全 文 ：与正常对照组比较 , ＊ P<0.05;与模型组比较 , #P<0.05, ##P<0.01
图 1　各组大鼠 Y-迷宫逃避潜伏期比较
4　讨论
铝是一种神经毒素 ,易沉积于脑内而对中枢神经系统具有毒
性作用 , 到目前为止 ,铝对学习记忆的抑制作用已在多数动物和
人身上实验得到证实 [ 2 ～ 5] 。国外有人报道铝作业工人的短期记
忆能力 、学习能力 、视空间感知能力 、心理运动能力均受到一定程
度的损害。也有调查显示铝厂附近的儿童其智力要明显低于同
年龄的其他儿童。国内有研究表明 , 铝熔铸工人的视觉感知记忆
力 、注意力 、手的运动协调能力均下降 、反应时标准差和最慢反应
时间延长 、数字译码和视觉保留时间延长 , 提示铝对神经行为功
能有影响。动物实验发现 , 给猫 、家兔 、大鼠和小鼠等染铝 , 均可
引起一系列行为异常 ,而且动物出现认知和记忆障碍的时间也早
于其它指标。以往利用铝制备 AD动物模型多以灌胃方式 、腹腔
注射及脑室注射为造模途径 ,与人体实际情况下经水或食物的慢
性摄铝方式不符。本次研究我们以食物中添加 AlCl3的方式对大
鼠进行亚慢性染毒 , 采用电迷宫测定大鼠学习记忆能力 , 结果显
示 , 对照组大鼠在电刺激后逃避启动迅速 , 目标明确 ,方向正确 ,
逃避过程中表现很谨慎。 模型组大鼠在电刺激后 , 多数表现为
惊 、恐 、呆 、慢的特点 ,逃避过程中表现各异 ,或在起始点转圈不向
前跑 、或中途停滞不前 , 且所选择的逃避终点也各不相同。模型
组大鼠逃避潜伏期较正常组出现不同程度的延长 ,逃避正常率出
现不同程度的下降 , 海马神经细胞排列紊乱 , 层数减少 ,神经元数
目减少 , 锥体细胞颗粒空泡变性 ,胶质细胞增多 ,海马与学习记忆
关系密切 , AD患者病理改变最明显的部位也是海马 , 提示铝造
成的海马损伤可能是模型组大鼠对灯光信号 、空间定位的学习及
记忆能力明显下降的重要原因之一。从慢性铝中毒大鼠学习记
忆过程与效果来看 ,模型组大鼠的症状有多数似记忆减退期和混
乱期 AD患者的表现 , 少数与痴呆期 AD患者相似 , 表明 111.9
mg/kg体重 AlCl3饲喂动物建立了较为理想的 AD模型。
从 AD的症状和中医角度看 , AD多属本虚标实 , 本虚多属于
神经亏虚 、气血不足 、阴虚阳懦 ,脑髓空虚 , 标实多属内风上旋 、痰
火上扰 、血瘀阻于脑脉 、饮邪上蒙轻窍等。中医强调 “治病必求
于本” ,脑为神主 , 肾为神根 , 精化气 , 气生神 , 神御精 , 肾通过督
脉上通于脑 , 脑肾一体 ,精气神统一 ,因此 , 补肾即补脑 ,补脑即可
补肾强精。本研究根据补肾添精 、豁痰去瘀 、益气养血 、平肝清脑
治则 , 研究了自拟益智方对大鼠学习记忆能力的影响 , 结果表明
益智方干预后 , 中剂量和高剂量中药组大鼠的学习记忆能力明显
好转 , 各种异常的神经精神症状明显减轻或消失。同时 , 高剂量
中药组大鼠逃避启动和逃避速度比正常组大鼠还快 ,逃避是临难
不恐 , 转移不移。各组大鼠脑形态学检查显示 , 中剂量中药和高
剂量中药组大鼠脑神经元损伤脱落比模型组大鼠明显减轻 ,高剂
量中药组大鼠的作用更为明显 , 实验结果表明 , 益智方可明显预
防 AD模型大鼠学习记忆能力的减退 , 益智方是防治 AD的有效
药物。
参考文献:
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收稿日期:2009-03-01;　修订日期:2009-04-09
基金项目:中南民族大学自然科学基金(No.YZQ05011)
作者简介:刘　钊(1978-),女(汉族),山东济宁人 ,现任中南民族大学药
学院讲师 ,硕士学位 ,主要从事中药抗病毒研究工作.
