全 文 ：收稿日期:2013 － 04 － 17;修回日期:2013 － 04 － 26
基金项目:国家自然科学基金(41176144);国家科技支撑计划项目(2013BAB01B01);国家海洋公益性行业科研专项经费项目
(201205027、200905021 － 3);山东省自然科学杰出青年基金资助项目 (JQ200914);广东省中国科学院全面战略合作项目
(2011A090100040)
作者简介:邵明飞(1988 －)，男，硕士研究生，研究方向:海洋藻类学及海洋微生物学，E-mail:mingfeishao@ 126． com;
通讯作者:秦 松(1968 －)，男，研究员，研究方向:海岸带生物技术，E-mail:sqin@ yic． ac． cn。
doi∶10． 3969 / j. issn. 2095 － 1736． 2013. 05. 059
一步柱层析纯化螺旋藻藻蓝蛋白
邵明飞1，4，赵 楠2，李勇勇2，谷洋洋3，刘兆普1，秦 松1，4
(1． 南京农业大学 资源与环境科学学院 江苏省海洋生物学重点实验室，南京 210095;
2． 曲阜师范大学 化学与化工学院，曲阜 273165;3． 汕头大学 理学院生物系，汕头 515041;
4． 中国科学院烟台海岸带研究所 生物资源实验室，烟台 264003)
摘 要:采用硫酸铵盐析结合疏水层析技术分离纯化螺旋藻中的藻蓝蛋白。试验结果表明，在磷酸盐缓冲体系下藻
蓝蛋白粗提液经 1. 25 mol /L硫酸铵盐析处理后离心脱气，只需采用一步 Macro-Prep Methyl 疏水层析，藻蓝蛋白的
纯度(A620 /A280)可提高到 4. 017，回收率为 19. 38%。特征吸收峰和荧光光谱证实纯化后的产物符合藻蓝蛋白的性
质，Native-PAGE电泳只出现单一染色带，表明纯化得到的藻蓝蛋白是均一的;SDS-PAGE 电泳出现分子量为 15. 4
kDa、17. 3 kDa的 2 条染色带，分别为藻蓝蛋白的 α亚基与 β亚基。
关键词:藻蓝蛋白;纯化;Macro-Prep Methyl;Native-PAGE;SDS-PAGE
中图分类号:Q946． 1 文献标识码:A 文章编号:2095 － 1736(2013)05 － 0059 － 05
A singel step chromatography for the purification of phycocyanin
from Arthrospira platensis
SHAO Ming-fei1，4，ZHAO Nan2，LI Yong-yong2，GU Yang-yang3，LIU Zhao-pu1，QIN Song1，4
(1． Key Laboratory of Marine Biology in Jiangsu，College of Ｒesources and Environmental Sciences，
Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095;2． College of Chemistry and Chemical Engineering，
Qufu Normal University，Qufu 273165;3． College of science，Shantou University，Shantou 515041;
4． Biological Ｒesources Laboratory，Yantai Institute of Coastal Zone Ｒesearch，
Chinese Academy of Sciences，Yantai 264003，China)
Abstract:This paper discussed a novel purification method of phycocyanin from Arthrospira platensis using hydrophobic interaction
chromatography． Ammonium sulfate was gradually added to the crude extract of phycocyanin to make the ammonium sulfate concentra-
