全 文 ：【基础与预防医学】
牛大力多糖对小鼠 T淋巴细胞增殖的双向调节作用
郑元升 ,蒲含林 ,麻建军 (暨南大学 生物工程研究所 ,广东 广州 510632)
摘要:目的 从牛大力(MiletiaSpeciosaChamp.)提取纯化多糖 ,流式细胞术检测多糖对刀豆蛋白 A(ConA)刺激引起的小鼠 T
淋巴细胞增殖的影响 ,探讨牛大力多糖对免疫系统的调节作用机制 , 为临床用牛大力治疗多种慢性疾病提供理论和实验依
据。方法 提取 、纯化牛大力多糖 ,利用 CFDA-SE染色 , 流式细胞术检测多糖对 ConA刺激引起的小鼠 T淋巴细胞增殖的影
响。结果 终浓度为 160 μg/mL、 800 μg/mL、4 mg/mL、20 mg/mL的多糖对小鼠 T淋巴细胞增殖呈剂量依赖性抑制 , 而终浓度
为 5、25、50、125 μg/mL的多糖对小鼠 T淋巴细胞增殖起促进作用 ,剂量依赖关系不明显。结论 牛大力多糖对小鼠 T淋巴细
胞的增殖呈双向调节作用。
关键词:牛大力;多糖;T淋巴细胞;CFDA-SE
中图分类号:R285.5　文献标识码:A　文章编号:1006-8783(2008)01-0058-04
Two-wayeffectsofpolysaccharideofMiletiaSpeciosaChamponTlymphocyteproliferationinmouse
lymphnode
ZHENGYuan-sheng, PUHan-lin, MAJian-jun(Bio-engineeringInstitute, JinanUniversity, Guangzhou, Guangdong510632 , China)
Abstract:ObjectiveThepolysaccharidewasextractedandpurifiedfromMiletiaSpeciosaChamp.Flowcytometrywasusedto
investigatedtheeffectsofpolysaccharideonmouselymphocyteproliferationstimulatedbyConA, themechanismoftheefectsof
polysaccharideontheimmunesystemwasexploredandtheoreticalandexperimentalevidencefortheclinicalapplicationofMilletia
SpeciosaChampintreatingchronicdiseasesweredrawn.MethodsThepolysaccharidewasextractedandpurifiedfromMilettiaSpeciosa
Champ, CFDA-SEstainingandflowcytometrywereusedtodetecttheeffectsofpolysaccharideonmouselymphocyteproliferation
stimulatedbyConA.ResultsThepolysaccharidehasthefunctiontoinhibittheproliferationoflymphocyteofmousedependingonits
concentrationwith160 μg/mL, 800 μg/mL, 4 mg/mL, 20 mg/mLinsubstrate, butpromotestheproliferationofTlymphocytesofmice
lymphnodeattheconcentrationsof5, 25 , 50, and125 μg/mL, , butthedose-dependenteffectisnotsignificant.ConclusionThe
polysaccharideextractedfromMiletiaSpeciosaChamphasthetwo-wayefectsonTlymphocyteproliferationinmicelymphnode
stimulatedbyConA.
Keywords:MiletiaSpeciosaChamp.;polysaccharide;Tlymphocyte;CFDA-SE
作者简介:郑元升(1984 -), 男 , 在读硕士 , 研究方向为中药
活性成分研究;通讯作者:蒲含林(1964-), 男 , 副
研究员 , E-mail:tphl@jnu.edu.cn。
　　牛大力(MiletiaSpeciosaChamp.)又叫山莲藕 、
大力薯 , 豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤 (Miletia
