全 文 ：书胞或其它微生物颗粒逐个进行多参数的快速定量分析和分选的
技术。利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合
多色荧光染料，即可以把各种不同功能的淋巴细胞亚群区分开
来，得到各亚群的相对比例。
中医学认为本病主要是由情志内伤、饮食水土失宜引起，并
与素体禀赋密切相关。因妇女的经、孕、产、乳等生理特点与肝经
气血有密切关系。易引起气郁痰结，气滞血瘀等病理变化，故女
性易患此病。先天不足，忧思抑郁，肝失疏泄，气机不畅，脾失健
运，使得气滞痰结，壅结颈前。病久甚则损气伤阳，出现脾肾亏虚
之象。这与桥本策对本病 1619 例的统计，除甲状腺肿大之临床
病理表现外，全身乏力乃是其首要的主要症状相一致。
消瘿方是我院许芝银教授所创，由阳和汤化裁而成，取其温
阳散寒通滞之意，主要针对因寒凝、气滞、痰结于颈前所致脾肾阳
虚型瘿病而设。方中麻黄辛温宣散、开泄腠理为君药，附片散寒
止痛，肉桂温通经脉，二者相伍补火助阳，仙灵脾温补肾阳，共为
臣药，常用于脾肾阳虚证。川芎、桃仁活血祛瘀，防己祛湿消肿，
山慈菇散结消瘿，二者性又偏凉，可佐制方中热药，四者同为使
药，常用于痰瘀互结证。诸药合用，共奏温阳散寒，祛瘀化痰，通
滞消瘿之功效。
本实验结果显示，治疗组治疗前后比较，TGAb、TMAb均明显
降低(P ＜ 0． 05) ;与对照组相比较，治疗后 TGAb 明显降低(P ＜
0． 01) ，TMAb 明显降低(P ＜ 0． 05)。与对照组相比较治疗后
CD4 + / CD8 +有极显著性差异(P ＜ 0． 01) ，治疗组治疗前后相比
较，CD4 + / CD8 +有显著性差异(P ＜ 0． 05)。这一结果提示，消瘿
方能降低甲状腺自身抗体水平，调节 CD4 +、CD8 + 使 CD4 + /
CD8 +比值上升。其机理可能是通过降低甲状腺自身抗体水平，
调节 CD4 +、CD8 +尤其 CD4 + / CD8 +比值，改善免疫紊乱状况从
而发挥治疗作用。
参考文献:
［1］ Leslie J． Hashimoto ＇s thyroiditis:A disease of Autoimmunity． Thyroid
and its diseases 5 th edition，1984:497．
［2］ 张志远，郑武飞． Graves病和桥本氏甲状腺炎患者的 T淋巴细胞亚
群异常［J］．国外医学·内分泌学分册，1984，9(3) :134．
［3］ 张均田．现代药理实验方法，第 1 版［M］．北京:北京医科大学 中国
协和医科大学联合出版社，1999:680．
［4］ 毕爱华．医学免疫学，第 1 版［M］．北京:人民军医出版社，1997:7．
［5］ Li C K，Ko Ｒ C． Inflammatory response during the muscle phase of
Trichinella spiralis and T． pseudospiralis infections［J］． Parasitol Ｒes，
2001，87(9) :708．
收稿日期:2012-07-31; 修订日期:2012-12-18
基金项目:宁夏科技攻关项目( 宁科计字 2010168) ;
作者简介:毕江涛( 1964-) ，男( 汉族) ，宁夏中宁人，现任宁夏大学新技术
应用研究开发中心副研究员，博士学位，主要从事微生物生态与微生物资
源研究工作．
濒危药用植物南方山荷叶内生真菌分离
及其抑菌活性初步研究
毕江涛1，潘润霞2，王 静1，代金霞2，贺达汉3
(1．宁夏大学新技术应用研究开发中心，宁夏 银川 750002;
2 宁夏大学生命学院，宁夏 银川 750021; 3．宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021)
摘要:目的 探明濒危药用植物南方山荷叶内生真菌资源多样性及其抑菌活性特征。方法 通过组织块法对内生真菌进
行了分离，并选择 5 种植物病原真菌和 4 种细菌作为指示菌，采用对峙法和改进的菌块法测定抑菌活性。结果 从南方山
荷叶根、茎、叶中分离出 11 株内生真菌，茎部和叶部最多，其次为根部;经形态学分类鉴定归于 2 个目，2 个科，5 个属，束