tion 1. 25 mol /L． The sample was kept static for 12 h at 4℃ and then centrifuged． After degassing，the supernatant was purified by the
single step of Macro-Prep Methyl hydrophobic interaction chromatography． The purity (A620 /A280)was improved to 4. 017． The recov-
ery of phycocyanin was 19. 38% ． The UV-vis and fluoroscence spectra matched the characteristcis of phycocyanin． Ｒesult of Native-
PAGE indicated phycocyanin was homogenious． Molecular weights of the two bands in SDS-PAGE recoganized as α subunit and β sub-
unit of phycocyanin were 15. 4 kDa and 17. 3 kDa，respectively．
Keywords:phycocyanin;purification;macro-prep methyl;native-PAGE;SDS-PAGE
螺旋藻(Arthrospira)是一种分布于热带、亚热带地
区淡水或盐碱湖泊中的丝状多细胞蓝藻，胞内含有丰
富的藻蓝蛋白(c-PC)，其含量占螺旋藻干重的 10% －
20%。研究表明，藻蓝蛋白具有提高机体抗辐射、抗氧
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化［1］、抗炎症［2］、抑菌［3］、增强机体免疫力、保肝护
肝［4］、抗癌［5，6］、保护神经组织免受损伤［7］等生理活
性，是螺旋藻中主要的活性物质，已被广泛应用于食
品、化妆品、医药、分子探针等领域。
制备高纯度的藻蓝蛋白往往需要羟基磷灰石柱层
析、阴离子交换柱层析、凝胶过滤柱层析、扩张床吸附
层析等多次柱层析的结合使用。如 Bermejo 等先用
Streamline-DEAE扩张床吸附层析去除大部分杂质，再
用 Sephadex G-100 凝胶过滤层析柱及 DEAE-52 离子交
换层析柱分离藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白［8］;Bermejo等首
先应用 Streamline-DEAE扩张床吸附层析柱，再用 DE-
AE阴离子交换层析柱纯化藻蓝蛋白，藻蓝蛋白的回收
率为 59%［9］;Niu 等应用 Phenyl-sepharose 扩张床吸附
层析柱、阴离子交换层析柱、羟基磷灰石层析柱相结合
纯化藻蓝蛋白［10］;Abalde 等应用 Butyl-sepharose 疏水
层析柱及 Q-sepharose阴离子交换层析柱纯化 Cyanoba-
terium Synechococcus sp． IO9201 中的藻蓝蛋白［11］;
Eriksen等也列举了多种层析技术结合使用纯化藻蓝
蛋白的方案［12］。多种层析技术的结合使用纯化藻蓝
蛋白往往伴随着纯化步骤多、回收率低、耗时长等问
题。Soni 等从 Phormidium fragile 中分离纯化藻蓝蛋
白，粗提液经两步硫酸铵盐析处理得到藻蓝蛋白沉淀，
然后沉淀物复溶于含有 1. 5 mol /L 硫酸铵的 Tris-HCl
缓冲液中，直接过 Macro-Prep Methyl 疏水层析柱即可
得到藻蓝蛋白纯度高、回收率高的纯化方案［13］。此方
案给出两点参考:1)盐析处理后得到的藻蓝蛋白沉淀
经一定浓度硫酸铵溶液复溶后可直接过疏水层析柱纯
化;2)Macro-Prep Methyl作为一种弱疏水层析填料，对
藻蓝蛋白具有较好的纯化效果。本研究在这两点参考
的基础上进行试验设计，确定了纯化螺旋藻藻蓝蛋白
的工艺技术，为高效制备高纯度藻蓝蛋白提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
