全 文 ：第 5 期 卓 莉，等:新型交联羧甲基葡甘聚糖凝胶球对尿素的吸附性能
第 25 卷第 5 期
2013 年 5 月
化 学 研 究 与 应 用
Chemical Research and Application
Vol． 25，No． 5
May，2013
文章编号:1004-1656(2013)05-0713-05
牛大力总黄酮提取工艺及不同萃取物
的抗氧化活性研究
王呈文1，纪明慧1，舒火明1，2* ，黄大鹏1，高 倩1，凌昭星1，徐志江1，陈延召1
(1. 海南师范大学化学与化工学院，省部共建-热带药用植物化学教育部重点实验室，海南 海口 571158;
2. 海南经贸职业技术学院，海南 海口 571127)
摘要:为了考察牛大力乙醇提取物中总黄酮的含量及抗氧化活性。通过 L16(4
5)正交实验，超声波辅助提取牛
大力中总黄酮，得到最佳工艺，再测试乙醇提取物和四个萃取物对羟基自由基(·OH)和 DPPH 自由基(DP-
PH·)的清除效果。最佳工艺为:φ(EtOH)= 75%、m(牛大力，g)∶ V(EtOH，mL)= 1 ∶ 25、温度 60℃、时间
60min，该条件下，牛大力总黄酮得率可达 2. 14mg·g－1。其中，牛大力乙醇提取物中氯仿萃取物中黄酮含量最
高，为 5. 52mg·g－1;而且氯仿萃取物对 DPPH·的清除效果最好，其半数抑制浓度(IC50)为 40. 97μg·mL
－1;
乙酸乙酯萃取物对羟基自由基的清除效果最好，其 IC50 值为 90. 5μg·mL
－1。牛大力乙醇提取物中石油醚、氯
仿、乙酸乙酯萃取物都有很好的抗氧化活性，且稳定性、重复性好。
关键词:牛大力;总黄酮;抗氧化;超声波辅助提取
中图分类号:TS207. 3 文献标志码:A
Study on extraction process of total flavonoids and antioxidant
activities of extracts of Millettia speciosa roots
WANG Cheng-wen1，JI Ming-hui1* ，SHU Huo-ming1，2* ，
HUANG Da-peng1，GAO Qian1，LING Zhao-xing1，XU Zhi-jiang1，CHEN Yan-zhao1
(1. Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of the Ministry of Education，
Chemistry and Chemical Engineering，Hainan Normal University，Haikou 571158，China;
2. Hainan College of Economics and Business，Haikou 571127，China)
Abstract:To study content assay of flavonoids and the antioxidation activity of the ethanolic extracts from the roots of Millettia spe-
ciosa(ERMS) ，the orthogonal design methods L16(4
5)were applied for the optimal technological conditions with ultrasonic assisted
extraction. Content of flavonoids and antioxidant activity against hydroxyl radical and DPPH free radical were used to make a com-
parison between the five extracts． The optimal technological conditions were φ(EtOH)= 75%，m(EMS，g)∶V(EtOH，mL)= 1 ∶25，
60℃，60min. Under the optimized conditions，total flavonoids yield was up to 2. 14mg·g－1 ． The chloroform extract of ERMS showed
the highest content of flavonoids and the best scavenging effect against DPPH free radical among the five extracts，content reached
5. 52mg·g－1 and IC50 value was 40. 97μg·mL
－1 ． The ethyl acetate extraction of ERMS exhibited the good scavenging effect against
hydroxyl radical． The IC50 value was 90. 5μg·mL
－1 ． ERMS of petroleum ether，chloroform，ethyl acetate extracts had good antioxi-
dant activity，stability and reproducibility.