大青叶有效单体抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究
刘　钊 1 , 杨占秋2 , 肖　红 2
(1.中南民族大学药学院 ,湖北 武汉　430074;
2.武汉大学医学院病毒学研究所 ,湖北 武汉　430071)
摘要:目的 探讨中药大青叶单体 1#, 2#, 3#, 4#体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用。方法 通过观察病毒引起的细胞病变
效应(Cytopathogenicefect, CPE)和 MTT[ MethylThiazolylTetrazolium, 3-(4, 5 -二甲基噻唑 -2)-2, 5-二苯基四氮唑溴
盐 ]法检测药物抗 RSV活性 , 计算药物对病变的抑制率和半数抑制浓度(50% inhibitingconcentration, IC50), 并从药物抗病
毒吸附 ,药物对病毒的直接杀灭作用及抑制病毒在细胞内的生物合成 3个方面初步探索大青叶单体抗 RSV活性的作用机
制。结果 大青叶单体 1#, 2#, 3#, 4#对 RSV无直接灭活作用 ,也不能阻止 RSV的吸附, 而能抑制 RSV在 Hep-2细胞内的的
生物合成 ,其半数抑制浓度(IC50)分别为 32.57, 26.37, 31.60, 29.61μg/ml, 治疗指数(TI)分别为 6.15, 10.50, 9.21, 13.22,
其抗病毒效果优于病毒唑(IC50 =103.20 μg/ml, TI=5.21)和抗病毒口服液(IC50 =105.21μg/ml, TI=5.03), P<0.01。结
论 大青叶单体 1#, 2#, 3#, 4#能安全高效地抑制 RSV在 Hep-2细胞中的增殖, 抑制作用发生在病毒入侵细胞后。
关键词:大青叶;　单体;　呼吸道合胞病毒;　细胞病变效应法;　MTT法
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2009)08-1977-03
　　大青叶(FoliumIsatidis,简称 FI)为十字花科植物菘蓝 Isatis
indigoticaFort的干燥叶。味甘 , 气寒 , 无毒 ,入肝 、心 、胃经 , 清热
凉血 , 为解毒要药。 《名医别录》记载:“疗时气头痛 , 大热 , 口
疮。”《本草纲目》记载:“主热毒痢 ,黄疸 ,喉痹 , 丹毒。”它既能清
·1977·
LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.8 时珍国医国药 2009年第 20卷第 8期
心胃实火 ,治温热病心胃毒盛 , 发斑发疹 , 又善解毒利咽 , 凉血消
肿 , 用治喉痹口疮 、咽喉肿痛。据报道 , 大青叶在临床上多用于流
行性感冒持续高热 、上呼吸道感染 、流行性乙型脑炎 、急性传染性
肝炎等病毒性疾病。而呼吸道感染中 90%以上是由呼吸道病毒
引起 , 其中呼吸道合胞病毒(RSV)居首位 [ 1] 。鉴于此 ,我们从中
药大青叶中提取有效成分 ,制备成大青叶单体 , 实验选用微孔细
胞培养和 MTT法 ,以 Hep-2细胞作为体外筛选细胞模型 , 检测
其对 RSV的抑制作用 , 为筛选新型抗病毒药物和大青叶的临床
应用提供思路和理论依据。
1　材料
中药大青叶(FoliumIsatidis,简称 FI)单体 1, 2, 3, 4#(褐色颗
粒 , 溶于水), 由华中科技大学同济医学院同济医院药剂科方建
国教授提供。病毒唑和抗病毒口服液由南京第三制药厂生产 ,批
号 080302。 Hep-2(鼻咽癌)细胞为武汉大学典型培养物保藏中
心提供 , RSV由英国 Glasgow大学儿童卫生系 Paton博士赠送。
RPMI- 1640和 MTT为 Hyclone公司产品。二甲基亚砜(DM-
SO)由上海菲达有限公司提供。新生小牛血清购自三利公司。
2　方法
2.1　病毒滴度测定 将毒株作 10倍系列稀释 , 每个稀释度重复
10孔 , 同时设正常细胞对照。于 37℃下孵育 2 h, 换细胞维持液。
每天观察细胞病变效应(CPE),约 3 ～ 7d后 CPE不再增多时 ,按
Reed-Muench方法计算 TCID50。
2.2　药物对细胞的毒性的测定 用乙酶将生长良好的 Hep-2
细胞分散成单个细胞悬液 ,按 1×105 /ml浓度分种于 40孔板 ,每
