全 文 ：4　讨论
本文采用多种动物模型及实验方法 ,对具有活血化淤作用的
广西常用中药材水提物进行了抗血栓作用的筛选研究 ,试图寻找
能防治血栓病的治疗药物。实验结果表明 ,山楂叶 、山栀子 、苦丁
茶 、两面针 、山绿茶对小鼠脑血栓模型有一定保护作用;苦丁茶 、
山楂叶 、田七叶等对血小板聚集有一定抑制作用;山绿茶 、肉桂
皮 、绞股蓝 、苦丁茶 、两面针 、田七叶 、山栀子等具有抗凝作用;苦
丁茶 、两面针 、山绿茶 、山楂叶 、绞股蓝 、田七叶等具有降低血脂作
用;苦丁茶 、山绿茶 、田七叶 、山楂叶 、山栀子等可改善急性 “血
淤”证大鼠血液流变学指标。初筛证实这些药材水提物具有一
定的抗血栓作用 , 为今后开发利用这些植物药提供了科学依据。
我们将继续对其有效药材进一步分离 、纯化并提取活性部位 , 可
望获得抗血栓活性更强的中药抗血栓药物。
参考文献:
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收稿日期:2006-01-16;　修订日期:2006-04-17
基金项目:国家 “ 863”计划重点资助项目(N o. 2002AA2Z3217)
作者简介:邹盛勤 (1970 - ),男(汉族),江西奉新人 ,现任宜春学院副教
授 ,主要从事天然药物成分提取与分析研究工作。
车前草中乌索酸和齐墩果酸
含量的反相高效液相色谱法测定
邹盛勤
(江西省天然药物活性成分研究重点实验室 宜春学院生物工程研究所 ,江西 宜春　336000)
摘要:目的 采用反相高效液相色谱(RP -HPLC)法测定车前草中主要成分乌索酸和齐墩果酸的含量 。方法 采用高效
液相色谱法。使用 Nova - Pak C18柱(3. 9 mm ×300 mm, 4 μm), 流动相为甲醇:水(88:12, V /V),流速为 0. 8 m l /m in, 检
测波长为 210 nm ,柱温 25 ℃。结果 乌索酸在 0. 456 ～ 4. 104 μg范围内呈良好的线性关系(r=0. 999 7), 平均回收率为
98. 2 %, RSD =1. 1%;齐墩果酸在 0. 156 ～ 1. 384 μg范围内呈良好的线性关系( r=0. 999 6), 平均回收率为 101. 6%,
RSD =1. 7%。结论 方法灵敏 、准确 、专属性强 ,重现性好 , 可作为车前草药材的质量控制方法。
关键词:车前草;　乌索酸;　齐墩果酸;　高效液相色谱法
中图分类号:R284. 2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2006)11-2119-02
Determ ination ofU rsolic Acid andO leanolic Acid in P lantago asiatica L. byRP -HPLC
ZOU Sheng - qin
(K ey Labora tory of J iangx iP rovince for Research on Active Ingred ien ts in Na turalMed icines, B ioengineering In-
stitute ofY ichunUniversity, Y ichun , J iangxi 336000, China)
Abstract:Objec tive To estab lish am e thod fo r de te rm ining u rso lic acid and o leano lic ac id inP lantago asiatica L. by h igh per-
form ance liquid chrom a tog raphy. M ethods The sepa ra tion w as carried out on Nova - Pak C18 co lumn(3. 9 mm ×300 mm , 4
μm) w ith m e thano l -w a te r(88:12, V /V) as the mobile pha se, a t a flow ra te o f 0. 8 m l /m in. The detection wave leng th w as se t
a t 210 nm. The co lumn w as used a t 25℃. R esu lts U rso lic acid showed a good linear re lationship in the range of 0. 456 ～ 4. 104
μg (r=0. 9997) and the ave rage re coveryw as 98. 2 %, RSD was 1. 1% . O leano lic acid show ed a good linear re la tionsh ip in the
range o f 0. 156 ～ 1. 384 μg ( r=0. 999 6) and the ave rage recove ry w as 101. 6 %, RSD w as 1. 7%. Conc lu sion The m ethod is
sensitive, accu ra te and specific w ith a good repea tability and can be used for the quality con tro l ofP lan tago asiatica L.
Key words:P lan tago asiatica L;　U rso lic ac id;　O leano lic acid;　HPLC
　　车前草 ,又名车前 、牛舌菜 、五根草 、当道 、鱼草等 ,为车前科
植物车前 P lantago asia tica L. 或平车前 P lantago degresa W illd.
