿季节出芝的灵芝种类 ,在人工栽培时 ,宜将出芝时间安排在气温较高的季节.如出芝后较长时间处
于低温条件下 ,则往往表现为子实体生长缓慢 ,而且所形成的大都是畸形芝.我们于 10月下旬驯化栽培
的第 1批接种材料 ,是属于反季节栽培 ,结果表现为出芝慢 ,出芝后子实体生长极为缓慢 ,而且绝大部分
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为畸形芝.第 2批接种材料 ,出芝后 ,子实体的生长发育处于 3 ~ 5月的较高气温条件下 ,子实体生长迅速 ,
而且所形成的均为具掌状菌盖的正常灵芝.可见 ,在海口地区栽培热带灵芝时 ,要注意避开低温季节 ,宜
将出芝时间安排在春末至秋末之间为好.
图版 1 1:本课题中用作实验材料的野生热带灵芝子实体;2:接种到袋装培养料上的菌种 , 培养至 45 d时 ,大部
分袋装培养料中出现白色块状菌丝体;3:开始出现子实体(幼体);4, 5, 6:在冬季低温条件下进行反季节栽培时 ,
出现的子实体大都为鹿角状的畸形芝;7:课题小组的成员正在观看袋装培养料中菌丝体的生长发育情况.
图版 2 1, 2, 3:培养在 PDA培养基上的菌丝体 , 有少数培养瓶中形成了子实体(幼体), 其中 1:侧面观 , 2:正面
观 , 3:背面观;4, 5, 6:培养在 PDA培养基上的菌丝体 ,从接种后 30 d左右 , 有菌丝体开始顺着瓶壁向上生长 , 形
态各异 ,菌苔有褐色斑纹;7, 8, 9:分别为培养在米饭培养基 、PDA培养基和 CA培养基上的菌丝体生长情况(接种
后 45 d);10:由袋料栽培获得的子实体所产生的担孢子(100×物镜下).
图版 3 1, 2, 3:在高温高湿条件下 , 子实体幼体的菌盖即比较平展;4, 5, 6, 7, 8, 10:成熟的子实体 ,表面覆盖一层
褐色的孢子粉;9:示子实体的背面呈白色 , 具有典型的菌柄结构.
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StudyontheSpawnIsolationandDomestication
oftheWildGanodermatropicum(Jungh.)Bres.
LIUGuo-min1, 2 , WUXing-liang1 , LIJuan-ling1, 2 , PANXue-feng1, 2 , WANGKang2
(1.TheKeyLaboratoryofTropicalBiologicalResearches, MOE, HainanUniversity, Haikou570228, China;
2.TheKudingchaResearchInstituteofHainanUniversity, Haikou570228, China)
Abstract:ThespawnisolationanddomesticationofthewildGanodermatropicum(Jungh.)Bres.wasreported
inthispaper.Thefresh, wildfruitbodyofthefreshwildG.tropicumwasusedasthetestmaterial.Aftersterili-
zation, thesmalpiecesofthefruitbodywereinoculatedontotheRiceMedium, PDAMediumandCAMedium,
respectively.Theresultsshowedthatthepurifiedmyceliacouldbeobtainedonalthe3mediatested.Thepuri-
fiedmyceliaculturedontheRiceMediumgrewthefastestthanthatonthePDAMedium.Thosecultivatedonthe
CAMediumgrewtheslowest.Themorphologicalcharacteristicsofthefruitbodies, basidiosporesandmycelia
wereobserved, andtheresultsprovedthatthespawnisolatedanddomesticatedwereGanodermatropicum
(Jungh.)Bres..ThesawdustwasusedasthemainrawmaterialofthecultivatingmediumtodomesticateG.
tropicum.Theexperimentresultsshowedthatmostofthefruitbodiesformedunderthelowtemperatureinwinter
weretheabnormaldeerhornshapedGanoderma, andthatmostofthefruitbodiesformedunderthehighertem-
perature(themiddletendaysofFebruarylater)werethenormalpalmshapedGanoderma.Fromtheresultsof
thisexperimentwethoughtthatG.tropicumshouldbecultivatedundertheconditionswithhighertemperature
fromtheendofspringtotheendofautumninHaikouarea.
Keywords:Ganodermatropicum(Jungh.)Bres.;domestication;Ricemedium;CAmedium;PDAmedium
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