全 文 ：书收稿日期:2012-06-20; 修订日期:2012-10-29
基金项目:广西自然科学基金面上项目( No． 2011GXNSFA018296)
作者简介:陈晓白( 1961-) ，女( 汉族) ，广西玉林人，现任玉林师范学院生
命科学与技术学院副教授，学士学位，主要从事中药药理学研究工作．
彗星实验评价牛大力对60 Co γ射线致
小鼠 DNA损伤的防护
陈晓白，王晓平，赵仕花
(玉林师范学院生命科学与技术学院，广西 玉林 537000)
摘要:目的 探讨牛大力对小鼠辐射损伤的防护作用。方法 40 只小鼠随机分为阴性对照组、辐射模型组、牛大力低( 5g
·kg －1·d －1 ) 、中( 10g·kg －1·d －1 ) 、高( 20g·kg －1·d －1 ) 剂量组。用 5Gy 60Co γ射线对除阴性对照组外的各组小鼠进
行一次性全身均匀照射，制成放射损伤动物模型。牛大力剂量组小鼠在照射前 4 d 及照射后 10 d，以相应剂量的牛大力
煎煮液连续灌胃 14 d，最后一次灌胃 24 h后处死小鼠，取肝、肾、肺、睾丸、脾组织进行彗星实验。结果 小鼠在接受60Co γ
射线照射后，牛大力剂量组各组织细胞尾部 DNA百分率( Tail DNA% ) 和尾矩( Tail Moment) 与辐射模型组相比，明显降
低 ( P ＜ 0． 01) ，并随着牛大力的浓度增加，Tail DNA%和 Tail Moment 逐步减少，呈明显的量效关系。结论 在一定剂量
下，中药牛大力对60Co γ射线诱导的小鼠 DNA损伤有不同程度的保护和修复作用。
关键词:牛大力; 彗星实验; 60Coγ射线; DNA损伤
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 01． 032
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2013) 01-0076-02
To evaluation the protection of Ｒadix Millettiae Speciosae on mice DNA damage induced
by 60Coγ － rays by comet assay
CHEN Xiao-bai，WANG Xiao-ping，ZHAO Shi-hua
( College of Life Science and Technology，Yulin Normal University，Yulin Guangxi 537000，China)
Abstract: Objective To study the protection of Ｒadix Millettiae Speciosae on mice radiation damage． Methods The 40 mice
were divided into negative control group，radiation model group，Ｒadix Millettiae Speciose group with low( 5 g·kg －1·d －1 ) ，
middle ( 10 g·kg －1·d －1 ) or high( 20 g·kg －1·d －1 ) doses． In order to establish the radiation model in mice，in addition to
the negative control group，the other mice were irradiated with 5Gy 60Co γ － rays． Ｒadix Millettiae Speciose group mice were given
with Ｒadix Millettiae Speciose for 4 days before irradiation and then continuously administered with Ｒadix Millettiae Speciose for
10 days after irradiation，negative control group and radiation model group were given with normal saline by gavage，once a day．
After the last dose 24 hours ，Mice DNA damage of liver，kidney，lung，testicular，spleen cells was detected by comet assay． Ｒe-