螺旋藻粉由北海生巴达生物科技有限公司提供;
Macro-Prep Methyl HIC Media Bio-Ｒad 公司;标准蛋白
(14. 4 kDa、20. 0 kDa、26. 0 kDa、33. 0 kDa、45. 0 kDa、
66. 2 kDa、94. 0 kDa);所有化学试剂均为分析纯(国药
集团化学试剂有限公司);水为去离子水。
TU-1901 紫外可见分光光度计(北京普析通用有
限责任公司);LS-55 荧光分光光度计(PerkinElmer 公
司);DHP-9082 电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有
限公司);BT125D 电子天平(赛多利斯科学仪器(北
京)有限公司);BCD-209FDG 冷藏冰冻箱(青岛澳柯
玛股份有限公司);CT15ＲT 高速台式冷冻离心机(上
海天美科学仪器有限公司);JY300C电泳仪(北京君意
东方电泳设备有限公司);Universal HoodⅡ暗箱式紫外
分析仪(美国 BIO-ＲAD)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 Tris-HCl缓冲体系下纯化藻蓝蛋白
称取一定量的螺旋藻粉，按照料液比 1 ∶ 20 的比
例加入 Tris-HCl 缓冲液(0. 02 mol /L，pH 值 8. 1，含有
0. 004 mol /L的叠氮钠)，搅拌均匀，放于 － 80℃超低温
冰箱冷冻，完全冻结后取出 4℃解冻，反复冻融 3 次，离
心(15000 r /min，15 min，4℃)得到藻蓝蛋白粗提液。
向藻蓝蛋白粗提液中缓慢加入硫酸铵至其饱和度
为 30%，静置 12 h，离心(15000 r /min，15 min，4℃)得
到上清液，向上清液中继续添加硫酸铵至其饱和度为
70%，静置 12 h，离心(15000 r /min，15 min，4℃)得到
蓝色沉淀。蓝色沉淀先用 1. 5 mol /L 硫酸铵的 Tris-
HCl缓冲液(0. 02 mol /L，pH 值 8. 1，含有 0. 004 mol /L
的叠氮钠，下同)溶解，离心(15000 r /min，15 min，4℃)
得到上清液与沉淀，再用 1. 5 mol /L硫酸铵的 Tris-HCl
缓冲液(0. 02 mol /L，pH值 8. 1，含有 0. 004 mol /L的叠
氮钠)溶解沉淀，离心(15000 r /min，15 min，4℃)得到
上清液与沉淀，然后用 1. 25 mol /L 硫酸铵的 Tris-HCl
缓冲液(0. 02 mol /L，pH 8. 1，含有 0. 004 mol /L的叠氮
钠)溶解沉淀，离心(15000 r /min，15 min，4℃)得到蓝
色上清液。蓝色溶液经脱气后上柱。
用含 1. 25 mol /L 硫酸铵的 Tris-HCl 缓冲液平衡
Macro-Prep Methyl疏水层析柱(1. 5 cm × 15 cm)，然后
将经过复溶获得的上清液上柱。分别用 1. 25 mol /L硫
酸铵的 Tris-HCl 缓冲液、1. 2 mol /L 硫酸铵的 Tris-HCl
缓冲液、1. 15 mol /L 硫酸铵的 Tris-HCl 缓冲液、1. 0
mol /L硫酸铵的 Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为
3 mL /min。
1. 2. 2 磷酸盐缓冲体系下纯化藻蓝蛋白
1. 2. 2. 1 藻蓝蛋白的提取与纯化
称取一定量的螺旋藻粉，按照料液比 1 ∶ 20 的比
例加入磷酸盐缓冲液(0. 002 mol /L，pH 值 7. 0，含有
0. 004 mol /L的叠氮钠)，搅拌均匀，放于 － 80℃超低温
冰箱冷冻，完全冻结后取出 4℃解冻，反复冻融 3 次，离
心(15000 r /min，15 min，4℃)得到藻蓝蛋白粗提液。
向藻蓝蛋白粗提液中缓慢加入硫酸铵至其浓度为
1. 25 mol /L，持续低速搅拌 1 h，放于 4℃静置 12 h，离
心(15000 r /min，15 min，4℃)得到上清液，脱气后上
柱。
