全 文 ：179※分析检测 食品科学 2011, Vol. 32, No. 06
原子荧光光谱法测定富硒螺旋藻片中
不同形态、价态的硒
王 梅 1，张红香 2，邹志辉 1，杨冰仪 1，陈 健 1
(1.广东药学院公共卫生学院，广东 广州 510310；2.山东绿叶制药有限公司，山东 烟台 264003)
摘 要：采用氢化物发生原子荧光法测定两种富硒螺旋藻片中不同形态和价态的硒含量。研究仪器原子化器高度、
盐酸、硼氢化钾浓度对硒荧光信号值的影响，比较微波和湿法消化两种消化方法，以及反复冻融和超声波细胞粉
碎法对蛋白溶出率的影响。结果显示，两种消化方法无显著性差异(P=0.6900)，反复冻融法所得硒含量仅为超声
波细胞粉碎法的 25%～30%，超声波细胞粉碎法优于反复冻融法。在最佳实验条件下，测得两种富硒螺旋藻片硒
含量有显著性差异(P＜ 0.0001)，但都存在无机态和有机态的硒，并以有机硒为主，占 60%左右，且主要是以蛋
白质结合的形式存在，无机态的四价硒和六价硒含量，样品 1有显著性差异(P=0.0094)，但样品 2的四价硒和六价
硒含量无统计学差异(P=0.2269)。方法的检出限为 0.64ng/g，加标回收率为 93.0%～98.8%，该方法操作简便，灵
敏度高，检出限低，线性范围宽，可作为不同形态和价态的硒含量的测定方法。
关键词：原子荧光；富硒螺旋藻片；硒；形态；价态
Determination of Chemical State and Valence for Selenium in Se-enriched S.pirulina Tablets by
Atomic Fluorescence Spectrometry
WANG Mei1，ZHANG Hong-xiang2，ZOU Zhi-hui1，YANG Bing-yi1，CHEN Jian1
(1. School of Public Health, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510310, China；
2. Shandong Luye Pharma Group Co. Ltd., Yantai 264003, China)
Abstract ：Selenium contents with different chemical states and valences in two kinds of Se-enriched S.pirulina tablets were
determined by atomic fluorescence spectrometry generated from hydride. The effects of atomizer height, HCl concentration and
KBH4 concentration on Se fluorescence signal were investigated. The microwave digestion and wet digestion were also compared.
In addition, the effects of ultrasonic cell-break method and repeated freezing-thaw method on the extraction rate of protein were
explored. Results indicated that two digestion methods had no significant difference (P = 0.6900), and selenium content in samples
treated by repeated freezing-thaw method was only 25%－ 30% of that treated by ultrasonic cell-break method, which
suggested that ultrasonic cell-break method was better than repeated freezing-thaw method. Under the optimal conditions,
selenium contents in Se-enriched S.pirulina tablets were significant difference (P < 0.0001). Although both inorganic Se and organic
Se co-existed, the organic Se in the states of Se (IV) and Se (VI) was still prominent, which was up to 60%. The contents of Se in both
states in sample 1 revealed a significant difference (P = 0.0094), but the contents of Se in both states in sample 2 had no significant difference
(P = 0.2269). The detection limit of this method was 0.64 ng/g, and the recovery rate of spiked samples was in the range of 93.0%－
98.8%. Therefore, this method is characteristics of simple operation, high sensitivity and low detection limit, and provides a theoretical
reference for determining the content of Se in different states and valences from Se-enriched S.pirulina tablets.