sults Compared with radiation model group ，Tail DNA% and Tail Moment of liver，kidney，lung，testicular，spleen cells in Ｒa-
dix Millettiae Speciose group had significantly lower ( P ＜ 0． 01) ，and with the concentration of Ｒadix Millettiae Speciosae in-
creased，Tail DNA% and Tail Moment gradually reduced，its effects were dose － dependent． Conclusion Ｒadix Millettia Speciosa
had protection on mice DNA damage induced by 60Co γ － rays．
Key words: Ｒadix Millettiae Speciosae; Comet assay; 60Co γ － rays; DNA damage
中药牛大力(Ｒadix Millettiae Speciosae，ＲMS)来源于豆科崖
豆藤属植物美丽崖豆藤的干燥根，有补肺滋肾、清热止咳、舒筋活
络等功效，主治肺虚咳嗽、咳血、肾虚、腰膝酸痛、遗精、白带、风湿
痹痛、跌打损伤、慢性肝炎等［1］。在华南地区广泛用作补腰肾、
强筋骨的煲汤原料，为两广地区著名的药食两用植物。是《广西
中药材标准》(1990 年版)收载的地方药材，近代本草中也多有
收载。近年来虽有关于牛大力护肝、平喘及调节机体免疫功能等
方面的研究报道［2］，但其药理活性的研究还很有限。为了更好
地开发、利用这一中草药资源，笔者采用单细胞凝胶电泳技术
(彗星实验) ，观察牛大力对60 Co γ射线致小鼠 DNA损伤的防护
作用。
1 材料与仪器
1． 1 动物 40 只昆明种小鼠，SPF级，雄性，体质量(20 ± 2)g(购
于广西医科大学医学实验动物中心，生产许可证号:SCXK 桂
2009 － 0002)。
1． 2 药物及主要试剂 牛大力:购于广西玉林市中药材公司，经
王晓平教授鉴定为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤 Millettia spe-
ciosa Champ干燥的根;正常熔点琼脂糖(NMA)、低熔点琼脂糖
(LMA)、十二烷基肌氨酸钠(SLS) :Sigma 公司;TritonX － 100、溴
化乙啶(EB)染液:Premega公司;二甲基亚砜(DMSO)、乙二胺四
乙酸二钠(Na2EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris － base)、氢氧化
钠(NaOH)、氯化钠(NaCl)、苔盼蓝均为国产分析纯。
1． 3 仪器 FYC － 50H60 Co γ 治疗机(上海医用核子仪器厂) ;
DYY － III33A 型电泳槽、DYY － 12 型电泳仪(北京市六一仪器
厂) ;正置荧光相差生物显微镜(型号:BX51TＲ － 32FB3F01，O-
lympus公司) ;150 万相素接口数字功能输出相机(CCD，日本 Ni-
kon 公司) ;L420 台式低速自动平衡离心机(长江湘仪离心机仪
器有限公司)。
2 方法
2． 1 牛大力煎煮液的制备 称取一定量的牛大力，第 1 次用 10
倍水浸泡 1 h，煮沸 1 h，取出煎煮液;第 2 次用 8 倍水煮 1 h，取出
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书煎煮液;合并两次提取液并浓缩至相当生药 2g·ml －1，置于 4℃
冰箱内保存备用，用时加蒸馏水稀释至所需浓度。
2． 2 动物分组及处理 实验参考文献［3，4］进行，并略加改进。40
只小鼠，随机分为 5 组，每组 8 只:阴性对照组、辐射模型组、牛大
力低(5 g·kg －1·d －1)、中(10 g·kg －1·d －1)、高(20 g·kg －1·
d －1)剂量组。小鼠购回适应性饲养 1 周后进行实验。除阴性对
照组外，对其余各组小鼠用60 Co γ 射线一次性全身均匀照射，照
射野 18 cm × 18 cm，源皮距为 75 cm，照射剂量为 5Gy，制成放射
损伤动物模型。牛大力剂量组小鼠在照射前 4 d 及照射后 10 d，
以相应剂量的牛大力煎煮液连续灌胃 14d，阴性对照组、辐射模
型组灌以等量生理盐水，每天 1 次，最后 1 次灌胃 24 h 后处死小
鼠，取肝、肾、肺、睾丸、脾组织进行单细胞凝胶电泳试验。
2． 3 小鼠细胞悬液的制备 摘眼球放血后颈椎脱臼法处死小鼠，
快速取出肝、肾、肺、睾丸、脾分别放于玻璃平皿内，用预热的