用含 1. 25 mol /L 硫酸铵的磷酸盐缓冲液(0. 002
mol /L，pH 值 7. 0，含有 0. 004 mol /L 的叠氮钠，下同)
平衡 Macro-Prep Methyl疏水层析柱(1. 5 cm × 15 cm)，
然后将经过硫酸铵盐析处理获得的上清液上柱。分别
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用 1. 25 mol /L硫酸铵的磷酸盐缓冲液、0. 9 mol /L硫酸
铵的磷酸盐缓冲液、0. 5 mol /L 硫酸铵的磷酸盐缓冲
液、0. 2 mol /L硫酸铵的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，
流速为 3 mL /min，收集纯度(A620 / A280)大于 4. 0 的洗
脱液，用截流分子量为 30 kDa 的超滤管进行脱盐浓
缩，浓缩液放于 4℃保存。
1. 2. 2. 2 光谱特征测定
用紫外可见分光光度计对纯度为 4. 017 的藻蓝蛋
白样品进行 250 ～ 750 nm 全波长扫描，用荧光分光光
度计测定该样品的荧光激发光谱和荧光发射光谱。
1. 2. 2. 3 SDS-PAGE和 Native-PAGE
SDS-PAGE:采用浓缩胶浓度为 5%、分离胶浓度为
15%的垂直板不连续电泳系统。纯度为 4. 017 的藻蓝
蛋白样品在浓缩胶中电泳电压为 90 V，进入分离胶后
将电压调节为 150 V。跑胶结束将胶体去除，用考马斯
亮蓝 Ｒ-250 染色 4 h，然后摇床脱色。
Native-PAGE:采用浓缩胶为 5%、分离胶为 6%的
垂直板不连续电泳系统。纯度为 4. 017 的藻蓝蛋白样
品在浓缩胶中电泳电压为 90 V，进入分离胶后将电压
调节为 130 V。跑胶结束将胶体去除，用考马斯亮蓝
Ｒ-250 染色 4 h，然后摇床脱色。
1. 2. 3 浓度与纯度分析
测定样品溶液在 652 nm、620 nm、280 nm 处的吸
光度，根据下式［14］计算藻蓝蛋白的浓度:
cPC，mg /mL = 0. 162 × A620 － 0. 098 × A652
cPC，藻蓝蛋白浓度;A620，样品在 620 nm 处的吸光度;
A652，样品在 652 nm处的吸光度。
根据下式计算藻蓝蛋白的纯度:
纯度 = A620 /A280
A620，样品在 620 nm 处的吸光度;A280，样品在 280 nm
处的吸光度。
2 结果与分析
2. 1 Tris-HCl缓冲体系下纯化藻蓝蛋白
藻蓝蛋白粗提液经 30%、70%饱和度的两次硫酸
铵盐析处理后得到蓝色沉淀，将此沉淀中藻蓝蛋白回
收率定为 100%。不同浓度硫酸铵溶液溶解蓝色沉
淀，纯化效果见表 1，各上清液紫外可见光谱扫描见图
1。可知，大部分藻蓝蛋白在 1. 5 mol /L 的硫酸铵溶液
中不溶解，离心得到的上清液中含有大量的别藻蓝蛋
白;用 1. 25 mol /L的硫酸铵溶液溶解沉淀离心得到的
上清液中藻蓝蛋白纯度(A620 /A280)为 2. 760。本研究
结果与 Soni 等的实验步骤有差异，Soni 等是用 1. 5
mol /L硫酸铵溶液溶解藻蓝蛋白沉淀并在此浓度条件
下获得很高的藻蓝蛋白回收率。这可能是不同种属藻
类中的藻蓝蛋白存在性质差异导致。
图 1 藻蓝蛋白沉淀不同溶解方案得到的
上清液紫外可见光谱扫描图
Fig 1 UV-vis absorption overlay spectra of supernatant
from different solving methods
表 1 藻蓝蛋白沉淀的不同溶解方法对藻蓝蛋白纯化效果的影响
Table 1 Impacts of different solving methods of the precipitate on phycocyanin purification
处理步骤 A652 A620 A280 A620 /A652 A620 /A280 PC浓度 PC回收率
第一次沉淀复溶离心上清液 0. 816 0. 660 2. 558 0. 809 0. 258 0. 243 4. 60%
第二次沉淀复溶离心上清液 0. 329 0. 353 0. 320 1. 073 1. 103 0. 374 9. 33%