收稿日期:2012-09-18;修回日期:2013-03-07
基金项目:科技部 973 计划前期研究专项项目(2011Cb512010)资助;海南自然科学基金项目(213019)资助
联系人简介:舒火明(1961-) ，男，教授，主要从事天然产物化学研究。E-mail:shuhm2000@ sina. com
化 学 研 究 与 应 用 第 25 卷
Key words:Millettia speciosa;flavone;antioxidant;ultrasonic assisted extraction
牛大力(Millettia Speciosa Champ. )别名:金钟
根、倒吊金钟、山莲藕、猪脚笠、大力茨、大力牛、甜
牛力、甜牛大力等，为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆
藤的干燥根，性味甘、平，具有补虚润肺，强筋活络
的功效。牛大力用药历史悠久，早在《生草药性备
要》记载其:“壮筋活络，补虚润肺。治腰腿痛，风
湿痹痛，慢性肝炎，肺结核”。《陆川本草》也记载
其:“清肺止咳，清凉解毒。治咳血，痢疾，温病身
热口渴，头晕”。临床上己证明其对多种慢性疾病
有治疗作用，主要用来治腰痛、肾虚带下、风湿性
关节炎、腰肌劳损、慢性肝炎、病后体虚等［1，2］。
据文献报道，牛大力富含多糖、木脂素、挥发
油、三萜类等成分，具有明显的医疗保健作用和极
高的营养价值。在我国南部沿海地区，牛大力被
广泛用作煲汤原料、制作药膳、药酒等，补腰肾、强
筋骨功效显著。本文通过超声波法提取牛大力的
总黄酮并考察其抗氧化活性，为进一步开发利用
牛大力资源提供新的思路。
1 实验部分
1. 1 材料与仪器
牛大力采自海南省五指山市，经海南师范大
学生命科学院钟琼芯教授鉴定为豆科蝶形花亚科
崖豆藤属植物美丽崖豆藤(M. Speciosa)的干燥
根，样本保存在海南省热带药用植物化学重点实
验室。
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·) (分析
纯，美国 Sigma-Aldrich公司生产) ，无水乙醇、过氧
化氢、七水合硫酸亚铁、邻二氮菲、三羟甲基氨基
甲烷、盐酸、抗坏血酸、Al(NO3)3、NaNO2、氢氧化
钠等均为分析纯。
1. 2 超声波法提取牛大力总黄酮工艺研究
1. 2. 1 标准品溶液的配制 精密称取芦丁标准
品 10. 0mg，用 60%乙醇溶解并定容于 50mL 容量
瓶中，摇匀，即得浓度为 0. 2mg·mL－1的芦丁标准
液。
1. 2. 2 测定波长选择 精密量取 1. 0 mL 芦丁标
准液于 25mL 容量瓶中，分别加入 2. 0mL 30%乙
醇和 1. 0mL 5% NaNO2 溶液，摇匀，放置 6min，再
加入 10%Al(NO3)3 溶液 1. 0mL，摇匀，放置 6min，
然后再加 10. 0mL 4% NaOH 溶液，用 30%乙醇定
容至刻度，摇匀，静置 15min。在 300 ～ 600nm波长
处测定吸光度，确定最大吸收波长为 510nm。
1. 2. 3 标准曲线的绘制 分别精密量取芦丁标
准液 0. 0(空白样)、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、
7. 0、8. 0、9. 0、10. 0mL 置于 25mL 容量瓶中，其余
步骤如 1. 2. 2 节，以试剂空白为参比，在 510nm 处
测吸光度，测得结果作芦丁质量浓度-吸光度标准
曲线，得回归方程。
1. 2. 4 总黄酮的测定及提取率的计算 参照文
献［3-5］的方法，将各实验滤液用相应浓度的乙醇定
容至 10mL容量瓶中，从中移取 4. 0mL 提取液于
25mL容量瓶中，其余步骤如 1. 2. 2 节，以试剂空
白为参比，在 510nm 处测吸光度 A1;另取 4. 0mL
提取液于 25mL 容量瓶中，加 30% 乙醇至刻度。
在 510nm处测吸光度 A2。
吸光度值 A1 减去吸光度值 A2，即得总黄酮参
加一系列反应后溶液的吸光度值 A3，根据 A3 和芦
丁标准曲线可以计算出提取液中总黄酮质量浓
度。经过换算求出总黄酮的提取率(%) ，即:
R(%)= Y·n·V
1 000m
×100% (1)
R:总黄酮的提取率;Y(mg·mL－1) :提取液中
总黄酮的质量浓度;n:稀释的倍数，V(mL) :原提
取液的体积;m(mg) :牛大力的质量。
1. 2. 5 正交实验 通过预实验，认为采用超声波
法提取牛大力总黄酮，影响总黄酮收率的主要因
素是乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取温度