37℃的 PBS洗 2 遍，然后剪碎，以一定量的 PBS 液稀释后，过滤，
收集细胞液于离心管中，1 000 r·min －1离心 5min，弃上清液，将
离心管底部细胞重悬浮，将细胞浓度调整为 105 ～ 106 个 /ml，在
光镜下用台盼蓝法检测活细胞率在 95%以上。将制备好的细胞
悬液放在 4℃的冰箱内保存备用。
2． 4 单细胞凝胶电泳实验 实验参考文献［3，4］进行。
2． 4． 1 制片 将 250 μl、质量分数为 1%的正常熔点琼脂糖浇到
预热的全磨沙粗面载玻片(75 mm × 25 mm)上展开，待其固化后
取 100 μl、质量分数为 0． 8%低熔点琼脂糖和细胞悬液(体积比
为 5∶ 3)铺在第 1 层胶上，第 2 层胶固化后，铺第 3 层胶(质量分
数为 0． 8%正常熔点琼脂糖 100 μl)。固化条件均为 4℃，10 min。
2． 4． 2 细胞裂解 去第三层上的盖玻片，将固化好的凝胶片放
入新配置的经预冷的碱性细胞裂解液 (2． 5 mol·L －1 NaC，100
mmol·L －1 Na2EDTA，10 mmol·L
－1 Tris － base，1%十二烷基肌
氨酸钠，临用前加终浓度为 1% TritonX － 100，10% DMSO，pH10．
0)中，在 4℃冰箱内避光裂解 2 h。裂解结束后用蒸馏水充分清
洗玻片 3 次，每次 5 min，以洗去裂解液中高浓度的盐。
2． 4． 3 细胞 DNA解旋及电泳 将裂解好的载玻片置于新配制的
电泳缓冲液(1mmol·L －1 Na2EDTA，300 mmol·L
－1 NaOH，pH
13． 0)中，室温下调节缓冲液液面高于玻片 2 mm，避光静置 20
min，让 DNA充分解旋后，于电压 19V 和电流 195 mA 下电泳 20
min。全过程均在避光下进行。
2． 4． 4 中和和染色 电泳完毕，将载玻片浸入 0． 4 mol·L －1 Tris
－ base缓冲液(pH7． 5)中和 45min。然后用 2μg·ml －1的 EB 染
色 5 ～ 10s，迅速用双蒸水洗净，24h内在荧光显微镜下观察。
2． 4． 5 拍照与分析 每只老鼠随机观察 50 个细胞，由 CCD 拍
摄，用 CASP彗星图像分析软件自动分析。分析指标为国际公认
的尾部 DNA 百分率(Tail DNA%)和尾矩(Tail Moment)。其中
Tail DNA%为单一的彗尾强度指标，Tail Moment 为复合指标，定
义为彗尾 DNA 百分率和彗尾长度的乘积。以上步骤在暗处进
行，避免其他原因所致的 DNA损伤。
2． 5 数据的统计分析 采用 Origin 7． 0 统计分析软件进行数据
分析。实验结果以 珋x ± s表示。
3 结果
表 1 ～ 2 结果显示，小鼠在接受照射后，辐射模型组小鼠各细
胞 Tail DNA%、Tail Moment明显高于阴性对照组，差异具有统计
学意义(P ＜ 0． 01) ，提示造模成功，60 Co γ 射线对小鼠细胞 DAN
有损伤作用。牛大力剂量组各细胞 Tail DNA%和 Tail Moment与
阴性对照组比也有明显增高，但与辐射模型组比明显降低(P ＜
0． 01) ，并随着牛大力的浓度增加，Tail DNA%和 Tail Moment 逐
步减少，呈现明显的量效关系。结果说明牛大力对60 Co γ射线诱
导的小鼠各组织细胞 DNA损伤有一定的保护和修复作用。
表 1 牛大力对小鼠细胞 Tail DNA%的影响(珋x ± s)
组别 肺 肝 睾丸 脾 肾
阴性对照 3． 44 ± 0． 45 4． 97 ± 0． 97 3． 73 ± 0． 58 2． 65 ± 0． 95 2． 21 ± 0． 73
辐射模型 36． 57 ± 1． 35＊＊ 33． 70 ± 2． 34＊＊ 38． 08 ± 1． 71＊＊ 31． 03 ± 1． 87＊＊ 31． 97 ± 1． 85＊＊
ＲMS低剂量 24． 35 ± 2． 31＊＊## 21． 71 ± 2． 51＊＊## 23． 73 ± 2． 63＊＊## 18． 05 ± 2． 24＊＊## 16． 71 ± 1． 80＊＊##
ＲMS中剂量 14． 03 ± 1． 34＊＊## 15． 22 ± 1． 68＊＊## 15． 95 ± 1． 49＊＊## 13． 81 ± 1． 49＊＊## 12． 56 ± 0． 93＊＊##
ＲMS高剂量 9． 25 ± 0． 96＊＊## 9． 50 ± 1． 54＊＊## 8． 93 ± 1． 20＊＊## 6． 81 ± 1． 12＊＊## 7． 77 ± 0． 96＊＊##
与阴性对照组比较，＊＊P﹤ 0． 01;与辐射模型组比较，##P﹤ 0． 01