的干燥全草。多年生草本 , 叶片形状如饭匙 , 五条明显的弧形叶
脉 , 淡绿褐色穗状花序 ,数支花茎凸出于饭匙形叶片中间地带 ,形
状特殊 ,极易辨识 , 为中医常用药物。车前草主要含有桃叶珊瑚
苷 、芳香醇 、香芹酚 、车前苷 、乌索酸 、齐墩果酸 、β -谷甾醇 、棕榈
酸 、β -谷甾醇脂 、维生素等化学成分 [ 1]。 其药理活性广泛 , 有利
水通淋 、清热名目 、护肝降压 、降低血清胆固醇 、祛痰 、抗菌 、抗炎 、
抗肿瘤等作用。临床上用来治疗尿频 、尿急 、尿血 、肾小球肾炎 、
脐炎 、湿疮等疾病。近年来又发现其对治疗高血压病 、慢性活动
性肝炎 [ 2 ～ 4] 、产后尿潴留等 [ 5]有较好作用。 车前草资源丰富 , 用
途广泛 ,且毒副作用小 , 有广阔的应用前景。我们采用 HPLC法
对其抗肝炎 、抗肿瘤 、抗病毒 、抗炎抑菌主要成分乌索酸和齐墩果
酸的含量进行了测定 ,为控制药材质量提供依据。
1　仪器与试药
1. 1　仪器 美国 W aters515双泵型高效液相色谱仪 , 2996光电
二极管矩阵检测器 , 77251进样阀 , 20 μl定量环 , Enpow er中文色
谱管理系统 , Nova - Pak C18色谱柱 (3. 9 mm ×300 mm , 4 μm ,
W aters公司);RO -MB - 10 D高纯水机(杭州永洁达膜分离设备
厂);FC204N电子分析天平 (上海天平仪器厂 );202 - 26A型数
显电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司 ), KS - 150超
声提取仪器 (宁波科盛仪器厂)。
1. 2　试药 甲醇为色谱纯(上海陆忠试剂厂), 水为高纯水 , 95%
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LISH IZH EN MEDIC INE AND MATERIA MED ICA RESEARCH 2006 VOL. 17 NO. 11 时珍国医国药 2006年第 17卷第 11期
乙醇(分析纯 , 江西同盟试剂化工厂)。乌索酸和齐墩果酸对照
品(中国药品生物制品检定所提供 , 批号:110742 - 200314,
110709 - 200311,供含量测定用)。车前草购于江西省宜春市药
材市场 , 经本所天然药物研究室鉴定为车前 P lantago asiatica L.
的干燥全草。
2　方法与结果
2. 1　色谱条件 色谱柱:Nova - Pak C
18
柱(3. 9 mm ×300 mm , 4
μm ,带保护柱);流动相为甲醇:水(88:12, V /V), 流速为 0. 8 m l /
m in;柱温为 25 ℃;检测波长为 210 nm。以美国药典方法计算 ,
乌索酸和齐墩果酸理论塔板数均大于 9 000。乌索酸和齐墩果酸
对照品及车前草样品的 HPLC色谱见图 1。
图 1　高效液相色谱图
2. 2　对照品溶液的配制 精密称取干燥至恒重的乌索酸对照品
22. 8 m g和齐墩果酸对照品 7. 8 m g,置于 10 m l容量瓶中 ,加入适
量甲醇溶解 , 用甲醇定容 ,得对照品储备液。精密吸取 1 m l储备
液置 10 m l容量瓶中 , 加甲醇稀释至刻度 , 混合均匀 , 制成乌索酸
和齐墩果酸的浓度分别为 0. 228μg /μl和 0. 078μg /μl对照品混
合溶液 , 备用。
2. 3　样品溶液的制备 将车前草样品置烘箱中 90℃烘干 12 h,
研细后精密称取约 4 g, 置于具塞三角烧瓶中 , 加入 10倍量 95%
乙醇 , 采用超声法提取 60 m in, 过滤 , 药渣洗涤两次 , 合并滤液于
50 m l容量瓶中 , 加乙醇定容至刻度 , 摇匀。滤液用 0. 2 μm的滤
膜过滤 , 得车前草提取物的样品溶液。
2. 4 　线性范围实验 分别精密吸取对照品的混合溶液 2. 0, 6. 0,
10. 0, 14. 0, 18. 0 μl进样分析 ,按 2. 1所述色谱条件测定峰面积 ,
