全 文 ：· 1214· Ch ina Pharmacy 2007 V ol.18 No.16 中国药房 2007年第 18卷第 16期
Δ国家自然科学基金资助项目(39800193)
*副主任药师,博士。研究方向:中药药理活性及其物质基础。电
话:027-83649095。 E-mail:fjg3560@sina.com
大青叶(Folium Isatidis)系十字花科植物菘蓝(I satis i ndi_
gotica Fort.)的干燥叶 ,具有清热解毒 、凉血消斑之功效 [1 ] 。研
究表明 , 大青叶具有抗病原微生物 、抗细菌内毒素 、抗炎 、解热
以及免疫调节等多重药理作用 , 而传统的清热解毒中药是一类
以全面调动机体抗感染修复能力为主的综合性治疗药物 。大青
叶则主要通过其有机酸 、生物碱 、氨基酸等化学成分多环节 、多
途径地作用于机体而发挥出协同效应 [ 2 ～4 ] , 尤其是邻氨基苯甲
酸等有机酸成分已被证明具有抗内毒素、抗炎 、抗氧化等与清热
解毒功效相符的活性 , 逐渐成为国内 、外学者关注的热点 [5 ～7 ] 。
因此 , 本文以邻氨基苯甲酸为指标 , 综合比较了 HPD100 、
NKA -9 、AB-8 、D101等 4种树脂对于有机酸组分的吸附性
能 , 遴选出适宜的乙醇洗脱溶液及洗脱体积 , 采用正交试验优
化影响树脂吸附的重要因素 , 确定大孔吸附树脂分离纯化大青
叶有机酸部位的工艺流程 , 为进一步研究其相关药理活性提供
必要前提 。
1 材料
1.1 药材
大青叶药材采自安徽亳州 , 经华中科技大学同济医学院生
于解释不合理的给予相应处罚 , 责成限期改正 , 并在医院医疗
质量通讯中通报 。
4 结语
ADR 的发生不仅极大地危害和影响了患者的身体健康与
生活质量 , 而且还造成患者治疗成本的增加 , 浪费了有限的卫
生资源 。通过在医院内部创办《快报》 ,可以提高国家《通报》在
医务人员中的知晓率及重视程度 , 有利于国家 ADR信息预警
作用的充分发挥 , 有利于使 ADR 监测工作从事后处理转为事
前预防 , 最大限度降低风险 , 对进一步完善我国 《通报》制度具
有重要意义 。
参考文献
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作之探讨[ J] .中国药房 , 2006 ,17(10):726.
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cn/adr repor t/adr.jsp?id=10305＆channel=第 10期.
2006.2006 ,7 , 10.
(收稿日期:2006-08-10 修回日期:2007-02-06)
·药物研究·
大孔吸附树脂分离纯化大青叶有机酸部位的实验研究 Δ
方建国 *,万 进 ,汤 杰 ,王文清 ,刘云海(华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部 ,武汉市 430030)
中图分类号 R284.2 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2007)16-1214-04
摘 要 目的:应用大孔吸附树脂分离纯化大青叶有机酸部位 。 方法:大青叶以 70%乙醇(pH=2)索氏提取 ,以邻氨基苯甲酸为
考察指标 ,优选最佳吸附树脂并采用正交试验优化影响树脂吸附的重要因素 ,确定其合理工艺流程 。结果:以 HPD100型树脂对大
青叶中有机酸组分的吸附与解吸性能较好 ,采用 3BV(树脂床体积)60%乙醇易于洗脱;正交试验结果表明以药液中邻氨基苯甲酸
浓度为 0.18mg ·mL -1 、pH 3.5及洗脱流速为 2BV ·h -1的参数组合应用效果良好 ,经济省时 。结论:应用 HPD100型大孔吸附树
脂分离纯化大青叶中有机酸活性部位 ,其综合性能良好 ,具有一定的药用前景。
关键词 大青叶;邻氨基苯甲酸;大孔吸附树脂;正交试验;分离纯化
Research on the Extraction and Purif ication of Organic Ac ids from Fol ium Isatidis with Macroporous
Adsorptive Resin
FANG Jianguo ,WAN Jin , TANG Jie ,WANG Wenqing , LIU Yunhai(Depart.o f Pharmacy , Tong ji Hospital
Aff iliated to the Tongji M edical College , Huazhong Universi ty o f Science and Technolog y , Wuhan 430030 ,
China)
ABSTRACT OBJECT IVE:To ex tract and pur ify o rganic acids w ith macroporous resins f rom Folium Isa tidis.M ETHODS:
Folium Isatidis w as ex trac ted w ith 70%aqueous et hano l(pH=2)by Soxhlet ex traction.The process w as optimized by em-
ploy ing orthogonal test design with t he content o f anthranilic acid as t he index.RESULTS:The resin H PD100 had much
be tte r adsorption capacity and desorption ra tio by using 3 BV 60%aqueous ethano l to ex t rac t organic acids in Folium Isatidis
than o ther resins.T he results show ed that HPD100 possessed the be tter ecomic under the concentration o f sample 0.18mg ·
mL
-1 , the condition of pH 3.5 , and flow ing rate of 2BV ·h -1.CONCLUSION :Macroporous resin HPD100 may be va lue o f
isolating and purify ing the organic acids from Folium Isatidis.