Key words：atomic fluorescence spectrometry；Se-enriched S.pirulina tablets；Se；chemical state；valence
中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)06-0179-04
收稿日期：2010-04-15
作者简介：王梅(1978—)，女，实验师，硕士，主要从事卫生检验与食品分析研究。E-mail：wmei02@163 .com
硒(selenium)是唯一受基因调控的人体必需微量元
素，具有多种重要的生物学功能，硒的缺乏和过剩都
将导致多种疾病[ 1- 2]。我国大部分地区为缺硒、少硒地
区，一般是通过食品强化来解决补硒问题。近年来许
多微生物、植物甚至动物都被作为硒的生物有机化载体
进行研究，且已开发出高附加值的富硒产品，富硒螺
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旋藻就是其中之一。
目前，国内富硒螺旋藻中的硒形态分析主要采用荧
光法[ 3 -4 ]、电感耦合等离子体发射光谱法( induc tive ly
coupled plasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES)[5]，
但还未见应用原子荧光光谱法研究富硒螺旋藻中硒形
态、价态的报道。螺旋藻片在加工过程中因加入了其
他的辅料，介质比较复杂。本实验通过对样品前处理、
原子化高度、载流、硼氢化钾质量浓度等方面进行研
究，旨在建立采用原子荧光光谱法对富硒螺旋藻片中的
硒形态、价态分析的方法，以期为研究富硒螺旋藻片
中硒的营养效应提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
富硒螺旋藻片 2种均为市售品牌，标记为样品 1和
样品 2。样品经 55～60℃干燥 24h，研磨后使用。
1mg/mL硒标准储备液 国家标准物质中心；40μg/L
硒标准使用液，临用前逐级稀释；实验用试剂均为优级
纯或分析纯；实验用水为 3次石英亚沸蒸馏水；实验用
玻璃仪器均用质量分数 10%硝酸浸泡 24h，再用 1次水
及 3 次蒸馏水洗净。
1.2 仪器与设备
AFS-920双道原子荧光光谱仪 北京吉天仪器有限
公司；22R型台式冷冻离心机 德国Hettich公司；JY92-
Ⅱ超声波细胞粉碎仪 宁波新艺超声设备有限公司；
MDS-2003型微波消解仪 上海新仪微波化学科技有限公
司；EH35A型电热板 北京莱伯泰科公司；CU-420型
数显恒温水浴锅 上海一恒科技有限公司；BT224S万
分之一天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司。
1.3 仪器工作条件
灯电流 30mA，光电倍增管负高压 260V，原子化
器高度 9mm，载气流量 400mL/min，屏蔽气流量 800mL/
min，测定方法采用标准曲线法，读数方式为峰面积，
进样体积 1.0mL。
1.4 样品处理
1.4.1 总硒
准确称取样品 0.1～2.0g，于 50mL锥形瓶中，加入
15mL HNO3-HClO4(4:1，V/V)的混合酸冷消化过夜，次
日于电热板上加热，及时补加酸。当溶液变为清亮无
色并伴有白烟时，再继续加热至剩余体积 2mL左右。冷
却，再加 5mL 6mol/LHCl溶液，于电热板上加热赶酸至
约 2mL，消化液转移到 10mL比色管中，加纯水定容至
10mL，加入 1mL 100g/L铁氰化钾，2mL浓盐酸摇匀，
备测[ 6 ]。每种样品平行测定 6 份，同时做试剂空白。
1.4.2 无机硒与有机硒
准确称取样品 0.1～2.0g，加入 10mL的 3次蒸馏水，
沸水浴 30min，然后用超声波细胞粉碎机粉碎细胞壁(功
率 550 W，超声时间 4s，间隔时间 4s，超声 60 次)，
20℃条件 5000r/min离心 10min。残渣同上步骤再提取，
合并上清液，浓缩至 5mL左右，按 1.4.1节步骤消解，
所得消解液用于测定的硒即为无机硒含量。
将总硒减去无机硒作为有机硒的含量。
1.4.3 Se(Ⅳ)和 Se(Ⅵ)
将无机硒提取液浓缩消化后，不加入 6mol/L HCl溶
液还原，只加入 100g/L铁氰化钾溶液抗干扰剂所测出的
为四价硒，六价硒的含量为无机硒的含量减去四价硒的
含量。
1.4.4 蛋白质中的硒
准确称取样品 0.1～2.0g，加 pH8.6 Tris-HCl缓冲液
(质量分数 10%甘油、20.0mmol/L MgCl2·6H2O)10.0mL
混合，置于超声波细胞粉碎机，使细胞全部破碎。搅
拌提取 2次，以 4℃条件下 11000r/min离心 10min，上
清液合并；加入固体硫酸铵至饱和，静置 2h，以 15000r/
min离心 10min，收集沉淀；用 5mL的缓冲液溶解沉淀，
用截留相对分子质量为 7000的透析袋在蒸馏水中透析去
除硫酸铵，收集蛋白质溶液[4]，再按 1.4.1节步骤消解。
1.4.5 多糖中的硒
准确称取样品 0.1～2.0g，先用 95%乙醇溶液脱脂，
再加 10mL三次蒸馏水，80℃恒温加热 4h，离心(3000r/
min，20min收集上清液，沉淀再加水 10mL， 80℃恒温
加热 4h，抽提 2次，合并上清液。上清液浓缩至 5mL
左右，用 80%丙酮溶液脱色，再用 95%乙醇溶液沉淀，
离心，合并两次所得沉淀[7-8]，再按照 1.4.1节方法消化。
1.4.6 数据分析方法
数据分析主要利用 SAS 9.1，统计分析方法主要有
t 检验、t′检验或配对 t 检验。
2 结果与分析
2.1 测定条件的选择
以 10μg/L硒标准溶液的测定荧光强度为指标，考