孔 0.1 ml。置 33℃, 5%CO2培养箱中培养 24 h。待细胞长成单
层后 , 弃培养液上清 , 换含不同浓度的含药维持液 , 每孔 200 μl。
大青叶 1, 2, 3, 4#单体的浓度分别为 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640,
800, 1 600μg/ml。每种浓度重复 4孔 , 实验同时设正常细胞对
照 、病毒对照 、阳性药物病毒唑和中药抗病毒口服液对照。继续
培养 48h后 , 以 MTT法检测细胞存活率。并根据如下公式计算
细胞存活率 , 找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。细胞存活率
(%)=(药物组平均 OD570 /细胞对照组平均 OD570)×100%。
2.3　细胞活性测定(MTT染色法)根据 Mosmann建立的四甲基
偶氮唑盐(MTT)法测定细胞活性。弃培养上清液 , 每孔加 5 mg/
mlMTT的不含血清的 RPMI-1640 50μl, 37℃, 5%CO2孵育 4 ～
6 h, 黄色的 MTT被活细胞的线粒体脱氢酶还原成蓝色的甲簪结
晶 , 小心吸出 MTT, PBS洗 3次 , 每孔加 50 μlDMSO终止反应 ,
振荡混匀 , 在 15 min后甲簪结晶被溶解 , 在波长 570 nm下测定
吸光度 OD值。 OD值与活细胞的数量呈正相关。
2.4　药物抗 RSV活性机理的实验
2.4.1　药物对 RSV生物合成的抑制作用实验 于已长成单层的
Hep-2细胞 40孔板上 , 每孔接种 100 μl的 100TCID50的 RSV病
毒液 , 于 33℃吸附 90 min, 弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结
果 , 在大青叶无毒浓度范围内 , 加入 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 μg/ml
的不同浓度的含药维持液每孔 0.2 ml,每日观察 CPE, 隔天换新
鲜含药维持液。实验同时设正常细胞对照 、病毒对照 、阳性药物
病毒唑和抗病毒口服液对照。约在病毒对照 CPE为 “ +++～
++++”(CPE记录方法为:“ -”为无 CPE;“ +”为 25%细胞
出现 CPE;“ ++”为 50%细胞出现 CPE;“ +++”为 75%细胞
出现 CPE;“ ++++”为 100%细胞出现 CPE)时弃培养液上清 ,
用 MTT法检测病毒抑制率 ,并根据如下公式计算药物对 RSV的
病毒抑制率 [ 2] 。
病毒抑制率(%)=药物处理组 OD570 -病毒对照组 OD570细胞对照组 OD570 -病毒对照组 OD570 ×100%
2.4.2　药物直接灭活病毒实验 将 50 μl的 100 TCID50 /ml滴度
的 RSV和 150 μl不同浓度的药物作用 4 h, 反应体系为 0.2 ml。
含并保证药物的终浓度与药效学实验相同。然后将混合液接种
于单层 Hep-2细胞中 , 孵育 1.5 h后 ,换用 2%MEM培养液维持
细胞生长 , 37℃, 5%CO2培养 ,逐日观察 CPE。
2.4.3　药物抗病毒吸附实验 分别将不同浓度的药物加到 Hep
-2单层细胞孔中 , 37℃吸附 90 min, 弃上清 , 再加 100 TCID50 /ml滴度的 RSV100 μl/孔 , 37℃吸附 90 min后 , 弃上清 , 加细胞
维持液 , 37℃, 5%CO2培养 ,逐日观察 CPE。
3　结果
3.1　病毒滴度 按 Reed-Muench法计算病毒的 TCID50为 10-4 ,
即接种滴度为 10-4的病毒每孔 0.1 ml,可使 50%细胞发生明显
病变。实验用病毒浓度为 100 TCID50。
3.2　药物对细胞的毒性 将大青叶单体 1, 2, 3, 4#和病毒唑及抗
病毒口服液的不同浓度对细胞的毒性。结果见表 1。
表 1　大青叶单体 1, 2, 3, 4#对 Hep-2细胞的毒性作用
药物
不同药物浓度时的细胞存活率(%)
10
μg· ml-1
20
μg· ml-1
40
μg· ml-1
80
μg· ml-1
160
μg· ml-1
320
μg· ml-1
640
μg· ml-1
800
μg· ml-1
1 600
μg· ml-1
50%毒性
浓度 TC50
