全 文 ：药 物 生 物 技 术
Ph a r m
a e eu ti a elBi ote ehn ol og y2 0 05
,
1 2 ( 4 )
:
2 5 5一 2 5 7 2 5 5
盐泽螺旋藻多糖 S P 抑制肿瘤细胞的研究
于 光 ,马宇翔 ,张成武 ’ ,李朝军 `
(南京师范大学江苏省分子医学生物技术重点实验室 ,江苏 南京 2 10 0 97)
摘 要 热水抽提法提取盐泽螺旋藻多糖 , I ) E es 5 2 柱层析纯化 , eS p h ad ex G 10 o 柱层析鉴定其纯度 ,获得纯
化组分 SP 。 通过体外细胞实验发现纯化的多糖可以选择性的抑制肿瘤细胞的生长 。 通过对肿瘤细胞形态的观
察 ,发现在 SP 作用下 ,细胞出现凋亡小体 ;结合 H co h es -t 33 3 4 2 染色 ,初步认为多糖是通过促进肿瘤细胞的凋亡
来抑制肿瘤细胞的生长 。
关键词 盐泽螺旋藻 ;多糖 ;提纯 ;肿瘤细胞
中图分类号 : R 9 65 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 5 一 89 15 ( 20 0 5 ) 0 4 一 0 2 55一0 3
对螺旋藻的开发研究 , 国内外主要集中在极大
螺旋藻和钝顶螺旋藻上 l[, ’ 〕 ,而盐泽螺旋藻研究较
少 ,且偏重于盐泽螺旋藻的培养条件及环境耐受的
研究困` 〕 ,且对其生物学活性尚未开展 。 因此实验
选用环境耐受性好 , 而且多糖和藻蓝蛋白含量非常
丰富的盐泽螺旋藻为对象 , 开展了其多糖的分离纯
化和抑制肿瘤细胞活性的研究 , 旨在为它的开发应
用提供一定的实验和理论依据 。
1 实验材料与方法
1
.
1 实验材料
盐泽螺旋藻 ( sP i o il an :动犯 lsa )由以色列本古
里昂大学沙漠研究所微藻生物技术实验室提供 。 生
长于肠 n ℃uk 培养基中 , 以冷白荧光灯作为光源 ,光
暗周期为 14 , 10 ,光强为 3 0 0 lx ,在 28 ℃恒温室通
气培养 ,一般生长 s d后于其对数生长后期收获 。
7 4 0 2
: 人的肝癌细胞 , H e L a : 人的宫颈癌细胞 ,
U 25 1
: 人的神经瘤细胞 , 3 T 3 : 人成纤维细胞 , 均为
本实验室购买并保存 。
实验中作用 于细胞 的样品均为细胞培养基
配制 。
1
.
2 多糖的提纯圈
新鲜藻泥热水提取多糖 , 酶解 , 反va g e 法脱蛋
白 ,澳化十六烷基三甲钱 ( C l人13 )沉淀 ,丙酮 、 乙醚相
继脱水 。 经 D-E 52 层析柱层析 , 。 . 1一 3 . 9 mo l/ L
N a CI 溶液线性梯度洗脱 , 5 m l 每管收集洗脱液 ,
蕙酮一硫酸法跟踪检测 , 收集峰尖部分 。 对蒸馏水
透析后水浴浓缩 , 乙醇沉淀 。 S eP h a de x G 10 0 柱
层析鉴定纯度 。
1
.
3 肿瘤细胞 、 正常细胞的继代培养
细胞生长的培养基为 R PM I一 1 64 0( 含 10 % 的
小牛血清 , 10 0 拌g /m l 链霉素 , 10 单位 / m l 青霉
素 ) , 5 % c O Z , 37 ℃的培养箱中培养 。
1
.
4 细胞形态变化的观察
对数期的细胞胰蛋白酶消化 , 调整细胞数使其
密度达到 4 x lo `个 / m l , 转移至 96 孔板 中 , 5%
C O :
,
3 7℃的培养箱中培养 24 h ,使其完全贴壁并
生长良好 。 向细胞培养孔中加人样品 S P , 设对照
组 (加等体积培养基 ) 。 每种处理至少设 8 个平行
孔 。 继续培养一段时间 ,倒置显微镜观察 , L ie ca 数
码相机拍照 。
1
.
5 S R B 体外药物敏感实验方法圈
细胞培养结束后 , 三氯乙酸 ( T C A ) 固定细胞 ,
0
.
4% S R B (磺基罗丹明 B )染色 , 空 白对照调零 ,
49 0
n
m 波长检测 。 对每种细胞的处理重复 3 次 ,进
行数据统计 ,并计算样品对肿瘤细胞的体外抑制率 。
抑制率一 (对照孔 O D 值一样品孔 O D 值 )/ 对
照孔 0 1〕值 x 10 。%
l
·
6 H o e h e s t 染色〔, · 8 ]
细胞培养加样方法同上 , 取出盖玻片 PBS 液
收稿 日期 : 2 00 5一0 3一 0 8 修回 日期 : 2 0 0 5一0 4一 2 0
作者简介 : 于光 ,南京中医药大学 ,基础医学院 。 -E nar il : yu g ua ng 928 @ s ina . c o .nr C n
, 通讯作者 :李朝军 、张成武 , 南京师范大学教授 。
2 5 6药 物 生 物 技 术 第 2 1卷第 4期
洗 2遍 , 2 0 拜g / I J H o e h e s t : 3 3 3 4 2 常温避 光染色
5 m in
,荧光显微镜下观察细胞核的形态 。
U 25 1细胞有类似结果 ,所以选择 50 拌g /m l为多糖
的作用浓度 。
2 实验结果
2
.