察盐酸载流浓度、硼氢化钾质量浓度、原子化器高度 3
个因素对测定结果的影响。采用 L 9(3 4)进行正交试验，
结果表明质量分数 5%盐酸，10g/L硼氢化钾，原子化
高度 9mm为最佳测定条件。
2.2 微波消化与湿消化法的比较
分别采用微波和湿法消化对两种样品进行前处理，
测定结果表明两种消化方法无显著性差异(P=0.6900)。
微波消化可以避免挥发性元素的损失，且较少有污染发
生，但每次处理样品量较少，通常为 0.1～0.5g，对含
量较低的元素测定不适用。湿法消化是应用普遍的方
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法，其特点是单次处理样品数量较大，可达到 1 0 g以
上，基本能满足植物样品中微量元素测定的要求。考
虑到样品 2 含硒量比较低，称样量达到 2.0g左右，且
因富硒螺旋藻片在加工过程中加入了其他的辅料，介质
比较复杂，消化时有较多气泡产生，微波消化预处理
时间较长，故选用湿消化法。
2.3 关于藻体蛋白提取的方法比较
参考刘力闯[9]、郑江[10]、黄峙[4]等对于螺旋藻中蛋
白的提取，采用反复冷冻盐析法和超声波细胞粉碎法提
取藻体蛋白，利用所测得硒含量来对比两种方法。实
验结果表明冷冻盐析法所得硒含量仅为超声波细胞粉碎
法的 25%～30%，可见冷冻法的蛋白溶出率比超声波细
胞粉碎法的蛋白溶出率低得多，故选用超声波细胞粉碎
法提取富硒螺旋藻中蛋白。
2.4 富硒螺旋藻片中硒形态、价态及含量
螺旋藻是硒生物有机化的理想载体[3 ,11-12]。硒的生
物效应与其化学形态密切相关。硒在生物体内的存在形
态可分为有机态和无机态，无机硒毒性大，而有机硒
毒性小、生物利用率高。有机硒主要存在蛋白、多糖
和脂质中。无机硒有单质硒(Se 0)、4价硒(Se Ⅳ)及 6
价硒(Se Ⅵ)之分[3]。因此不同形态、价态的硒含量是评
价某一富硒产品营养价值的重要指标。
氢化物发生 - 原子荧光光谱法测硒具有灵敏度高、
干扰小、线性范围宽、所用试剂毒性小等优点，特别
在硒价态分析方面具有方便快捷的优势[13-15]。
硒形态、价态分析结果表明(表 1)，两种富硒螺旋
藻片硒含量有显著性差异(P＜ 0.0001)，样品 1总硒含量
是样品 2的 2000多倍，但都存在无机态和有机态的硒，
且以有机硒为主，占 60%左右，样品 1 中无机态的四
价硒和六价硒含量有显著性差异(P=0.0094)，但样品 2的
四价硒和六价硒含量无统计学差异(P=0.2269)。由此看
出，富硒螺旋藻片中硒的有机化程度较高，可较好地
被生物所吸收利用。
样品
有机硒 / 蛋白质含硒 多糖含硒 蛋白硒 多糖硒
(μg/g) 量 /(μg/g) 量 /(μg/g) 比例 /% 比例 /%
1 128.0 88.04 16.69 68.8 13.0
2 0.0675 0.0360 0.0057 53.7 8.44
表 2 蛋白质、多糖中的含硒量 (n=6)
Table 2 Protein-bound selenium and polysaccharide-bound selenium
contents in Se-enriched S.pirulina tablets (n=6)
2.5 有机硒在螺旋藻片中的分布
有机硒主要指以负 2 价态结合在蛋白质、脂、多
糖、核酸、氨基酸、多酚、甾类化合物等有机分子
特别是生物分子中的硒。由表 2可知，两种样品中蛋白
质和多糖含硒量均有显著性差异(P＜ 0.0001)，有机硒在
螺旋藻中的分布从大到小为蛋白质、多糖，且蛋白质
结合的硒占有机硒的比例超过 50 %，远高于多糖，说
明有机硒主要是以蛋白质结合的形式存在。
2.6 检测限和加标回收率
按照硒总量的测定方法，以 3次蒸馏水代替样品进
行 6份空白实验，根据空白值计算标准偏差(σ)，按 3σ
计算出方法检出限为 0.64ng/g，测量 10次样品得到相对
标准偏差 RSD为 5.7%。实验采用加标回收率的实验考
察测量方法的准确性(表 3)，其中样品 1的加标回收率为
95.6%～98.8%，样品 2的加标回收率为 93.0%～96.2%，
说明方法准确度较高。
样品 样品质量/g 样品中总硒含量/μg 硒加标量 /μg 测定硒含量 /μg 回收率 /%
0.1011 21.91 20.00 41.67 98.8
样品1 0.1056 22.88 20.00 42.00 95.6
0.1024 22.19 20.00 41.59 97.0
2.0010 0.2211 0.2000 0.4134 96.2
样品2 2.0017 0.2212 0.2000 0.4117 95.3
2.0015 0.2212 0.2000 0.4071 93.0
表 3 总硒加标回收实验
Table 3 Recovery rates for Se in Se-enriched S.pirulina tablets
3 结 论
采用原子荧光光谱法分析了富硒螺旋藻片中的硒形
态和价态，该方法操作简便、灵敏度高、检出限低、
线性范围宽，为研究富硒螺旋藻片中硒的营养效应提供
基础。结果表明，不同品牌的富硒螺旋藻片硒含量有
显著性差异(P＜ 0.0001)，但不同形态、价态的硒在螺
旋藻片中分布基本一致，并以有机硒为主，且主要是
以蛋白质结合的形式存在，硒的有机化程度较高。富
硒螺旋藻片作为一种硒营养强化食物，不同品牌硒含量
有较大差别，高达 2000多倍，这样人们就很难控制硒
摄入量，国家法规政策若能有针对性的控制硒含量在一
定的范围内，可以使富硒螺旋藻片品质得到优化，从
而提高此类产品的营养性和安全性。
参 考 文 献 ：
[1] 徐辉碧. 硒的化学、生物化学及其在生命科学中的应用[M]. 武汉:
华中理工大学出版社, 1994: 104-194.