丝菌属为优势菌属;在分离菌株中，有 5 株菌对 1 种或多种供试植物病原真菌有不同程度的抑制作用，占分离菌株数的
45． 5% ;有 2 株菌对 2 种供试植物病原真菌指示菌有明显的抑制作用，其占所分离菌株总数的 18． 2% ;有 1 株菌对 4 种供
试植物病原真菌指示菌有明显抑制作用;有 2 株内生真菌均对 1 种供试指示细菌具有明显的抑制作用。结论 南方山荷
叶内生真菌具有多样性和明显的抗真菌活性，抑菌活性菌株主要分布在束丝菌属、曲霉属和短链霉属。
关键词:药用植物; 南方山荷叶; 内生真菌; 分离; 抑菌活性
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 03． 044
中图分类号:Q939． 96 文献标识码:B 文章编号:1008-0805( 2013) 03-0618-03
内生真菌(endophytic fungi)是指那些在其生活史中的某段
时期生活在植物组织内，对植物组织没有明显引起病害症状的真
菌［1］。近年来，人们发现植物内生真菌具有重要的资源价值，能
产生对人类有益的生理活性物质，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗
氧化、抗虫、抗旱、固氮等特性［2 ～ 7］。目前，分离植物内生真菌及
其天然产物的研究正成为微生物学领域的一个热点［8，9］。
南方山荷叶(Diphylleia sinensis)为小蘖科(Berberidaceae)鬼
臼亚科(Podophylloideae)山荷叶属(Diphylleia)的一种具有根状
茎的多年生草本植物，也称窝儿七、山荷叶等，是一种传统的草
药，具有清热解毒、活血散瘀、消炎止痛等功效，其所含的鬼臼毒
素(Podophylltoxin)是治疗尖锐湿疣的良好药物，也是合成治疗癌
症药物的前体，具有重要的药用价值和经济价值［10，11］。该植物
在宁夏、甘肃、陕西、四川、云南有分布，但由于生长缓慢，对生境
要求苛刻，自然分布较少，其野生资源十分有限［12，13］。目前，对
于南方山荷叶内生真菌抑菌活性和活性物质已有相关研究报
道［14，15］。宁夏南方山荷叶野生资源破坏严重，为避免对有限的
鬼臼类植物资源的破坏，保护生物多样性，该试验对南方山荷叶
内生真菌进行分离，并对其抑菌活性进行初步研究，为进一步研
究其内生真菌资源，并利用微生物资源拓展其保护和利用途径提
供依据。
1 材料
1． 1 供试材料 南方山荷叶(Diphylleia sinensis)于 2011 年 8 月
初采自宁夏泾源，地理位置东经 106°1412． 7″，北纬 35°2933． 6″，
海拔高度 2231 m。采样时挑选无病害健康植株，取材部位为植
·816·
时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 3 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 3
书物根、茎、叶，采集后 24 h内进行表面消毒。
1． 2 培养基 营养琼脂(Nutrition agar，NA)、马铃薯葡萄糖培养
基(Potato dextrose agar，PDA)。
1． 3 供试指示菌 供试植物病原真菌为小麦全蚀病菌(Gaeu-
mannomyces graminis var． tritici)、枸杞黑果病菌(Colletotrichum
gloeosporioides penz)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、黄瓜枯萎病
菌(Fusarium oxysporium f． sp． cucumeris)、黄瓜立枯病菌(Ｒhizocto-
nia solani) ，由宁夏农科院植保所提供;供试指示细菌为枯草芽孢
杆菌(Bacillus subtilis) ，由西北农林科技大学无公害农药研究中
心提供;大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphyloc-