1 多糖的提纯
热水抽提盐泽螺旋藻多糖 , 经 D E一 52 柱层析
分离纯化 , 蕙酮 一硫酸检测结果如图 1 所示为 4 个
洗脱峰 ,第一峰为柱穿过峰 ,第二峰为主峰 ,经蒸馏
水透析后浓缩 , 乙醇沉淀回收得到多糖 。 其余为次
要峰 ,且葱酮一硫酸法受高浓度 N a CI 的干扰 ,蒸馏
水透析浓缩后 回收到的多糖量很少 。 故取第二峰
的峰尖部分冻干供纯度鉴定 。
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C o n C e n t ra t io n o f S P ( “ g l m l)
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nt 撤 io n SP on 74 0 2 e e l l
2
.
2
.
2 不 同作 用时间对肿瘤细胞的影响 设立
S P 作用时间的梯度为 24 h , 48 h 。 图 4 实验得出
在 H el a 细胞中加样后继续培养 48 h ,可充分发挥
抑制效果 ,且不会因为培养基营养成份的消耗细胞
生长受影响 , 即可进行 SR B 法检测 。 对于 7 4 0 2 肝
癌细胞 、 U 2 51 细胞有类似结果 ,所以选择 48 h 为
样品的作用时间 。
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一
5 2
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取浓度为 2 m g /m l 的回收多糖 s ml 上 eS p h -
a d e x G I OO柱 , 0 . 1 m o l / I , N a C I溶液洗脱 ,结果如
图 2所示 ,呈单一洗脱峰 。 收集并冷冻干燥 , 以 SP
表示纯化多糖 。
2 4 4 8 ( h r )
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3 S P 对 3 T 3 细胞的影响
S P 对 3 T 3 细胞生长的影响见图 5
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2
.
2 S P 对肿瘤细胞的影响
2
.
2
.
1 不 同浓度 S P 对肿瘤细胞的影响 不同浓
度 S P 对肿瘤细胞生长的影响见图 3 。
由图 3 可见 , S P 对肿瘤细胞的抑制作用存在
明显的剂量效应 , 当 SP 浓度为 5。 拌g /m l 时对
7 4 0 2 肝癌细胞生长有显著抑制 。 对于 H el a 细胞 、
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e e t o f S P o n 3T 3 ce ll
如图 5 , S P 对 3 T 3 细胞没有非常显著的影响 。
于 光等 :盐泽螺旋藻多糖S P抑制肿瘤细胞的研究 2 5 7
2
.
4
2
.
4
.
对肿瘤细胞抑制机理初步研究
光镜观察凋亡小体 的产生 光镜观察 sP3讨 论
对 U2 51细胞形态的影响 ,加样 48 h 后 , 可以看到
S P诱导 U 25 1 细胞产生凋亡小体 ( 图 6 ) 。
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e e ll p r叼 u e e a因post is lx 泪les ( x 20 )
2
.
4
.
2 H o e h e s t 染色 以 U 2 5 1 细胞为例 , 如图
7 a 所示对照组细胞核大 ,着色深 , 为 U 2 51 原细胞
核形态 。 加 S P 后 ,细胞的细胞核断裂成大小不等
的团块 , 开始出现凋亡形态 ( 图 7b ) 。
螺旋藻分离纯化的方法不同得到的组分可能
不一样 。 例如 S h e k h a r m 〔,〕等分别用冷水 、 热水和
酸提取纯化 SP iur il an lP at el is 、 中的多糖 , 每一种
方法都纯化到一个组分 ,但组成多糖的成分发生变
化 。 另几个研究者用热水提取 5 . p l a t en .is : 中的
多糖 , 也得到单组分 , 但多糖的成份差异却很大 。
周志刚等用热水提取 5 . anI x im a 中的多糖经 D E -
A E
一
S e p h a d e x A
一
2 5 柱层析纯化得到两个组分的多
糖 (成份分析未见报道 ) 。 说明同一属植物 ,多糖组
分也会因种的差异而不同 , 即使同为一个属种 , 也
会因培养方式 、提取方式等的不同而造成糖成份的
差异 。
热水 抽提藻体 , C T A B 沉 淀 , 脱蛋 白后 , 经
D -E 5 2 柱层析 , 收集主峰峰尖部分 ,透析浓缩后乙
醇沉淀 。 eS p had ex G 10 柱层析鉴定其纯度 , 获
得纯化组分 SP 。 通过体外的细胞实验发现 , SP
可有效的抑制 U Z 5 1 、 7 4 0 2 、 H e la 肿瘤细胞 的生
长 , 并且对 3 T 3 细胞 的生长 没有非常明显 的影
响 ,这与刘宇峰〔’ 。〕的报道是一致的 。 在此基础上
还初步的探讨 了 SP 对肿瘤细胞的抑制机理 , 结
合细胞形态观察和 H oc he st 染色实验 , 我们认为
SP 主要通过促进肿瘤细胞的凋亡而抑制其生长 ,
这为更好的开发和利用藻类提供了一定的理论
基础 。 但是具体的 SP 通过什么结构来促使肿瘤
细胞发生凋亡还有待于进一步的研究 , 因为不同
种类的多糖其抗癌活性结构可能有所不同 , 目前
尚未发现较为统一的构效关系 。
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, e l i n i e a l a p p l i e a t i o n s
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