表 2 牛大力对小鼠细胞 Tail Moment的影响(珋x ± s)
组别 肺 肝 睾丸 脾 肾
阴性对照 0． 30 ± 0． 06 0． 92 ± 0． 34 0． 49 ± 0． 12 0． 54 ± 0． 34 0． 32 ± 0． 18
辐射模型 23． 16 ± 1． 60＊＊ 18． 19 ± 1． 93＊＊ 16． 17 ± 1． 26＊＊ 17． 68 ± 0． 86＊＊ 14． 15 ± 1． 46＊＊
ＲMS低剂量 8． 41 ± 1． 21＊＊## 8． 36 ± 1． 36＊＊## 7． 97 ± 1． 19＊＊## 7． 94 ± 1． 92＊＊## 4． 04 ± 0． 58＊＊##
ＲMS中剂量 4． 06 ± 0． 57＊＊## 4． 04 ± 0． 85＊＊## 3． 52 ± 0． 47＊＊## 3． 95 ± 0． 65＊＊## 2． 70 ± 0． 39＊＊##
ＲMS高剂量 2． 08 ± 0． 34＊＊## 3． 06 ± 0． 76＊＊## 2． 17 ± 0． 40＊＊## 1． 63 ± 0． 39* ## 1． 45 ± 0． 24＊＊##
与阴性对照组比，* P﹤ 0． 05，＊＊P﹤ 0． 01;与辐射模型组比，##P﹤ 0． 01
4 讨论
传统医学认为辐射损伤表现为热毒炽盛、气血两虚和阴阳失
调等症状，而具有清热解毒、活血化瘀、补血益气等作用的中草药
均有不同程度的抗辐射、抗诱变作用，特别是一些滋补类中药如
党参、黄芪、五味子等及滋阴补阳复方制剂等在这方面的作用显
得尤为突出。
本课题研究的中药牛大力，性甘平，药性属滋补类，有补肺滋
肾、舒筋活络、调节免疫等功效。为了研究牛大力的抗辐射作用，
本实验采用动物实验方法，通过60Co γ射线照射建立相关的辐射
模型，用牛大力对模型动物实施灌胃处理，利用单细胞凝胶电泳
检测技术，在细胞水平观察中药牛大力抗辐射的活性。
单细胞凝胶电泳(single cell gelelectrophoresis assay，SCGE) ，
又称彗星实验(comet assay)。是最先由 Osfling 和 Johanson［5］于
1984 年提出，后来经过 Singh 等［6］改进用于检测有核细胞 DNA
损伤的技术，可在单个细胞水平上检测 DNA 损伤和修复。其原
理主要是细胞裂解及 DNA 解旋后，在电泳过程中，断裂的 DNA
碎片会因携带负电荷而向阳极移动，未解旋的 DNA在原位不动，
经溴化乙锭染色后，核在原位形成一个明亮的头部，断裂的 DNA
形成扫把状的彗星。损伤越严重，碎片越多，形成的尾部也越
长［7］。单细胞凝胶电泳技术具有能快速检测、灵敏度高和方法操
作简单方便、无须放射物标记等优点，因此被广泛应用于生物学、
毒理学、DNA的断裂和修复、环境生物检测、药物筛选以及肿瘤、
衰老、凋亡机制的研究。
实验结果显示，小鼠在接受60 Co γ 射线照射后，牛大力剂量
组细胞 Tail DNA%和 Tail Moment 与阴性对照组比有明显增高，
但与辐射模型组比明显降低 (P ＜ 0． 01) ，并随着牛大力的浓度
增加，Tail DNA%和 Tail Moment 逐步减少，呈现明显的量效关
系。结果说明牛大力对小鼠各组织细胞 DNA的60 Co γ射线损伤
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书有一定的保护和修复作用。
中药抗辐射机制主要通过对造血系统、免疫系统的保护，清
除自由基、抗氧化、保护 DNA 发挥作用。牛大力含有生物碱、香
豆素类、多糖类、三萜类化合物及植物甾醇等成分［8］，这些物质都
有一定的抗氧化、增强免疫、抗突变、抗辐射作用。生物碱类如骆
驼蓬碱对造血组织具有保护作用，可以显著促进60 Co γ射线照射
小鼠外周血血小板数和白细胞数的回升，可明显提高受照小鼠的
存活率［9］。香豆素类可以抑制磷酸二酯酶，使细胞内 cAMP浓度
增加，从而产生辐射防护作用［10］。多糖类如当归多糖 ASP 组分
可增强细胞 DNA损伤修复能力，促进辐照后细胞的抗氧化能力，
保护细胞膜结构的完整，减轻 DNA 损伤，对 3Gy60 Co γ 射线辐射
损伤小鼠具有良好的防护作用［11］。现代药理研究表明牛大力有
调节免疫、抗氧化、抗炎、抗肿瘤作用、护肝、祛痰、镇咳和平喘作
用［2］。牛大力这些作用和成分可能是其对辐射损伤具有保护和
修复作用的基础。
综上所述，牛大力对60Co γ射线辐射损伤具有一定的防护作
用，但其作用机制需进一步深入研究。
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收稿日期:2012-02-09; 修订日期:2012-10-29