样品
总硒 / 无机硒 /(μg/g) 有机硒 / 无机硒比例 /% 有机硒
(μg/g) Se Ⅳ Se Ⅵ (μg/g) Se Ⅳ Se Ⅵ 比例 /%
1 216.7 56.11 32.61 128.0 25.9 15.0 59.1
2 0.1105 0.01970 0.0238 0.0675 17.8 21.1 61.1
表 1 富硒螺旋藻片中硒形态、价态及含量 (n=6)
Table 1 Chemical states, valences and contents of Se in Se-enriched
S.pirulina tablets (n=6)
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[2] 徐芳, 邱德仁, 杨芃原, 等. 硒的化学与生物形态分析综述[J]. 光谱
学与光谱分析, 2002, (2): 331-340.
[3] 黄峙, 郑文杰, 向军俭, 等. 硒硫比值对钝顶螺旋藻有机化硒的影响
及藻体中硒的形态、价态构成[J]. 海洋科学, 2002, 26(5): 60-62.
[4] 黄峙, 向军俭, 郑文杰, 等. 钝顶螺旋藻富集转化硒及硒在藻体中的
分布[J]. 植物生理学通讯, 2001, 37(1): 12-14.
[5] 陈填烽, 崔小峰, 杨芳, 等. 分次加硒法培养高富硒量螺旋藻及其对
藻体光合色素和蛋白质含量影响的研究[J]. 食品与发酵工业, 2005,
31(8): 48-51.
[6] 北京市卫生防疫站、卫生部食品卫生监督所和中国预防医学科学
院营养与食品卫生研究所. GB/T 5009.93— 2003食品中硒的测定
[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003.
[7] 胡群宝, 郭宝江. 螺旋藻多糖和糖蛋白的提纯及其理化特性研究[J].
海洋科学, 2001, 25(7): 41-44.
[8] 周志刚, 李富朋, 刘志礼, 等. 三种螺旋藻及其蛋白质、多糖和脂
类结合硒的研究[J]. 海洋与湖沼, 1997, 28(4): 363-370.
[9] 刘立闯, 胡志和, 刘彤, 等. 螺旋藻蛋白提取方法比较研究[J]. 食品
科学, 2008, 29(11): 228-233.
[10] 郑江. 藻胆蛋白的提取纯化研究进展[J]. 食品科学, 2002, 23(11):
159-161.
[11] LI Zhiyong, GUO Siyuan, LI Lin. Bioeffects of selenite on the growth of
Spirulina platensis and its biotransformation[J]. Bioresource Technology,
2003, 89(2): 171-176.
[12] CASES J, WYSOCKA I A, CAPORICCIO B, et al. Assessment of
selenium bioavailability from high-selenium Spirulina subfractions in
selenium-deficient rats[J]. J Agric Food Chem, 2002, 50(13): 3867-
3873.
[13] 李连平, 范威, 黄志勇, 等. 蔬菜中硒总量及形态的氢化物发生 -原
子荧光光谱测定方法[J]. 光谱学与光谱分析, 2008, 28(12): 2975-
2978.
[14] 刁娟娟, 李莉, 阳胜, 等. 氢化物原子荧光法测定大蒜及其制品中的
硒[J]. 食品科学, 2009, 30(4): 166-168.
[15] 陈新, 柳闽生, 鲜华. 氢化物发生原子荧光光谱法测定紫甘薯中的
有机硒和无机硒[J].食品与发酵工业, 2010, 36(7): 163-165.