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第 1 8 卷 第 1 期
2016 年 1 月
辽 宁 中 医 药 大 学 学 报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 18 No. 1
Jan .，2016
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UFLC-DAD 法同时测定三叶青中原花青素 B1 和儿茶素含量
于虹敏 1，贺文达 1，2，刘巧 1，2，杨盼 1，2，吴婷婷 1，2，吴水生 1，黄泽豪 1，徐惠龙 1
（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州 350122）
摘 要：目的：建立超快速液相色谱-光电二极管阵列检测器法（UFLC-DAD）同时测定三叶青药材中原花青
素B1和儿茶素的含量。方法：采用菲罗门Kinetex C18 色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.6 μm），流动相为乙腈（B）-0.1%
甲酸（A）梯度洗脱，流速0.4 mL·min-1，二极管阵列检测器的检测波长为278 nm，柱温30 ℃。结果：原花青素B1
和儿茶素的线性范围分别为1.25~12.35 μg·mL-1（r=0.9992）、1.85~18.28 μg·mL-1（r=0.9990），平均加样回收率
分别为97.71%（RSD=2.80%）、99.64%（RSD=2.90%）。结论：建立的UFLC-DAD定量分析方法简便、快捷、准确，
可用于三叶青药材的质量评价，为三叶青的质量提供实验依据。
关键词：三叶青；原花青素B1；儿茶素；超快速液相；质量控制
中图分类号：R284 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2016) 01- 0071- 03
收稿日期：2015-07-13
基金项目：福建省教育厅资助课题（JA13154）；福建中医药校管课题（X2013017）；福建中医药学科 - 校管课题（X2014124- 学科）；中药学
重点学科 - 校管课题（X2014135- 学科）
作者简介：于虹敏（1984-），女，吉林辽源人，助理实验师，硕士，研究方向：中药药效物质基础研究。
通讯作者：吴水生（1965-），男，福建南平人，教授，博士研究生导师，研究方向：中药新药药效物质基础研究。
UFLC-DAD Simultaneous Determination of Procyanidins B1
and Catechin in Tetrastigma Hemsleyanum
YU Hongmin1，HE Wenda1，2，LIU Qiao1，2，YANG Pan1，2，WU Tingting1，2，
WU Shuisheng1，HUANG Zehao1，XU Huilong1
（1.School of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou
350122，Fujian，China；2 Centre of Biomedical Research & Development，Fujian
University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，Fujian，China）
Abstract：Objective：An analytical method was developed for simultaneously determining
procyanidins B1 and catechin in the radix of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg. Methods：The assay
was performed on a Phenomenex Kinetex C18 column（4.6 mm×100 mm，2.6 μm）with the mobile
结果表明：A、B、C 三种因素对滴丸成型性影响
为：A>C>B，即药物与基质配比 > 冷却剂温度 > 滴制
温度，最佳工艺为 A2B3C2，即药物与基质配比 1∶2，
滴制温度 80 ℃，冷却剂温度 10 ℃。
2.2.7 验证试验
用最佳工艺重复制备 3 批滴丸，对 3 批滴丸外
观质量、溶散时限、丸重差异进行评价。结果见表 7。
表 7 验证试验结果
试验次数 外观质量 溶散时限（min） 丸重差异（%）
1 17 10.36 2.9
2 19 10.45 3.8
3 19 10.83 3.2
结果表明：经 3 批试验验证，3 批滴丸外观质量
良好，重量差异和溶散时间均符合规定，无明显差
异，说明优化工艺条件稳定可靠。
3 小结
综上所述，优选最佳工艺为：取聚乙二醇 4000