基金项目:广西自然科学基金( No． 2010GXNSFC013024) ; 广西教育厅项目( No． 200911MS166) ; 广西中医药管理局资助项目( No． GZKZ09 － 72) ;
教育部回国基金项目
作者简介:邱华锋( 1985-) ，男( 汉族) ，河南驻马店人，现任桂林医学院住院医师，硕士学位，主要从事外科学研究工作．
* 通讯作者简介:雷 迅( 1956-) ，男( 汉族) ，湖南长沙人，现任桂林医学院教授，硕士研究生导师，硕士学位，主要从事鼻咽癌的基础与临床研究工作．
鞣花酸对鼻咽癌 CNE-2 细胞
增殖及凋亡的影响
邱华锋1，雷 迅1，2* ，范才文2，向 秋2
(1．桂林医学院附属医院，广西 桂林 541000;2．桂林医学院，广西 桂林 541000)
摘要:目的 探讨鞣花酸抗鼻咽癌的生物学活性。方法 鼻咽癌 CNE － 2 细胞传代培养，第 2 天，实验组分别给予 2，4 和 6
mg /L鞣花酸干预 48 h，对照组不予干预。MTT 法检测细胞增殖; Hoechst 染色和流式细胞仪分析细胞凋亡。结果 干预
48 h后，随鞣花酸浓度增加，活细胞减少，漂浮的死细胞增多; Hoechst染色细胞核出现核固缩、核碎裂的现象，细胞出现明
显的抑制和凋亡现象。不同浓度用药组细胞抑制率及凋亡率明显升高，且明显高于对照组( P ＜ 0． 05) 。结论 鞣花酸能
抑制鼻咽癌 CNE － 2 细胞增殖，诱导其凋亡，具有潜在的抗鼻咽癌生物学活性。
关键词:鞣花酸; 鼻咽癌; 细胞增殖; 细胞凋亡
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 01． 033
中图分类号:Ｒ962 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2013) 01-0078-02
Effect of ellagic acid on the apoptosis and proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE
－2 cells
QIU Hua-feng1，LEI Xun1，2* ，FAN Cai-wen2，XIANG Qiu2
( 1． The Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin，Guangxi，541000，China; 2． Guilin Medical Col-
lege，Guilin，Guangxi，541000，China)
Abstract: Objective To investigate the biological effects of ellagic acid against nasopharyngeal carcinoma． Methods Nasopha-
ryngeal carcinoma cells CNE － 2 was cultured and divided into control group and observed groups，the control group was not inter-
vened，the observed groups were treated with ellagic acid of 2，4，6 mg /L respectively for 48 hours． The inhibition rate of cell prolif-
eration and apoptosis were detected by MTT experiment，Hoechst staining and flow cytometry; the changes of cell morphology were
observed with fluorescent staining and microscope． Ｒesults After the treatment for 48 hours，the living cells reduced，the float dead
cells increased，the cell proportion with nucleolus staining reduced，the phenomenon of karyopyknosis and karyorrhexis were oc-
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时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 1 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 1