cus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonos aeuruginosa) ，由宁夏医
科大学附属医院检验科提供。
2 方法
2． 1 内生真菌的分离与纯化 内生真菌的分离采用组织块法，分
离材料用自来水冲洗，然后依次用 75%的酒精漂洗 1 min，0． 1%
的升汞漂洗 3 min，75%的酒精漂洗 30 s，无菌水漂洗 5 次进行表
面消毒。消毒后的材料用无菌手术剪剪成叶(2 ～ 5)mm ×(2 ～
5)mm，根和茎(5 ～ 10)mm的片段，置于 PDA平板上，用封口膜
将培养皿密封，28℃进行避光培养 3 ～ 5 d;同时，将表面消毒的植
物组织片段不经剪切直切在培养基表面轻抹，相同条件下培养作
为对照，培养 3 天后对照培养基中无真菌长出，证明表面消毒彻
底，分离到的真菌是植物内生真菌。每皿接 4 ～ 5 个样品，观察材
料切口处长出菌丝(菌落) ，取切口处菌丝，转接至新的 PDA培养
基上继续培养，采用尖端菌丝挑取法对所分离的内生真菌进行纯
化，纯化后转接到 PDA斜面上编号并保存［16 ～ 18］。
2． 2 内生真菌的形态观察与初步分类鉴定 以点植培养法进行
菌落观察和常规镜检，从纯化培养数日的菌落上挑取菌丝，连同
分生孢子用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色制成玻片，置于光学显微
镜下观察菌丝形态、孢子梗形态、孢子形态以及孢子与营养体着
生关系，对照有关资料初步确定真菌的分类学地位至属［19，20］。
2． 3 拮抗真菌的初步筛选 对供试植物病原真菌的拮抗作用初
筛采用对峙培养法［21 ～ 24］，将 5 种植物病原真菌分别接种于平板
中央，内生真菌接种于平板边缘，相距 25 mm，同时以只接病原真
菌的平板作对照，处理和对照均设 3 次重复，置于 28℃下恒温避
光培养 4d 后，观察病原真菌菌落周围的变化，测定拮抗带宽度，
以拮抗带宽度平均值作为抑菌活性强弱的指标，初步筛选出对病
原真菌生长具有抑制作用的内生真菌。对供试指示细菌的拮抗
作用初步筛选采用改进的菌块法［25，26］，取融化并保温在 45℃左
右的 NA培养基倒入 90 mm无菌培养皿中制成平板，按无菌操作
法分别接入 2 ～ 3 环供试指示细菌于培养皿中，轻轻以手搓法摇
动使其混匀，待培养基稍微凝固后迅速用灭菌接种环取内生真菌
菌块 3 ～ 4 块(直径约 5mm) ，分 3 ～ 4 点等距离均匀放置，距皿边
缘距离不得小于 10 mm，小心放入培养基中，使菌块带菌丝的一
面贴在培养基表面，用封口膜密封后将培养皿置低温 10℃以下
保持 12 ～ 14 h，使菌块中的抗菌素扩散，将皿置于 28℃下恒温培
养 3 ～ 5 d，观察内生真菌对指示细菌的拮抗作用，并测定抑菌圈
的直径。
3 结果
3． 1 内生真菌分离部位及菌株数量 从濒危药用植物南方山荷
叶中共分离到内生真菌 11 株，其中根部 3 株，占分离菌株数的
27． 2%，茎部 4 株，占分离菌株数的 36． 3%，叶部 4 株，占分离菌
株数的 36． 3%(见表 1) ，从分离部位可以看出，分离的菌株数量
茎部和叶部最多，其次为根部。
通过菌落和显微形态特征观察，初步鉴定为 2 个目，2 个科，
5 个属(见表 2) ，其中以无孢目为优势菌群，共有内生真菌 7 株，
占菌株总数的 63． 6%;其次为丝孢目，共有 4 株菌，占内生真菌
总数的 36． 4%。在无孢目中分离到的菌株共有 2 个属，其中束
丝菌属有 4 株，组丝核菌属 3 株，束丝菌属菌株占分离到的内生
真菌菌株总数的 36． 3%，为优势菌属。在丝孢目中分离到的菌
株共有 3 个属，其中曲霉属有 2 株，皮思霉属 1 株，短链孢霉属 1
株。南方山荷叶内生真菌在种类组成上具有多样性。
表 1 南方山荷叶内生真菌分离部位及其菌株
分离部位 菌株编号 分类 菌株数 占比例(%)
DSEFＲ001 皮思霉属
根 DSEFＲ002 组丝核菌属 3 27． 2
DSEFＲ003 曲霉属
DSEFS001 束丝菌属
茎 DSEFS002 曲霉属 4 36． 3
DSEFS003 组丝核菌属