(C)、提取时间(D) ，故设计四因素四水平用正交
表 L16(4
5)进行正交实验，并以总黄酮收率作为考
察指标以筛选最佳工艺条件，因素水平表见表 1。
表 1 因素水平表
Table 1 Factor level table
因素水平 A/% B /(g:mL) C /℃ D/min
1
2
3
4
40
60
75
95
1 ∶10
1 ∶15
1 ∶20
1 ∶25
40
50
60
70
50
60
70
80
1. 3 牛大力乙醇提取物的抗氧化活性研究
1. 3. 1 牛大力乙醇提取物的制备 将牛大力自
然风干，粉碎称取质量 1kg，加 95%乙醇，用超声辅
417
第 5 期 王呈文，等:牛大力总黄酮提取工艺及不同萃取物的抗氧化活性研究
助加热回流提取 3 次，每次 2. 0h，合并提取液减压
浓缩得到乙醇浸膏;将浸膏溶解于适量蒸馏水中，
再依次用石油醚(60-90℃)、氯仿、乙酸乙酯萃取，
最后剩下的水溶液用 D-101 大孔树脂处理后为水
相;减压浓缩分别得到石油醚萃取物、氯仿萃取
物、乙酸乙酯萃取物以及水相，各浸膏真空冷冻干
燥至恒重，待用。
1. 3. 2 清除 DPPH·能力 参照文献［6-16］方法，
准确称取不同萃取物的样品 10mg，用无水乙醇溶
解，配成 10mL溶液待用。取不同体积样品溶液于
10mL棕色容量瓶中，加入 1mL DPPH·溶液，用无
水乙醇定容至 10mL，混合均匀，室温避光下反应
30min，以 VmL 样品和(10-V)mL 无水乙醇为参
比，在 518nm处测定其吸光值为 A2;1mL DPPH·
和 9mL无水乙醇，混合均匀，以无水乙醇溶液为参
比，在 518nm处测定其吸光值为 A1。按照(2)式
计算待测样品对 DPPH·的清除率:
K=(A1 －A2)/A1 ×100% (2)
1. 3. 3 清除羟基自由基(·OH)能力 参照文
献［6-15］方法，准确称取不同萃取物的样品溶液
10. 0mg，用无水乙醇溶解，配成 10mL 溶液，待用。
在 10mL棕色容量瓶中依次加入 0. 4mL 邻二氮菲
(5mmol·L－1)、2mL Tris-HCl缓冲溶液(50mmol·
L－1 pH6. 0)、0. 4mL FeSO4(7. 5mmol·L
－1)溶液、
0. 4mL H2O2(1%)和不同体积的样品溶液，用无水
乙醇定容至 10mL，然后于 37℃ 恒温水浴反应
60min，在 538nm 处测量吸光值 A2;不加双氧水而
加入样品时的吸光度为 A0;加入双氧水而不加入
样品时的吸光度为 A1。按照(3)式计算待测样品
对羟基自由基(·OH)的清除率:
K=(A2 －A1)/(A0 －A1)×100% (3)
2 结果与分析
2. 1 芦丁标准曲线
在 510nm波长处测定吸光度，以芦丁标准品
溶液浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，进行线
性回归，结果芦丁在 0. 00 ～ 0. 05mg·mL－1范围内线
性关系良好。回归方程为:Y =-0. 002 93 +11. 596
21X。相关系数为 0. 999 8。
2. 2 正交实验
正交实验结果见表 2。
表 2 正交实验结果
Table 2 Orthogonal experiment results
实验号 A/% B /(g:mL)C /℃ D/min 黄酮得率(%)
1 1 1 1 1 0. 548 94
2 1 2 2 2 1. 568 65
3 1 3 3 3 1. 668 71
4 1 4 4 4 1. 557 34
5 2 1 2 3 0. 961 20
6 2 2 1 4 1. 029 54
7 2 3 4 1 1. 541 86
8 2 4 3 2 2. 138 74
9 3 1 3 4 1. 415 75
10 3 2 4 3 1. 188 10
11 3 3 1 2 1. 541 86
12 3 4 2 1 1. 821 61
13 4 1 4 2 0. 834 35
14 4 2 3 1 1. 235 67
15 4 3 2 4 1. 034 46
16 4 4 1 3 1. 081 66
S1 0. 133 591 0. 094 006 0. 105 050 0. 128 70
S2 0. 141 784 0. 012 554 0. 134 648 0. 152 09
S3 0. 149 183 0. 014 467 0. 161 472 0. 122 492
S4 0. 104 654 0. 164 984 0. 128 041 0. 125 92