speciosaChamp.)的干燥根 [ 1] ,主产于广东东部 。牛
大力用药始载于 《生草药性备要 》[ 2] ,历史悠久 ,性
味甘 、平 ,具有补虚润肺 、强筋活络的功用 ,临床主要
用来治疗肺热咳嗽 、风湿性关节炎 、腰肌劳损 、胃溃
疡 、慢性肝炎 、肺结核等疾病[ 1] 。早在 20世纪 70年
代 ,牛大力作为壮腰健肾丸 、强力健身胶囊的原料已
用于中成药的生产 [ 3] 。目前 ,对牛大力免疫活性的
研究有过报道 [ 4] ,但对其多糖药理活性尚未见报
道 。本文提取 、分离 、纯化牛大力多糖 ,鉴定多糖主
要的理化性质 ,并利用 CFDA-SE染色 、流式细胞术
研究多糖对刀豆蛋白 A(ConA)引起的 T淋巴细胞
增殖的影响 ,为阐明其对免疫系统的影响及临床治
疗多种疾病提供理论和实验依据 ,为牛大力的进一
步开发利用提供科学依据。
1　材 料
1.1　动物 　雄性 SPF级 Balb/c小鼠 , 4 ～ 5周龄 ,
体质量(12±2)g,由中山大学动物所提供(合格证
号 00A005)。
1.2　试药与仪器　牛大力购自广州天河石牌东百
康源大药房 ,经鉴定为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆
藤 (MiletiaSpeciosaChamp.)的 根;Vy-brantTM
CFDA-SE Cel TracerKit(c-1288)购 自 美 国
MolecularProbes公司;ConA、RPMI-1640、胎牛血
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第 24卷第 1期 广　东　药　学　院　学　报 Vol.24 No.1
2008年 2月 JOURNALOFGUANGDONGCOLLEGEOFPHARMACY Feb.2008
清 、L-谷氨酰胺 、β-二巯基乙醇均购自美国 Sigma公
司;FAC-SCalibur流 式细 胞仪 , 为 美国 Becton
Dickinson公司产品;旋转蒸发仪购自上海亚荣生化
仪器厂 。
2　方法与结果
2.1　牛大力多糖的理化性质测定
2.1.1　牛大力多糖的提取和纯化　称取新鲜干燥
的牛大力切片 800 g,粉碎 ,用 6倍量的水 ,加热到
90 ℃煮 1h,过滤 ,再加 5倍量的水 ,煮 1 h后过滤 ,
再重复 1次 ,合并 3次的滤液 ,旋转蒸发浓缩 ,向浓
缩液中加入无水乙醇使溶液中乙醇浓度达到 80%,
析出大量白色絮状沉淀 , 4 ～ 8 ℃放置过夜后抽滤 。
再用适量的水溶解 ,加入总体积 25%的 Sevage试剂
(三氯甲烷∶戊醇 =5∶1),振摇后形成胶状物 ,离心
除去析出物和乳化层的蛋白 ,重复 2次操作除尽蛋
白 。浓缩上清液 ,装入分子量范围为 8 000 ～ 10 000
的透析袋中于流动的蒸馏水中透析过夜 ,将透析袋
中溶液取出 ,浓缩后再加入无水乙醇至乙醇的浓度
达到 80%, 4 ～ 8 ℃放置过夜后抽滤。将沉淀依次用
丙酮 、甲醇洗涤脱色 , 50 ℃烘干即得到牛大力多
糖 [ 5] 。
2.1.2　多糖的含量测定　参照文献[ 6, 7] ,采用蒽酮
-硫酸法检测粗品中糖含量 ,与标准曲线对比 ,得到
线性回归方程 y=0.0047x-0.0003,计算得到牛大
力多糖的糖含量为 96.3%。如图 1所示 。
图 1　蒽酮硫酸法测定牛大力多糖的糖含量
Fig.1　 ContentofpolysaccharideinMilettiaSpeciosa
Champ.measuredbysulfuricacid-anthrone
2.2　牛大力多糖对 ConA刺激引起的小鼠 T淋巴
细胞增殖的影响
2.2.1　淋巴细胞悬液的制备　将 Balb/c小鼠断
髓处死 ,无菌取小鼠颈部 、腋下 、腹股沟以及肠系膜
的淋巴结 ,去掉被膜 , 200目筛网研磨过滤 ,收集细
胞 ,用 PBS离心(180 ×g, 10 min)洗涤细胞 2次 ,
PBS重悬。
2.2.2　淋巴细胞 CFDA-SE染色 　CFDA-SE用
DMSO溶解成 10mmol/L的储存液 , -20℃保存 ,临
用前 ,取适量用 PBS稀释成 1 mmol/L的工作液 ,平
衡至室温备用 。调整淋巴细胞悬液的密度为
10
7cels/mL,细胞悬液按 10 000∶1(体积比)加入
CFDA-SE工作液后 ,在室温条件下避光充分混匀 10
min,然后用 RPMI-1640完全培养液 (含体积分数
10%FBS)离心(180×g, 10 min)洗涤细胞 2次 ,并
调整细胞浓度为 2×106cels/mL。