DSEFS004 束丝菌属
DSEFL001 组丝核菌属
叶 DSEFL002 束丝菌属 4 36． 3
DSEFL003 束丝菌属
DSEFL004 短键孢菌属
*:“DS”南方山荷叶;“EF”内生真菌;“Ｒ”根;“S”茎;“L”叶
3． 2 内生真菌抑菌活性 通过对供试植物病原真菌和供试指示
细菌的抑菌试验，发现 5 株菌对 1 种或多种供试植物病原真菌有
不同程度的抑制作用，占分离菌株数的 45． 5%，2 株菌对 2 种供
试植物病原真菌有明显的抑制作用，占所分离菌株总数的 18．
2%，有 1 株菌对 4 种供试植物病原菌有明显的抑制作用，占分离
菌株数的 9． 1%(见表 3)。
表 2 南方山荷叶内生真菌种群组成
目 科 属 合计 /株
无孢目 无孢科 组丝核菌属(Phacodium sp．) 3
AgnomycetalesAgonomycetaceae 束丝菌属(Ozonium sp．) 4
丝孢目 丛梗孢科 曲霉属(Aspergillus sp．) 2
Hyphomycetales Moniliaceae 皮思霉属(Pithomyces sp．) 1
短链孢霉属(Selenotila sp．) 1
表 3 南方山荷叶内生真菌抑制植物病原真菌活性
菌株编号
番茄灰霉
病菌
黄瓜枯萎
病菌
枸杞黑果
病菌
黄瓜立枯
病菌
小麦全蚀
病菌
DSEFＲ001 － － － － －
DSEFＲ002 － － － － －
DSEFＲ003 － － － － －
DSEFS001 － + + + + + + + + +
DSEFS002 － － + + + + + + －
DSEFS003 － + + + + + + + +
DSEFS004 + + + + + + + + + + + + + +
DSEFL001 － － － － －
DSEFL002 － － + － －
DSEFL003 － － － － －
DSEFL004 － － + + + － －
* :拮抗带宽度大小为 3 次重复试验的平均值;“ +”拮抗带宽度小于 2 mm;
“ + +”拮抗带宽度介于 2 ～ 5 mm;“ + + +”拮抗带宽度大于 5 mm;“ －”无拮抗活
性
在分离的对供试植物病原真菌指示菌有明显抑制作用的 3
株菌中，菌株 DSEFS004 对黄瓜枯萎病菌、枸杞黑果病菌、黄瓜立
枯病菌、小麦全蚀病菌有明显的抑制作用;菌株 DSEFS001 对黄
瓜立枯病菌、小麦全蚀病菌有明显的抑制作用;菌株 DSEFS002
对枸杞黑果病菌、黄瓜立枯病菌具有明显的抑制作用;菌株 DSE-
FL004 对枸杞黑果病菌具有明显的抑制作用。菌株 DSEFS003 对
黄瓜枯萎病菌、枸杞黑果病菌、黄瓜立枯病菌、小麦全蚀病菌具有
一定的抑制作用。
从表 4 可以看出，有 2 株内生真菌 DSEFS001 和 DSEFL004
均对枯草芽孢杆菌具有明显的抑制作用，对大肠杆菌、金黄色葡
萄球菌、铜绿假单胞菌没有抑制作用。因此，总体上所分离的南
方山荷叶内生真菌菌株对细菌指示菌抑菌活性普遍较弱，且抑菌
范围较窄。
3． 3 活性菌株菌属分布 抑菌活性试验结果显示，内生真菌菌株
·916·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 3 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 3 期
书DSEFS004 对 4 种供试植物病原真菌具有明显抑菌活性，具有广
谱高活性特征，在目水平上分布于无孢目，在科水平上分布于无
孢科，在属水平上分布于束丝菌属 1 个属;菌株 DSEFS001 和
DSEFS002 分别对 2 种供试植物病原真菌指示菌有明显的抑菌活
性，菌株在目水平上 分布于无孢目和丝孢目，在科水平上分布于
无孢科和丛梗孢科，在属水平上分别归属于束丝菌属和曲霉属。
3 株活性菌株均来自茎部，占所分离内生真菌总数的 27． 3%。
表 4 南方山荷叶内生真菌拮抗病原细菌活性
菌株编号
枯草芽孢
杆菌
大肠
杆菌
金黄色葡萄
球菌
铜绿假单
胞菌
DSEFＲ001 － － － －
DSEFＲ002 － － － －
DSEFＲ003 － － － －