R 0. 178 119 0. 283 912 0. 225 687 0. 118 392
注:K为因素水平 A、B、C、D之和，S为 K的平均值，R为极差。
从表 2 中直观分析可以看出，料液比是影响
提取物清除 DPPH·活性的主要因素，因素影响的
次序为:B＞C＞A＞D，最佳工艺条件为:A3B4C3D2，
即 φ(EtOH)= 75%、m(牛大力，g)∶V(EtOH，mL)
= 1 ∶25、温度 60℃、时间 60min 时，总黄酮得率最
高，以此最佳提取工艺条件进行 3 次验证实验，测
得总黄酮平均得率可达 2. 14mg·g－1，实验重复性
良好。
2. 3 牛大力乙醇提取物不同萃取物的总黄酮含量
分别对牛大力乙醇提取物不同萃取物的总黄
酮进行测定，结果见表 3 所示。
表 3 黄酮含量
Table 3 The content of flavonoids
样品
石油醚
萃取物
氯仿
萃取物
乙酸乙酯
萃取物
水相
黄酮含量 /mg·g－1 3. 77 5. 52 3. 95 0. 45
2. 4 牛大力乙醇提取物的抗氧化活性测试结果
2. 4. 1 清除 DPPH·能力 由表 4 和图 1 可以看
517
化 学 研 究 与 应 用 第 25 卷
出，牛大力乙醇粗提取物、石油醚萃取物、氯仿萃
取物、乙酸乙酯萃取物和水相对 DPPH·均有很好
的清除能力，并且随着样品质量浓度增大，样品清
除 DPPH·的能力增强。从 IC50 值可以看出，氯仿
萃取物的清除能力最强，石油醚萃取物最弱，5 种
萃取物的清除能力均强于 Vc。
表 4 清除 DPPH·的 IC50 值
Table 4 IC50 values for scavenging DPPH free radical
样品
石油醚
萃取物
氯仿
萃取物
乙酸乙酯
萃取物
水相 粗提物 VC
IC50 /μg·mL
－1 283. 32 40. 97 77. 40 105. 29 100. 14 297. 1
图 1 清除 DPPH·的能力
Fig. 1 The activity of scavenging DPPH free radical
2. 4. 2 清除羟基自由基(·OH)能力 由图 2 和
表 5 可以看出，四个萃取物对羟基自由基都有一
定的清除能力，并且随着样品质量浓度增大，清除
羟基自由基能力增强。从 IC50 值可以看出，乙酸
乙酯萃取物的清除能力最强，水相最弱，其中乙酸
乙酯、氯仿和石油醚萃取物的清除能力均强于 Vc，
水相和总提物均较 Vc弱。
图 2 清除羟基自由基(·OH)的能力
Fig. 2 Hydroxyl radical scavenging activity
表 5 清除羟基自由基(·OH)的 IC50 值
Table 5 IC50 values for scavenging hydroxyl radical
样品
石油醚
萃取物
氯仿
萃取物
乙酸乙酯萃取物 水相 粗提物 VC
IC50 /μg·mL
－1 246. 2 148. 12 90. 5 657. 0 502. 1 254. 4
2. 5 重复性实验
取 5份试样，按最佳提取工艺进行提取。总黄酮
提取率分别为:2. 12、2. 15、2. 12、2. 17、2. 14mg·g－1。
2. 6 稳定性试验
精密吸取 10mL 配制的提取液 6 份，分别置于
10mL比色皿中，室温下放置，分别于 0、2、4、6、8、24h，
加入芦丁对照品 10mL，按方法 1. 2. 4 进行测定。结
果表明:总黄酮含量测定的 RSD为 0. 26%，符合总黄
酮测定要求，说明溶液在 24h 内测定，不影响测定结
果。
3 结论
本文采用超声波法辅助提取，通过正交实验
的方法筛选出了牛大力黄酮类化合物的最佳提取
条件，并研究了其提取物的抗氧化活性。最佳提
取工艺为:φ(EtOH)= 75%、m(牛大力，g)∶ V
(EtOH，mL)= 1 ∶25、温度 60℃、时间 60min，牛大力
总黄酮得率可达 2. 14mg·g－1。其中，牛大力乙醇提取
物中氯仿萃取物中黄酮含量最高，为 5. 52mg·g－1;而
且其对 DPPH·的清除效果最好，其 IC50 值为
40. 97μg·mL－1;乙酸乙酯萃取物对羟基自由基的清
除效果最好，其 IC50 值为 90. 5μg·mL
－1，清除效果均
617
第 5 期 王呈文，等:牛大力总黄酮提取工艺及不同萃取物的抗氧化活性研究
比 Vc强，。
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(责任编辑 罗 娟)
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