KEY WORDS Folium Isatidis;Anthranilic acids;Macroporous resin;Orthogonal design;E xtrac tion and purification
中国药房 2007年第 18卷第 16期 China Pharm acy 2007 Vol.18 N o.16 · 1215·
药教研室张长弓教授鉴定为十字花科植物菘蓝的干燥叶 。
1.2 试药
邻氨基苯甲酸(湘中地质实验研究所 ,批号:20020510 , 经
面积归一化法测定其纯度为 99.3%);甲醇为色谱纯 , 其余试
剂均为分析纯 。大孔吸附树脂:NKA-9型(天津市光复精细化
工研究所)、D101型(西安蓝深交换吸附材料有限责任公司)、
AB-8型(天津市南开大学化工厂)、HPD100型(河北沧州宝
恩化工有限公司)。
1.3 仪器
1100型高效液相色谱 (HPLC)仪 (美国惠普公司);
AUW -220D 型电子分析天平(日本岛津公司)。
2 方法与结果
2.1 大孔吸附树脂预处理流程
各树脂以 2BV(1BV 为 1个树脂床体积)4%NaOH 溶液
60℃浸泡 6h , 弃去碱液后上柱以蒸馏水快速洗至流出液呈中
性 , 以 2BV 乙醇浸泡 12h , 再以乙醇按 2BV ·h -1洗涤至流出
液加入 5倍体积蒸馏水不呈白色混浊为止 ,而后用蒸馏水以同
样流速洗至无醇 ,备用 。
2.2 上树脂用供试品溶液的制备
取大青叶药材 ,粉碎成粗粉 ,以 70%乙醇(pH 2)索氏提取
至浸出液呈无色 ,过滤 ,滤液浓缩至无醇 ,以蒸馏水制成相当于
原生药 1.0g ·mL -1的水溶液 ,备用 。
2.3 邻氨基苯甲酸的含量测定[ 8]
2.3.1 色谱条件 。色谱柱:Lichroso rb C18(250mm ×4.6mm ,
5μm);流动相 :甲醇 -水 -冰醋酸 (20∶78∶2);流速:
0.9mL ·m in -1;检测波长:250nm;柱温:30℃;进样体积:
10μL 。
2.3.2 对照品溶液的制备 。取邻氨基苯甲酸适量 ,准确称定 ,
以甲醇溶解制成浓度为 15μg ·mL -1的溶液 ,即得。
2.3.3 供试品溶液的制备 。取“2.2”项下溶液蒸干后的固体
适量 , 准确称定 , 置于索氏提取器中以 60mL乙醚提取 2h , 过
滤 ,滤液挥尽溶剂 ,残渣加适量甲醇溶解置于 10mL 容量瓶中 ,
定容 ,摇匀 ,过滤 ,取续滤液 ,即得 。
2.3.4 线性关系 。精密吸取浓度为 12.73 、 25.46 、 50.92 、
76.38 、101.84 、127.30μg ·mL -1的邻氨基苯甲酸对照品溶液
各 10μL ,注入液相色谱仪 ,测定峰面积 。以其峰面积(A)为纵
坐标 ,对照品溶液浓度(C)为横坐标 , 作线性回归 ,得回归方程
A =80.574C —1.698(r =0.999 8)。结果表明 , 邻氨基苯甲酸
检测浓度在 12.73 ～ 127.30μg ·mL -1范围内线性关系良好 。
2.4 树脂的静态吸附效果(树脂的筛选)
取 NKA-9 、D101 、AB-8 、HPD100等 4种树脂 , 去表面
水后各称取 2份 ,每份 5g ,分成 2组 。A 组各型号树脂加入浓度
为 1.35mg ·mL -1的邻氨基苯甲酸对照品溶液 150mL ;B组
各型号树脂加入浓度为 2.57mg ·mL -1的邻氨基苯甲酸对照
品溶液 80mL 。各组树脂混合溶液均放置 24h ,每隔 4h轻轻摇
匀 , 使树脂充分吸附后测定其静态吸附效果。将吸附后的树脂
过滤 ,A 组依次用 75mL 的 10%、60%乙醇解吸 1h 、过滤;B组
依次用 40mL 的 10%、60%乙醇解吸 1h 、过滤 ,以 HPLC法测
定以上各组滤液的浓度 ,并计算吸附率与解吸率:
吸附率=(供试品溶液中含量 —蒸馏水解吸量)/供试品溶
液中含量×100%
解吸率= [各乙醇洗脱液中解吸量/(供试品溶液中含量 —
蒸馏水解吸量)] ×100%
吸附效果详见表 1 、表 2。
由表 1 、表 2可见 ,吸附率均以 HPD100树脂最高;解吸率
方面虽其 10%乙醇的解吸率不及 D101等树脂 ,但其 60%乙醇
的解吸率最高 , 达 50%以上 , 有利于有效成分的富集 、纯化 , 故