第三次沉淀复溶离心上清液 0. 248 0. 759 0. 275 3. 060 2. 760 1. 973 86. 06%
图 2 藻蓝蛋白的洗脱曲线
Fig 2 Elution curve of phycocyanin
经上述纯化步骤得到的溶液上 Macro-Prep Methyl
HIC，不同浓度硫酸铵溶液洗脱曲线见图 2。可知，在
1. 25、1. 2、1. 15 mol /L 的硫酸铵洗脱液均未洗脱出藻
蓝蛋白，在 1. 10 mol /L 的硫酸铵洗脱条件下，有洗脱
峰，经紫外可见光谱检测被洗脱出的物质为藻蓝蛋白。
对 1. 10 mol /L硫酸铵洗脱液进行部分收集，测定各收
集液在 620 nm、280 nm 处的吸光度，绘制洗脱曲线如
图 3。未收集到纯度大于 3. 0 的藻蓝蛋白溶液，纯度大
于 2. 0 的藻蓝蛋白溶液回收率为 68. 43%。上柱液的
纯度为 2. 760，经 Macro-Prep Methyl HIC 纯化后，洗脱
液的纯度并没有得到明显提高，且回收率下降幅度大。
该结果与 Soni 等的研究结果有差异。这可能是在
Tris-HCl缓冲系统(0. 02 mol /L，pH值 8. 1，含有 0. 004
mol /L的叠氮钠)下 Macro-Prep Methyl 柱料与螺旋藻
藻蓝蛋白间的作用力弱，导致纯化效果不理想。
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图 3 1. 10 mol /L 硫酸铵溶液洗脱得到的藻蓝蛋白洗脱曲线
Fig 3 1. 10 mol /L ammonium sulfate elution curve of phycocyanin
2. 2 磷酸盐缓冲体系下纯化藻蓝蛋白
2. 2. 1 藻蓝蛋白的提取与纯化
硫酸铵盐析处理后离心得到的上清液过 Macro-
Prep Methyl 疏水层析柱，用 1. 25、0. 9、0. 5、0. 2 mol /L
硫酸铵的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，洗脱曲线见图
4。分别收集各峰处的洗脱液进行紫外可见光谱扫描，
可知峰 1 为未与柱料结合的藻蓝蛋白和其他杂质的
峰;峰 2 为别藻蓝蛋白峰，通过疏水层析色谱可实现藻
蓝蛋白与别藻蓝蛋白的分离;峰 3 为藻蓝蛋白峰，峰 4
为藻蓝蛋白峰，这可能是很少一部分藻蓝蛋白与柱料
相互作用力较强，在 0. 5 mol /L 硫酸铵的磷酸盐缓冲
液洗脱条件下不能被洗脱下来，而在 0. 2 mol /L 硫酸
铵的磷酸盐缓冲液洗脱条件下被洗脱下来，故得到峰
4。对 0. 5mol /L 硫酸铵的磷酸盐缓冲液的洗脱液进行
部分收集，然后分别测定各部分洗脱液中藻蓝蛋白的
纯度，将藻蓝蛋白纯度大于 4. 0 的洗脱液混合，混合液
中藻蓝蛋白纯度为 4. 017，回收率为 19. 38%，绘制的
洗脱曲线如图 5。对 0. 2 mol /L 硫酸铵的磷酸盐缓冲
液的洗脱液进行部分收集，然后分别测定各部分洗脱
液中藻蓝蛋白的纯度，未收集到纯度大于 4. 0 的藻蓝
蛋白液。
图 4 疏水层析柱洗脱曲线及各峰的紫外可见扫描图
Fig 4 Elution curve of sample via HIC and UV-vis absorption
spectra of elutes at each peak
粗提液中藻蓝蛋白得率为 7. 89%，将粗提液中藻
蓝蛋白回收率定为 100%，计算纯化过程中藻蓝蛋白
的回收率，各步纯化效果及藻蓝蛋白回收率见表 2。
经硫酸铵盐析处理后，离心得到的上清液脱气后即可
直接上 HIC柱进行纯化，不需要其他处理。
表 2 纯化步骤对藻蓝蛋白的影响
Table 2 Impacts of purification steps on phycocyanin
纯化步骤 A652 A620 A280 A620 /A652 A620 /A280 c-PC浓度
c-PC
回收率
粗提液 0. 348 0. 784 1. 549 2. 253 0. 506 1. 858 100%
硫酸铵盐析 0. 276 0. 528 1. 344 1. 913 0. 393 1. 170 71. 10%