约 20 g，80 ℃加热使熔融，加入稠膏与干膏粉混
匀，调整重量至 30 g，80 ℃恒温充分搅拌混匀，滴
入 10 ℃ 二 甲 硅 油 350 中，洗 丸，干 燥，选 丸，制 成
1000 丸，即得。如此制得的滴丸质量稳定，易于重
现。
本制剂将中药传统复方与现代新剂型相结合，
符合支气管哮喘的病理特点，既保持了原处方汤剂
的疗效，又减小了服用剂量。本制剂的研究，充分发
挥了中医药的特色和优势，不仅对支气管哮喘的治
疗有非常重要的现实意义，而且对推动现代化中药
发展具有重要意义。◆
参考文献
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DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2016.01.024
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三叶青为葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤
（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg），其块根名为
蛇附子，异名有石猴子、石抱子、拦山虎、雷胆子、破
石珠、阴灵子、三叶扁藤、金丝吊葫芦，是福建、浙江
地区的常用传统青草药，习称为“一粒珠”。具有清
热解毒、祛风化痰、活血止痛的功能，现代药理研究
表明三叶青具有抗炎、镇痛及解热、抗肿瘤、抗病毒、
调节免疫等作用 [1]。三叶青中的化学成分主要为黄
酮类、三萜甾醇类、有机酸类、多糖等成分 [2-4]。然
而，对于三叶青块根药材质量控制的研究报道较少，
如浦锦宝等采用盐酸法水解三叶青黄酮类成分，测
定黄酮苷元槲皮素和山奈酚的含量测定 [5] 及总黄酮
的 UV-Vis 法含量测定 [6-7]，并没有针对三叶青黄酮
成分的质量控制，课题组前期经过化学成分分离及
LC-MS 分析，从三叶青中分离鉴定多种化学成分，
其中原花青素 B1 和儿茶素是其主要成分之一。因
此本文建立一种同时测定三叶青中原花青素 B1 和
儿茶素的 UFLC-DAD 方法，并用于福建、浙江不同
产地三叶青块根的质量评价。
1 仪器与试药
Shimadzu UFLC 超 快 速 液 相 色 谱 仪（日 本
Shimadzu 公司）；CPA225D 型十万分之一分析天平
（德国 Sartorius 公司）；KQ-500E 台式超声波清洗器
（昆山市超声仪器有限公司）；FY135 型中草药粉碎
机（天津市泰斯特仪器有限公司）；乙腈为色谱纯（德
国 MERCK 公司），Milli-Q 超纯水仪（美国 Millipore
公司），其余试剂均为分析纯。
对照品原花青素 B1 和儿茶素均由本实验室从
三叶青中分离制备，纯度经 HPLC-DAD（面积归一
法）检测含量均大于 99.0％。
三 叶 青 干 燥 块 根 20 批 样 品 于 2012 年 11 月 —
2013 年 12 月，分别采自或者购自福建、浙江不同产
地。20 批次三叶青样品经福建中医药大学药用植
物实验室范世明高级实验师及生药教研室黄泽豪
副教授鉴定，均为葡萄科植物三叶青（Tetrastigma
hemsleyanum Diels et Gilg）的干燥块根，样本存放于
福建中医药大学药学院药用植物标本室。
2 方法与结果
2.1  色谱条件
采用菲罗门Kinetex C18 色谱柱（4.6 mm×100 mm，
2.6 μm）色谱柱；流动相为乙腈（B）-0.1% 甲酸
水（A）梯度洗脱，0~1 min，B 10%~10%，1~10 min，
B 10%~15%。流速 0.4 mL·min-1，DAD 检测波长为
278 nm，柱温 30 ℃，进样量：2 μL。在上述色谱条
件下 10 min 内原花青素 B1、儿茶素与其他共存峰得
到很好的分离，分离度均大于 1.5，见图 1。
注：1. 原花青素 B1；2. 儿茶素。
图 1 对照品（A）与三叶青样品（B）UFLC 图
2.2  对照品溶液制备
取 原 花 青 素 B1 和 儿 茶 素 对 照 品 适 量，精
密称定，加入甲醇分别制备含 1.260 mg·mL-1、
1.865 mg·mL-1 的单一对照品储备液。其他不同质
量浓度的对照品溶液由乙腈稀释储备液得到。
2.3  供试品溶液制备
取三叶青药材粉碎，过 60 目筛得三叶青药材粉
末。取三叶青 0.5 g，精密称定，置 25 mL 容量瓶中，
精密加入 80% 甲醇 20 mL，密塞，超声处理 30 min（功
率 250 W，频率 50 kHz），放至室温，再用 80% 甲醇定
容，摇匀，0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.4  线性和范围考察
取“2.2”项下方法制备的各对照品储备液，
用 50% 甲 醇 稀 释，配 成 原 花 青 素 B1 质 量 浓 度 分
别 为 1.25、2.51、5.00、7.47、9.92、12.35 μg·mL-1，