选择 HPD100树脂进一步作动态吸附考察 。
2.5 HPD100型树脂的动态吸附效果
湿法装柱 , 柱床体积为 10mL , 将邻氨基苯甲酸对照品溶
液(2.57mg ·mL -1)上柱吸附 , 流速为 2BV ·h -1 , 共计吸附
10BV 上样溶液 , 每处理 1BV 收集 1次 , HPLC法测定各过柱
液中邻氨基苯甲酸的含量 ,其动态洗脱曲线详见图 1。
由图 1可见 , HPD100型树脂的泄漏点在第 3BV , 饱和吸
附点在第 8BV , 过柱泄漏点 、饱和吸附点时对应的洗脱液浓度
分别为 0.225 7 、2.554 8mg ·mL -1 ,经计算两点所对应的洗脱
液累积含量分别为 2.389 、 80.376mg , 而上样总量分别为
77.100 、 205.600mg , 因吸附量为上样总量与洗脱液累积含量
之差 ,则相应的邻氨基苯甲酸吸附量分别为 74.7 、125.2mg ;饱
和吸附点的吸附率可达 60.9%, 表明 HPD100型树脂具有良
好的动态吸附性能 。
2.6 HPD100型树脂洗脱液的选择
湿法装柱 , 柱床体积为 30mL , 以 2BV 大青叶供试品溶液
(1.0g ·mL -1 , 邻氨基苯甲酸浓度为 0.185mg ·mL -1)上柱吸
附 ,流速为 2BV ·h -1 ,然后以 1BV 蒸馏水快速淋洗 ,并依次以
2BV 10%、30%、60%、80%、95%乙醇以 2BV ·h -1速度洗脱 ,
收集各乙醇洗脱液 , 测定收得率 , HPLC法测定各洗脱液中邻
氨基苯甲酸的含量 ,计算解吸率 ,结果见表 3。
表 1 A组 4种大孔树脂对邻氨基苯甲酸的静态吸附效果
Tab 1 The results of stat ic absorption for anthranilic ac id
in 4 kinds of macroporous resins of group A
树脂型号
滤液浓度
/mg·
mL
- 1
吸附量
/mg
吸附率
/ %
10%乙醇洗脱
液浓度/mg·
mL
- 1
10%乙醇
洗脱液解
吸量/mg
10 %乙
醇解吸
率/%
60%乙醇洗脱
液浓度/mg·
mL
- 1
60%乙醇
洗脱液解
吸量/mg
60 %乙
醇解吸
率/%
NKA -9 0 .804 81.90 40.4 0.375 28 .13 34.3 0.363 27 .23 33.2
D101 0 .711 95.85 47.3 0.462 34 .65 36.2 0.550 41 .25 43.0
AB-8 0 .546 120.60 59.6 0.518 38 .85 32.2 0.791 59 .33 49.2
HPD100 0 .421 139.35 68.8 0.456 34 .20 24.5 1.125 84 .38 60.5
表 2 B组 4种大孔树脂对邻氨基苯甲酸的静态吸附效果
Tab 2 The results of stat ic absorption for anthranilic ac id
in 4 kinds of macroporous resins of group B
树脂型号
滤液浓度
/mg·
mL
- 1
吸附量
/mg
吸附率
/ %
10%乙醇洗脱
液浓度/mg·
mL
- 1
10%乙醇
洗脱液解
吸量/mg
10 %乙
醇解吸
率/%
60%乙醇洗脱
液浓度/mg·
mL
- 1
60%乙醇
洗脱液解
吸量/mg
60 %乙
醇解吸
率/%
NKA -9 1 .656 73.12 35.6 0.676 27 .04 37.0 0.703 28 .12 38.5
D101 1 .467 88.24 42.9 0.971 38 .84 44.0 1.108 44 .32 50.2
AB-8 1 .397 93.84 45.6 1.005 40 .20 42.8 1.011 40 .44 43.1
HPD100 1 .163 112.56 54.7 1.007 40 .28 35.8 1.417 56 .68 50.4
· 1216· Ch ina Pharmacy 2007 V ol.18 No.16 中国药房 2007年第 18卷第 16期
表 4 正交试验因素水平表
Tab 4 Factors and levels of orthogonal design