2.2.3　多糖对小鼠 T淋巴细胞增殖的影响　将上
述经 CFDA-SE标记的淋巴细胞接种于 96孔细胞培
养板 ,分别设置空白对照组 , ConA组 , ConA+多糖
溶液实验组。实验组中多糖终浓度分别 5、25、50、
125、160、800 μg/mL, 4、20 mg/mL,定容至 200 μL/
孔 ,上述各实验组 ConA的浓度均为 5 μg/mL。在
37 ℃, 5% CO2温箱培养 48 h后对 CFSE荧光强度
(FL1)进行检测 。
2.2.4　流式细胞仪检测 、分析及数据统计　羧基荧
光素乙酰乙酸 (CFDA-SE)是一种染色细胞结构蛋
白的荧光染料。本文采用的 CFDA-SE标记技术就
是利用 CFDA-SE随细胞每增殖一代 ,荧光强度的系
列减半特征 ,结合流式细胞术 ,动态追踪分析细胞增
殖的技术 ,计算出增殖指数(proliferationindex, PI),
即增殖后的细胞总数与增殖前的细胞总数的比
值),研究 T细胞的增殖[ 8, 9] 。
从 FAC-SCalibur流式细胞仪和 CELLQuest软件
获取数据 。在前散射(FSC)和对侧散射(SSC)二维散
点图中划出淋巴细胞区 R,分别对每个组别的这群细
胞的 FL1强度进行检测。每管样品检测 10 000个细
胞 ,获得的数据用 CELLQuest软件分析。统计方法用
t检验 ,数据以均值 ±标准差( x±s)表示。
培养 48 h后 ,空白对照组经流式细胞仪检测 ,
结果显示细胞绝大部分处于亲代峰 , PI分别为
1.01, 1.00,表明 T淋巴细胞没有增殖 (见图 2A、
3A)。而 ConA组 , T淋巴细胞除了亲代峰 ,还出现
了子代峰 (见图 2B、3B),表明 ConA刺激 48h后 ,
T淋巴细胞增殖显著 。与对照组相比 ,子代细胞荧
光强度减半。
加入牛大力多糖作用 48h后 ,浓度为 5、25、50、125
μg/mL的多糖均对 ConA刺激引起的小鼠 T淋巴细胞
增殖起促进作用 ,这些实验组的 PI值均高于对应的
ConA刺激组 ,但不呈剂量依赖关系 (见图 2C～ 2F)。
而浓度为 160μg/mL、800 μg/mL、4 mg/mL、20mg/
mL的多糖实验组均对 ConA刺激引起的小鼠 T淋巴
细胞增殖起抑制作用 , PI值均明显低于 ConA刺激组 ,
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第 1期　郑元升 ,牛大力多糖对小鼠 T淋巴细胞增殖的双向调节作用
并且呈剂量依赖性抑制 (见图 3C ～ 3F)。其中终浓
度为 160μg/mL、800μg/mL、4mg/mL多糖实验组显
示亲代峰和子一代 、子二代峰(见图 3C～ 3E)。而终浓
度为 20mg/mL,只显示一个亲代峰和一个微弱的子一
代峰 , PI值为 1.03,接近完全抑制了 ConA刺激引起的
小鼠 T淋巴细胞增殖作用(见图 3F)。
图 2　低浓度牛大力多糖对 ConA刺激引起的小鼠 T
淋巴细胞增殖影响的动力学模型
Fig.2　Theeffectsofpolysaccharideextractedfromfrom
MilettiaSpeciosaChamp.atlowdoseonmouse
lymphocyteproliferationstimulatedbyConA
　　综上所述 ,牛大力多糖在终浓度为 5、25、50、
125 μg/mL剂量时 ,对小鼠 T淋巴细胞增殖起促进
作用 ,但剂量依赖关系不明显 ,在终浓度为 160μg/
mL、800μg/mL、4 mg/mL、20 mg/mL剂量时 , 对小
鼠 T淋巴细胞增殖呈剂量依赖性抑制。
图 3　高浓度牛大力多糖对 ConA刺激引起的小鼠 T淋巴
细胞增殖影响的动力学模型
Fig.3　Theefectsofpolysaccharideextractedfrom from
MilletiaSpeciosaChamp.athighdoseonmouse
lymphocyteproliferationstimulatedbyConA
表 1　低浓度牛大力多糖对 ConA刺激引起的小鼠 T淋巴细胞增殖的影响
Tab.1　Theeffectsofpolysaccharideextractedfrom from MiletiaSpeciosaChamp.atlowdoseonmouselymphocyte
proliferationstimulatedbyConA
组别 各代相应增殖比例 /%亲代(G1) 子一代(G2) 子二代(G3) 子三代(G4) 增殖指数
空白对照组 98.18±0.56 1.81±0.17 0 0 1.01