疏水层析 0. 091 0. 478 0. 119 5. 253 4. 017 0. 069 19. 38%
图 5 0. 5 mol /L 硫酸铵的磷酸盐缓冲液洗脱得到的藻蓝蛋白洗脱曲线
Fig 5 0. 5 mol /L ammonium sulfate elution curve of phycocyanin
由图 6 可知，藻蓝蛋白的特征吸收峰在 620 nm
处。A是粗提液的紫外可见扫描图，B 是经硫酸铵盐
析后离心得到的上清液的紫外可见扫描图，C 是经过
疏水层析柱纯化收集到的藻蓝蛋白纯度大于 4. 0 的溶
液的紫外可见扫描图。随着纯化步骤的进行，溶液在
652 nm处肩峰凸起的程度越来越小，说明别藻蓝蛋白
被有效地去除。
图 6 各纯化阶段藻蓝蛋白溶液的紫外可见光谱扫描
Fig 6 UV-vis absorption overlay spectra of phycocyanin from
Arthrospira platensis at each stage of purification
A—粗提液;B—硫酸铵盐析后离心得到的上清液;C—藻蓝蛋白纯度
大于 4. 0 的疏水层析洗脱液。
2. 2. 2 光谱性质
从图 7 可知藻蓝蛋白的最大吸收峰在 620 nm处。
从图 8 可知藻蓝蛋白的荧光激发光谱峰及荧光发射光
谱峰分别位于 618. 5 nm处与 640 nm处，与 Chen 等报
道的藻蓝蛋白荧光激发光谱、荧光发射光谱所得出的
结果相近［15］。本文中的光谱信息符合已知的藻蓝蛋
白的光谱性质。
图 7 藻蓝蛋白紫外可见光谱
Fig 7 UV-vis absorption spectrum of phycocyanin
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图 8 藻蓝蛋白的激发光谱及发射光谱
Fig 8 Fluorescence excitation and emission spectra of phycocyanin
2. 2. 3 SDS-PAGE和 Native-PAGE
从图 9 可知，SDS-PAGE 图上有两条带，分子量分
别为 15. 4 kDa、17. 3 kDa，对应藻蓝蛋白的 α 亚基与 β
亚基。Seo等研究表明，藻蓝蛋白的 α 亚基、β 亚基的
分子量分别为 18. 4 kDa、21. 3kDa［16］;Bermejo 纯化的
藻蓝蛋白的 α 亚基、β 亚基的分子量分别为 17，783
Da、20，893 Da［9］。所测 α亚基与 β亚基的分子量与前
人报道的结果之间的差异可能是由于螺旋藻培养条件
的不同导致。Native-PAGE只显示一条带，说明藻蓝蛋
白比较均一。
图 9 藻蓝蛋白的 SDS-PAGE和 Native-PAGE
Fig 9 SDS-PAGE and Native-PAGE of phycocyanin
3 结论
在磷酸盐缓冲系统下藻蓝蛋白粗提液经 1. 25
mol /L硫酸铵盐析处理后离心脱气，通过一步 Macro-
Prep Methyl疏水层析纯化螺旋藻中的藻蓝蛋白，即可
达到高纯度的要求。藻蓝蛋白的纯度(A620 /A280)可提
高到 4. 017，回收率为 19. 38%。特征吸收峰和荧光光
谱符合藻蓝蛋白的性质，Native-PAGE电泳只出现单一
染色带，表明纯化得到的藻蓝蛋白是均一的;SDS-
PAGE电泳出现分子量为 15. 4 kDa、17. 3 kDa的 2 条染
色带，分别为藻蓝蛋白的 α 亚基与 β 亚基。整个纯化
过程只涉及到硫酸铵盐析与疏水层析两个单元操作，
而且硫酸铵盐析处理后离心得到的上清液不需要特殊
处理即可上柱纯化，操作简单、衔接性强，纯化成本低
廉，适合规模化制备高纯度的藻蓝蛋白。
参考文献:
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第 30 卷第 5 期
2013 年 10 月
生 物 学 杂 志
JOUＲNAL OF BIOLOGY
Vol. 30 No. 5
Oct，2013
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