DSEFS001 + + + － － －
DSEFS002 － － － －
DSEFS003 － － － －
DSEFS004 － － －
DSEFL001 － － － －
DSEFL002 － － － －
DSEFL003 － － － －
DSEFL004 + + + － － －
* :抑菌圈直径大小为 3 次重复试验的平均值;“ +”抑菌圈直径小于
10 mm;“ + +”抑菌圈直径 10 ～ 15 mm;“ + + +”抑菌圈直径大于 15
mm;“ －”无拮抗作用
4 讨论
从分离出的内生真菌看，有些菌的分离频率高，为优势菌，而
有些菌则相反，为稀有种，这种特异性是植物的遗传、生理、代谢
产物与微生物的营养要求和生理代谢在长期演化过程中相互作
用、共同进化的结果。曾松荣等［27］从云南产山荷叶分离出的 25
株内生真菌中丝孢目丛梗孢科的青霉属为优势菌属，其次为无孢
菌群，并显示丰富的多样性。本项试验从宁夏产南方山荷叶分离
出的内生真菌中，无孢菌群中的束丝菌属为优势菌属，并显示出
较为丰富的多样性。
本项试验中活性菌株集中在束丝菌属、曲霉属、短链孢霉属，
其中束丝菌属、短链孢霉属是已报道过的产活性物质的内生真
菌，其抗肿瘤活性有相关的研究［28，29］，曲霉属内生真菌已报道过
具有一定的抗菌活性［30，31］。另外，在本项试验中分离的内生真
菌菌株对枯草芽孢杆菌具有明显的抑制作用与王晓鹏等［14］从南
方山荷叶分离出的 12 株内生真菌中，其发酵液抗菌试验显示菌
株对枯草芽孢杆菌具有明显的抑制作用结果相吻合。
目前对植物内生真菌的数量估计依赖于所采用的分离方法
和培养基，用哪种分离方法和哪些培养基才能反映这些真菌的种
群及数量，尚需探讨。
参考文献:
［1］ 郭良栋．内生真菌研究进展［J］．菌物系统，2001，20(1) :148．
［2］ Strobel G，Stierle A，Stierle D，et al． Taxomyces andreanae，a proposed
new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associatede with pacific yew
(Taxus brevifiloia) ［J］． Mycotaxon，1993，47:71．
［3］ 姚玉秀，魏希颖．药用植物内生真菌生物活性及其成分研究［J］．药
用生物技术，2011，18(2) :185．
［4］ Shan TJ，Sun WB，Lou JF，et al． Antibacterial activity of the endophytic
fungi from medicinal herb，Macleaya cordata［J］． African Journal of Bio-
technology，2012，11(19) :4354．
［5］ Aly AH，Debbab A，Kjer J，et al． Fungal endophytes from higher plants:
a prolific source of phytochemicals and other bioactive natural products
［J］． Fungal Diversity，2010，41(1) :1．
［6］ Hardoim PＲ，van Overbeek LS，van Elsas JD． Properties of bacterial en-
dophytes and their proposed role in plant growth［J］． Trends in Micro-
biology，16(10) :463 － 471．
［7］ Ｒodriguez ＲL，White Jr JF，Arnold AE，et al． Fungal endophytes:diver-
sity and functional roles［J］． New Phytologist，2009，182(2) :314．
［8］ 赫荣乔．植物内生菌成为我国当前微生物研究领域的热点［J］． 微
生物学通报，2009，36(1) :1．
［9］ 陈向东．植物内生菌是有待深入开发的资源宝库［J］． 微生物学通