儿 茶 素 质 量 浓 度 分 别 为：1.86、3.72、7.40、11.06、
14.69、18.28 μg ·mL-1 的 7 种 系 列 对 照 品 混 合
溶 液。 精 密 吸 取 2 μL，依 次 注 入 液 相 色 谱 仪，
按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，对于以峰面
积（Y）对分析物浓度（X）作线性回归，绘制标准
曲 线，得 到 原 花 青 素 B1 回 归 方 程 和 相 关 系 数 为
Y=1328.1X-474.18，r=0.9992，儿茶素回归方程和相
关系数为 Y=1110.6X+219.31，r=0.9990。原花青素
B1 和儿茶素线性范围分别为 1.25~12.35 μg.mL-1、
1.85~18.28 μg.mL-1。
2.5  精密度试验
精 密 吸 取 同 一 份 对 照 品 混 合 溶 液 5 μL，在
“2.1”项色谱条件下连续进样 6 次，记录原花青素 B1
和儿茶素的峰面积，其峰面积的 RSD 分别为 1.32%、
1.27%，结果表明精密度良好。
2.6  稳定性试验
按“2.3”项下制备一份供试品，取该供试品溶
phase consisting of acetonitrile（B）and water containing 0.1% Formic acid（A）in gradient mode at a
flow rate of 0.4 mL·min-1. The column temperature was at 30 ℃ and the optimum detection wavelength
of DAD was set at 278 nm. Results：The good separation of procyanidins B1 and catechin was achieved
within 10 min. The linear range of procyanidins B1 and catechin were 1.25~12.35 μg·mL-1（r=0.9992）
and 1.85~18.28 μg·mL-1（r=0.9990），respeltively. The average recoveries（n=6）were 97.71%
（RSD=2.80%）and 99.64%（RSD=2.90%）respectively. Conclusion：The UFLC-DAD method was
simple，rapid，and could be used for quantitative analysis of procyanidins B1 and catechin of Tetrastigma
hemsleyanum which provided a novel approach for evaluation of the quality of Tetrastigma hemsleyanum
comprehensively.
Keywords：Tetrastigma hemsleyanum；procyanidins B1；catechin；UFLC；quality control
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液分别于 0、2、6、10、12 和 24 h 进样 2 μL，记录原花
青素 B1 和儿茶素的峰面积，其峰面积的 RSD 分别为
3.39%、2.25%。结果表明供试液在 24 h 内稳定。
2.7  重复性试验
精密称取同一批次三叶青样品 6 份，按“2.3”
项下方法制备供试品溶液，依法测定峰面积，计
算 原 花 青 素 B1 和 儿 茶 素 的 含 量 均 值 为 139.93、
405.16 μg/g，其含量的 RSD 分别为 2.88%、2.54%。
2.8  回收率试验
精密称取“2.7”项下已知含量的三叶青粉末 6
份，约 0.25 g，精密加入近似等量的 2 种对照品，按
“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定含量，结
果见表 1。
表 1 三叶青 4 个黄酮类成分回收率试验（n=6）
组分
样品中含
量（μg）
加入量
（μg）
测得量
（μg）
回收率
（%）
平均回收
率（%）
RSD
（%）
原花青
素 B
1
35.26 31.5 66.60 99.49
97.71 2.80
35.26 31.5 65.89 97.22
35.12 31.5 66.90 100.89
35.21 31.5 65.70 96.80
35.21 31.5 64.51 93.04
35.07 31.5 66.21 98.86
儿茶素
102.10 93.25 198.96 103.87
99.64 2.90
102.10 93.25 195.14 99.77
101.70 93.25 195.14 100.20