以对照品的进样量(μg)为横坐标 , 以峰面积(μV s)为纵坐标 ,
进行线性拟合 , 乌索酸和齐墩果酸的回归线方程分别为:Y乌索酸 =
5. 18×105X -4. 36×104 ( r=0. 999 7), Y齐墩果酸 =6. 21×105X -
6. 32×104(r=0. 999 6) 。表明当乌索酸进样量在 0. 456 ～ 4. 104
μg, 齐墩果酸进样量在 0. 156 ～ 1. 384 μg范围内线性关系良好
2. 5 　精密度实验 精密吸取对照品混合溶液 10 μl,重复进样 5
次 , 分别测定峰面积值 , 计算得乌索酸的 RSD 为 0. 9 %, 齐墩果
酸的 RSD为 0. 7 %,进样方法和仪器精密度良好。
2. 6　重复性实验 取干燥至恒重的同一批车前草样品 5份 ,按样
品溶液制备方法制备样品溶液。精密吸取 10 μl进样分析 , 乌索
酸峰面积 RSD为 2. 1 %,齐墩果酸峰面积 RSD为 2. 3 %。
2. 7 　加样回收率实验 精密称取干燥至恒重 、已知乌索酸和齐
墩果酸含量的车前草样品 5份 , 每份约 4 g,加入适量乌索酸和齐
墩果酸对照品适量 , 5份样品同时按样品溶液制备方法提取 , 进
样分析。乌索酸平均回收率为 98. 2%, RSD 为 1. 1 %,齐墩果酸
平均回收率为 101. 6 %, RSD为 1. 7 %。
2. 8　样品的含量测定 精密吸取车前草样品溶液 10 μl, 注入液
相色谱仪 , 按上述色谱条件测定 , 外标法计算样品中乌索酸和齐
墩果酸的含量。结果见表 1。
3　讨论
3. 1　提取方法的选择 从中草药中提取有效成分的常规方法主
要有热提取法 (热回流法 、索氏法 、煎煮法等)和浸泡法 (渗滤
法 、冷热浸泡法等)两类 [ 6] 。超声提取法在提取过程中有空化 ,粉
碎 , 搅拌等特殊作用 , 对植物药材的细胞具有破坏作用 ,溶媒渗透
到药材的细胞中 , 使药材的化学成分易于溶入溶媒中 [ 7] 。它与
常规提取方法相比 ,提取时间短 , 产率高 , 无需加热 , 降低溶剂消
耗 , 更能节约能源 , 减少环境污染。
表 1　车前草提取物中乌索酸和齐墩果酸含量 %
样品 乌索酸含量 RSD
齐墩果酸
含量 RSD
1 0. 203 0. 8 0. 074 1. 2
2 0. 178 1. 1 0. 050 0. 6
3 0. 215 1. 0 0. 082 0. 9
3. 2　提取时间的确定 样品加入 10倍量 95 %乙醇溶液 ,分别超
声提取 45, 60, 90, 120, 150 m in, 预处理后测定提取液中乌索酸含
量 , 60 m in后乌索酸含量基本无变化 , 表明已提取完全 , 乌索酸平
均加样回 收率为 98. 2%, 齐墩果 酸的平均 加样回收 率
为 101. 6%。
3. 3　检测波长的选择 取乌索酸和齐墩果酸对照品混合溶液进
样 , 在 190 ～ 500 nm 波长范围进行光谱扫描 , 其最大吸收波长均
为 201. 0 nm ,但由于流动相在短波长处有末端吸收 ,为了减少干
扰 , 提高信噪比 , 提取不同波长的色谱图进行比较。 选择 210 nm
为检测波长检测器响应值大 ,基线平稳 , 峰形好。结果见图 2。
图 2　对照品的紫外光谱和不同波长的 HPLC色谱
3. 4　含量测定方法的建立 车前草中乌索酸含量的测定方法一
般采用薄层色谱法 [ 8] , 但由于两组分极性相差极小 ,用薄层色谱
法难以分离 ,其结果往往是两组分的总含量。采用高效液相色谱
法能同时测定乌索酸和齐墩果酸的含量 , 两组分得到良好分离 ,
具有简便 、准确 、灵敏度高 、稳定性和重现性好的优点。提取液经
0. 2 μm滤膜过滤后可直接进样分析 , 样品预处理方法简单 ,多次
重复进样 ,未对色谱柱产生污染。
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时珍国医国药 2006年第 17卷第 11期 LISH IZHEN MEDIC INE AND MATERIA M EDICA RESEARCH 2006 VOL. 17NO. 11