报，2012，39(2) :282．
［10］ 杨显志，邵 华，张玲琪，等． 鬼臼毒素资源研究现状［J］． 中草药，
2002，32(11) :1042．
［11］ 陈毓亨．我国鬼臼类植物资源研究［J］．药学学报，1979，14:101．
［12］ 朱 强，王 俊，梁文裕． 宁夏珍惜濒危药用植物资源及其保护
［J］．中国野生植物资源，2009，28(1) :12．
［13］ 马绍宾，黄衡宇，赵念玺，等．南方山荷叶中甸居群繁殖生物学研究
［J］．西北植物学报，2000，20(4) :628．
［14］ 王晓鹏，钟 佳，王兴红，等．桃儿七和南方山荷叶内生真菌的生物
活性研究［J］．天然产物研究与开发，2006，18:15．
［15］ 曾松荣，邵 华，张玲琪．从南方山荷叶分离出一株产鬼臼毒素类
似物的内生真菌［J］．微生物学杂志，2004，24(4) :1．
［16］ 苏印泉，朱红薇，马希汉，等．杜仲内生真菌的抑菌活性筛选［J］．西
北植物学报，2005，25(6) :1153．
［17］ 陈 苹，戴好富，解修超，等．海南粗榧内生真菌的分离与初步鉴定
［J］．微生物学通报，2008，35(9) :1455．
［18］ 王家明，宋亚琼，刘宏亮，等．雷公藤内生真菌的分离鉴定及抗肿瘤
活性菌株筛选［J］．西北林学院学报，2011，26(5) :145．
［19］ 魏景超．真菌鉴定手册［M］． 上海:上海科学技术出版社，1982:
405．
［20］ 巴尼特 HL，亨特 BB(著)．沈崇尧(译)．半只菌属图解［M］．北京:
科学出版社，1977，64．
［21］ 袁保红，杜青平，邓祖军．小连翘内生真菌种群分布及其抗菌性研
究［J］．广东药学院学报，2007，23(3) :307．
［22］ 张苗苗，张蓉，王生荣．高寒草地植物内生真菌的分离及其抑菌活
性初探．安徽农业科学，2009，37(7) :3072．
［23］ 徐 磊，王艳红，郑友兰．温莪术内生真菌对植物病原真菌抑菌活
性的研究［J］．华西药学杂志，2009，24(6) :591．
［24］ 蔡永欣，花日茂，柏 钰，等．喜树内生真菌的分离及其对植物病原
菌的抑制作用测定［J］．安徽农业大学学报，2010，37(4) :748．
［25］ 程丽娟，薛泉宏． 微生物学实验技术［M］． 西安:世界图书出版公
司，2000，104．
［26］ 孙 奎，苏印泉．无花果内生真菌的抑菌活性研究［J］．安徽农业科
学，2010，38(23) :12455．
［27］ 曾松荣，柯 野，方白玉，等．南方山荷叶内生真菌与根防真菌的多
样性及相关性探讨［J］．株洲工学院学报，2005，19(1) :25．
［28］ Wei YM，Zhou XW，Liu L，et al． An efficient transformation system of
taxol － producing endophytic fungus EFY － 21(Ozonium sp．) ［J］． Af-
rican Journal of Biotechnology，2010，9(12) :1726．
［29］ 胡 凯，谈 锋，唐克轩，等．南方红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分
离和筛选［J］． 西南师范大学学报(自然科学版) ，2006，31(1) :
134．
［30］ Shan TJ，Sun WB，Lou JF，et al． Antibacterial activity of the endophytic
fungi from medicinal herb，Macleaya cordata［J］． African Journal of Bio-
technology，2012，11(19) :4354．
［31］ 涂 璇，张亚雄，韩青梅，等．筒鞘蛇菰内生真菌的分离及拮抗菌筛
选［J］．中国农学通报，2011，27(01) :309．
·026·
时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 3 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 3