FI1# 85.8 70.2 64.7 46.9 40.3 28.6 21.5 10.6 7.4 200.33
FI2# 86.5 78.9 72.5 54.6 41.2 30.1 23.6 14.9 8.2 277.00
FI3# 88.5 76.1 70.8 56.7 44.0 32.6 22.4 15.9 9.5 290.98
FI4# 90.1 83.7 76.3 60.8 48.5 34.6 30.5 23.4 11.2 391.31
病毒唑 96.2 90.1 83.6 72.8 54.6 46.2 35.6 23.7 16.8 537.83
抗病毒口服液 95.0 84.1 75.6 66.8 55.6 48.4 39.6 26.5 17.1 528.96
图 1　不同浓度大青叶单体 1#和单体 4#
对Hep-2细胞的细胞存活率的比较
通过光镜观察 , 大青叶单体 1#, 2#, 3#, 4#对 Hep-2细胞毒性
作用表现为:细胞粘连 ,变圆 , 壁厚 ,破碎 , 脱落 ,胞浆内颗粒增加 ,
折光性增强。并且吸光值明显下降 ,吸光度 OD值在 0.10以下。
从表 1可知 , 大青叶单体 1#, 2#, 3#, 4#与病毒唑和抗病毒口服液
的 TC
50
>200 g/ml, 说明其安全系数大。药物在 160g/ml范围内
约有半数或以上的细胞存活 , 从而确该药物浓度为对 Hep-2细
胞敏感病毒的抗病毒实验的最高允许浓度;但细胞经较高浓度的
药物作用后 , 药物毒性增强 , 死亡细胞数增加 , 细胞存活率降低
(如图 1所示)。经直线回归分析 , 药物浓度与细胞存活率之间
存在直线关系 , P<0.01。其直线方程和相关系数分别为:Y1#=
59.006-0.042X, r1#= -0.815;Y2#= 63.976 -0.045X, r2#=-0.827;Y3#=64.466-0.045X, r3#= -0.835;Y4#=69.451 -
·1978·
时珍国医国药 2009年第 20卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.8
0.045X, r4#= -0.849。 4者相比较 , 1#单体的毒性最大 , 经 t检
验 , P<0.01;2#单体与 3#单体对细胞的毒性作用相同 , 经 t检验 ,
P>0.05;4#单体毒性最小 , 经 t检验 , P<0.01。但将 4种单体的
TC50与阳性药物病毒唑及抗病毒口服液相比 , 经 t检验 , P<
0.01,有显著性差异 , 说明大青叶单体的毒性更大。
3.3　药物抗病毒生物合成的作用 RSV对 Hep-2细胞 CPE表
现为细胞肿胀 、变圆 ,壁厚 , 折光性减弱 ,多个细胞融合形成大泡 ,
有合胞体形成 48 ～ 72h后 ,用 MTT法按公式计算大青叶单体 1#,
2#, 3#, 4#对 RSV的抑制率 , 并根据治疗指数 TI=TC50 /IC50 , 计算
各种药物的治疗指数。结果见表 2。
表 2　中药大青叶单体 1, 2, 3, 4#的抗 RSV细胞内生物合成作用
药物
药物浓度不同时病毒抑制率(%)
2μg· ml-1 4μg· ml-1 8μg· ml-1 16 μg· ml-1 32μg· ml-1 64μg· ml-1 128μg· ml-1
50%有效
浓度 IC
50
治疗
指数 TI
FI1# 16.80 25.00 35.90 45.50 60.70 80.30 87.80 32.57 6.15FI2# 10.50 19.00 41.70 65.50 68.80 78.60 91.50 26.37 10.50
FI3# 15.70 21.90 30.80 50.20 64.50 75.40 93.10 31.60 9.21
FI4# 21.40 28.50 38.70 47.60 60.20 76.90 89.80 29.61 13.22
病毒唑 6.70 7.80 11.40 20.50 25.90 35.50 57.80 103.20 5.21
抗病毒口服液 6.50 8.40 13.80 22.70 26.60 34.90 56.50 105.21 5.03
　　由表 2可知随药物浓度增加 , 其抗病毒活性增强 , 病毒抑制
率升高(见图 2)。经直线回归分析 ,药物浓度与病毒抑制率间有
直线关系 , P<0.01。其直线方程和相关系数分别为:Y1#=31.