ConA 19.68±0.35 43.99±1.02 32.08±0.84 4.25±0.11 1.99
ConA+多糖(5μg/mL) 18.96±0.31 42.92±1.24 35.34±1.14 2.78±0.08 2.02
ConA+多糖(25 μg/mL) 17.96±0.41 43.45±1.52 35.16±1.20 3.42±0.05 2.04
ConA+多糖(50 μg/mL) 18.77±0.53 42.77±0.89 36.46±0.93 2.00±0.15 2.02
ConA+多糖(125 μg/mL) 20.36±0.21 38.54±0.18 37.48±0.68 3.62±0.05 2.02
3　讨论
本实验采用 ConA刺激 T细胞增殖以及牛大力
多糖对 ConA刺激引起 T细胞增殖抑制或促进作
用 ,均能以 CFSE荧光强度的改变表现出来 。通过
CELLQuest软件拟合 ,得到增殖指数 ,实现牛大力多
60
广东药学院学报 , 2008, 24(1)
糖对 T细胞增殖影响的可视化及数量化 、定量化 ,与
传统检测细胞增殖的方法相比 ,该方法具有操作简
单 、使用方便 、安全无辐射 、观察期长等诸多优点 ,具
有卓越的优越性 。
表 2　高浓度牛大力多糖对 ConA刺激引起的小鼠 T淋巴细胞增殖的影响
Tab.2　Theeffectsofpolysaccharideextractedfrom from MilletiaSpeciosaChamp.athighdoseonmouselymphocyte
proliferationstimulatedbyConA
组别 各代相应增殖比例 /%亲代(G1) 子一代(G2) 子二代(G3) 子三代(G4) 增殖指数
空白对照组 99.91±0.09 0.09±0.01 0 0 1.00
ConA 53.10±1.21 36.28±0.67 10.61±0.21 0 1.35
ConA+多糖(160 μg/mL) 54.86±1.52 36.62±0.95 8.52±0.25 0 1.33
ConA+多糖(800 μg/mL) 55.80±1.26 36.18±0.69 8.02±0.03 0 1.32
ConA+多糖(4 mg/mL) 68.34±0.75 30.03±0.68 1.63±0.21 0 1.19
ConA+多糖(20mg/mL) 93.56±0.80 6.44±0.29 0 0 1.03
　　本研究发现牛大力多糖是牛大力调节免疫功能
的主要活性成分之一。牛大力多糖对小鼠 T淋巴
细胞增殖具有双向调节作用。 T细胞是整个免疫应
答反应的关键细胞之一 ,干预 T淋巴细胞的行为能
有效地调控机体的免疫应答反应。这为探讨牛大力
具有抗炎和免疫增强等临床效应提供了线索。研究
认为肝炎等炎症都直接或间接地与淋巴细胞活化与
增殖相关。慢性肝炎的发病机制与辅助性 T细胞
(Th)等细胞免疫功能密切相关[ 10] 。由于高浓度的
牛大力多糖能抑制 T淋巴细胞的增殖 ,且具有明显
的剂量依赖性效应。牛大力可能通过多糖来抑制 T
淋巴细胞的增殖 ,从而抑制 Th细胞的功能来调节细
胞免疫 。这或许是牛大力有效治疗这些疾病的原因
之一。报道的牛大力治疗慢性肝炎的中医药方里 ,
牛大力用量达到最多 [ 1] 。高剂量的牛大力药方可
能是为了形成一个较高浓度的多糖溶液 。另外 ,牛
大力具有补虚润肺 、强筋活络 、壮身健体的功用 ,能
增强机体的免疫力与抗病能力[ 8] ,而低浓度的牛大
力多糖能促进 T淋巴细胞的增殖 。因此推测 ,牛大
力可能通过多糖来促进 T淋巴细胞的增殖 ,从而增
强机体的免疫力 。但本实验发现低浓度牛大力多糖
对 T细胞的促进效应不具有明显的剂量依赖关系。
本研究为牛大力对免疫应答的调节作用 、对炎症的
抑制作用及免疫增强等药理活性提供一定的实验依
据 ,也为临床上使用牛大力治疗肝炎等多种疾病提
供了科学依据 ,加深了对牛大力多糖药理作用的认
识 ,有利于合理 、科学 、有效地使用牛大力治疗疾病 。
目前 ,以植物药为主的传统中药在调节机体免疫方
面有着特殊的优势 ,且副作用相对较小 。因此 , 牛
大力用来治疗慢性肝炎等疾病具有广阔的前景 。
牛大力多糖的具体免疫调控机制还有待于进一步
的研究 。
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(收稿日期:2007-12-06;修回日期:2008-01-17)
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第 1期　郑元升 ,牛大力多糖对小鼠 T淋巴细胞增殖的双向调节作用