101.94 93.25 194.08 98.81
101.94 93.25 190.45 94.92
101.53 93.25 195.05 100.28
2.9  样品含量测定
分别精密称取不同产地三叶青样品粉末 0.5 g，
按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样 2 μL 测定
峰面积，根据标准曲线计算其含量，结果见表 2。
表 2 三叶青药材中 4 个黄酮类成分的含量（n=3）
样品产地
原花青素 B
1
（μg·g-1）
RSD
（%）
儿茶素
（μg·g-1）
RSD
（%）
合计
（μg·g-1）
浙江台州栽培 101.2 2.13 296.7 2.97 397.9
浙江台州市售 01 109.4 2.30 99.0 0.99 208.4
浙江磐安市售 01 116.1 2.44 245.7 2.46 361.8
浙江磐安市售 02 133.0 2.79 335.9 3.36 468.9
浙江丽水市售 02 69.9 1.47 210.7 2.11 280.6
浙江丽水市售 03 104.8 2.20 400.1 3.00 504.9
福建顺昌栽培 100.3 2.11 265.1 2.65 365.4
福建顺昌野生 204.7 4.30 246.6 2.47 451.3
福建福安栽培 192.1 3.03 247.3 2.47 439.4
福建福安市售 82.2 1.73 312.6 3.13 394.8
福建古田野生 01 86.3 1.81 133.2 1.33 219.4
福建古田野生 02 90.6 1.90 163.7 1.64 254.3
福建柘荣野生 242.0 3.08 121.2 1.21 363.2
福建光泽野生 80.6 1.69 596.8 2.97 677.4
福建屏南野生 71.1 1.49 106.6 1.07 177.7
福建上杭野生 66.0 1.39 155.4 1.55 221.4
福建永春野生 214.5 3.50 238.3 2.38 452.8
3 讨论
3.1  测定指标的选择
三叶青中富含黄酮类化合物，课题组前期对三
叶青进行化学成分研究，从中分离并鉴定儿茶素、原
花青素B1，并且两者含量相对较高，而查阅文献发现
目前还未见三叶青中特征黄酮类成分的液相含量测
定的报道，因此本文选择这两个指标用于三叶青药
材的质量控制，并应用于不同产地三叶青质量评价。
3.2  供试品溶液制备方法
通过比较不同浓度甲醇、乙腈作为提取，发现
甲醇提取优于乙腈提取。并且有机相比例低于 50%
时，制备的样品黏性较强，样品过滤难，原因可能是
提取出较多的三叶青多糖或者黏液质。根据提取效
率，最终采用 80% 甲醇作为提取溶剂。同时也比较
了回流提取与超声提取 2 种提取方法，发现两者无
明显差异，最终选择操作较为简便的超声提取。在
此基础上，考察了超声提取的次数、溶剂用量及提取
时间对实验结果的影响，结果表明 80% 甲醇超声提
取 1 次，50 倍量，提取 30 min 即可将药材中原花青素
B1 和儿茶素两种成分提取完全。
3.3  色谱条件的选择
通过比较不同厂家不同粒径色谱柱对三叶
青原花青素 B1 和儿茶素的分离效果，最终选择
菲 罗 门 的 UHPLC Kinetex C18 色 谱 柱（4.6 mm×
100 mm，2.6 μm），UHPLC 柱 既 可 以 用 于 UFLC，
也可以用于普通 HPLC，但分析时间大大缩短。流
动相系统的选择，通过比较乙腈 -0.1% 甲酸水，甲
醇 -0.1% 甲酸水，结果表明，使用乙腈 -0.1% 甲酸水
系统时，2 种待测物均达到基线分离时间更短，故最
终选择乙腈 -0.1% 甲酸水作为流动性系统。检测波
长的选择：原花青素 B1 和儿茶素经过 DAD 全波长
扫描，两者最大吸收波长均为 278 nm，最终选择以
278 nm 作为检测波长。
3.4  样品测定结果分析
对于 20 批福建和浙江三叶青药材含量测定，
结果表明，2 种黄酮成分在不同产地三叶青药材中
各成分含量差异较大。首先，福建柘荣野生、永春
野生、顺昌野生这 3 个批次中原花青素 B1 含量最
高，达到 200 μg/g 以上。浙江磐安市售 02、福建福
安市售、福建光泽野生 3 个产地儿茶素含量最高，
达到 300 μg/g 以上。从两者总量来看，浙江磐安市
售 02、浙江丽水市售 03、福建顺昌野生、福建福安栽
培、福建光泽野生、福建永春野生这 6 个产地相对较
高，达到 400 μg/g 以上。
三叶青药材近年来在福建、浙江两地大量种
植，但是对于三叶青质量控制的方法仅仅局限于总
黄酮的含量，欠缺指标性成分的液相测定方法。因
此本文建立一种 UFLC-DAD 法同时测定三叶青中
两种黄酮原花青素 B1 和儿茶素的含量的方法，该方
法简便、快速、准确，重复性好，可以为三叶青药材质
量控制提供参考依据。◆
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