044+0.530X, r1#=0.898;Y2#=34.135+0.538X, r2#=0.806;Y3#=29.490 +0.572X, r3#=0.904;Y4#=33.495 +0.506X, r4#=
0.923。药物浓度在在 128 g/ml以上时 , 对 RSV细胞病变抑制程
度可达 90%左右。 4种单体的 IC50和 TI相比较 , 4#单体的 IC50值
略小 , TI值略大于其他 3号单体。但通过 t检验 , 4种单体间抗
RSV活性无显著性差异 , P>0.05。 将 4种单体在 2 ～ 128 g/ml
范围内的抗 RSV抑制率与阳性对照药物相比 , 经 t检验 , P<0.
01,有显著性差异 ,大青叶单体的体外抗 RSV优于病毒唑和抗病
毒口服液。
图 2　不同浓度大青叶单体 1#、单体 4#和病毒唑对 RSV的病毒抑制率的
比较
3.4　药物直接灭活病毒的作用和药物抗病毒吸附的作用 按实
验方法 “ 2.4.2”和 “ 2.4.3”项将药物与病毒混合后再作用与细
胞 , 或者将药物与细胞作用后再感染病毒 , 逐日观察细胞病变。
通过光镜观察 , 发现各提取部位不同浓度组均出现典型 RSV感
染所致的 CPE, 且与病毒对照孔无显著区别。通过测定各孔
OD
570
并计算不同药物浓度时的病毒抑制率 , 也没有高于 7%的抑
制率和随药物浓度增加而病毒抑制率升高的趋势 ,说明各单体均
不能直接杀灭 RSV,也无阻断其吸附作用。
4　讨论
呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus, RSV)是一种
RNA病毒 , 属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)[ 3] 。它是世界范围
内婴幼儿下呼吸道感染 , 特别是病毒性肺炎(约 50%)和毛细支
气管炎(约 90%)的重要病原 [ 4] 。 RSV每年易在冬春季引起暴发
流行 ,持续约 5个月 , 2岁内儿童为高发感染人群;在成人特别是
老年人和免疫抑制的人群也有爆发流行 , 而目前 FDA批准用于
防治 RSV感染的药物 , 仅有病毒唑(ribavirin), 它应用中常出现
白细胞减少 ,剂量过大时可致头痛 、不可逆贫血 、血清胆红素升高
等副作用 ,动物实验有致畸的报道 ,在临床尤其是婴幼儿的应用
受到限制。而 RSV疫苗也存在安全有效性待测和价格昂贵等缺
点。我们选用清热解毒中药大青叶 , 在实验中发现 , 大青叶单体
对细胞毒性小 , 其无毒浓度在 200 μg/ml以上 , 对 RSV所致的细
胞病变具有较好的抑制作用 , 在 2 ～ 128 μg/ml这一段浓度范围
内均呈现了较明显的量效关系 , 说明当药物不足以结合所有的
病毒时 , 剩余的病毒颗粒还会具有感染细胞并引发细胞病变的能
力;当药物的量足够时 , 可以将绝大部分的病毒粒子结合从而避
免细胞的感染。但当药物浓度大于 128 μg/ml时 ,其对细胞的毒
性作用则掩盖了其抗病毒作用。但其单体成分对细胞的毒性比
病毒唑要大 ,说明还需要改进提取工艺 , 或修饰其结构 , 使其毒性
降低 。
抗病毒实验中 3种不同的加药方式表明 ,它对病毒无直接杀
灭作用 ,可能是由于中药成分温和 ,不含有能破坏病毒的包膜的
有效成分或活性化合物;亦不能保护细胞免受病毒感染 , 可能由
于它不能针对细胞表面的单一病毒受体的成分 , 不能与细胞表
面受体结合 , 从而不能预防病毒的感染。但是它对已经进入胞
内的呼吸道合胞病毒均有一定的抑制作用 ,能抑制病毒核酸复制
或者阻止病毒蛋白合成 ,说明其可能干扰或抑制了病毒基因组的
释放 、复制或转录。其具体抗病毒机制值得从动物体内或者血清
药理学 、分子生物学等进一步深入研究。
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