水平 A/mg ·mL- 1 B C/BV·h- 1
1 0.10 3.5 1
2 0.18 4.5 2
3 0.35 5.5 3
表 3 不同浓度乙醇对邻氨基苯甲酸的洗脱效果
Tab 3 Elution ef fec ts for anthranilic ac id in HPD100
macroporous resin by dif ferent concentration ethanol
乙醇浓度/% 收得率/% 解吸率/%
10 4 .1 2.2
30 3 .7 10.7
60 2 .4 40.1
80 2 .1 9.8
95 2 .9 5.8
表 5 正交试验结果
Tab 5 Results of orthogonal experiments
试验号 因素 y 1 y 2 y 1 +y 2
A B C
1 1 1 1 61.2 63 .8 188.8
2 1 2 2 56.7 59 .1 174.9
3 1 3 3 39.4 31 .5 102.4
4 2 1 2 56.6 58 .4 173.4
5 2 2 3 48.7 43 .6 135.9
6 2 3 1 35.2 39 .3 113.8
7 3 1 3 47.9 45 .5 138.9
8 3 2 1 45.2 42 .8 130.8
9 3 3 2 32.7 33 .5 99.7
Ⅰ 155.4 167.0 144 .5
Ⅱ 141.0 147.2 149 .3
Ⅲ 123.1 105.3 125 .7
R 32.3 61.7 23 .6
表 6 方差分析表
Tab 6 Analysis of variance
方差来源 自由度 离均差平方和 均方 F P
A 2 1 564.8 782.4 18.336 <0.05
B 2 5 960.0 2 980.0 69.836
C 2 931.6 465.8 10.916
误差 2 85.3 42.65
由表 3可见 , 60%乙醇对于邻氨基苯甲酸的解吸率最高;
其它浓度乙醇的总固体含量及收得率较高 ,而有效成分含量较
低 。结果表明 ,最佳洗脱溶剂为 60%乙醇 。
2.7 HPD100型树脂的解吸曲线
湿法装柱 , 柱床体积为 30mL , 以 2BV 大青叶供试品溶液
上柱吸附 ,流速为 2BV ·h -1 ,迅速以 1BV 蒸馏水快速淋洗 ,以
60%乙醇按 2BV ·h -1洗脱 , 每 0.5BV 收集 1次 , 共计 4BV ,
HPLC 法测定各溶液中邻氨基苯甲酸的含量 , 计算解吸率 , 并
以洗脱液体积对邻氨基苯甲酸总解吸率绘制解吸曲线 , 结果见
图 2。
图 2结果表明 , 采用 HPD100型树脂以 3BV 的 60%乙醇
溶液可将大青叶供试品溶液中以邻氨基苯甲酸为主的有机酸
组分基本洗脱完全 ,此时解吸率达 59.1%。
2.8 HPD100型树脂吸附的影响因素考察
供试品中邻氨基苯甲酸的浓度(A)及 pH 值(B)、吸附及
洗脱流速(C)均是影响树脂吸附效果的重要因素 [9 ] 。上述 3个
因素中各取 3个水平 , 选用 L 9(34)正交表进行试验 , 按上述装
柱方法 , 柱床体积为 30mL , 按表 4 、表 5安排的试验条件 , 以
2BV 大青叶供试品溶液按规定流速上柱吸附 , 迅速以 1BV 蒸
馏水快速淋洗 ,以 3BV 的 60%乙醇按规定流速洗脱 。以邻氨基
苯甲酸的吸附率 、解吸率为考察指标 , 采用综合评分法对正交
试验结果作直观分析和方差分析 , 判断各因素对树脂吸附效果
的影响程度。
根据吸附率(y 1 , %)和解吸率(y 2 , %)计算其综合评分 ,即:
综合评分=y 1+2y 2 。因素水平设计见表 4;正交试验结果见表
5;方差分析见表 6。
由表 5中极差 R值判断 , 各因素对于吸附率 、解吸率的综
合评分的影响程度大小次序为 B>A >C 。在给定的水平条件
下 ,各因素对综合评分的影响情况为 A 1>A 2>A 3 ,B1>B2>B3 ,
C2>C 1>C3。方差分析结果表明 ,B因素(pH 值)对于树脂吸附
效果的影响具有显著性差异(P <0.05)。通过直观分析 , 由试
验结果理论判断 ,最佳组合为 A 1B1C 2。从省时降耗及生产实际
出发 , 在保证充分吸附的前提下提高供试品溶液的浓度 , 故优
化提取工艺为 A 2B1C 2:即以 2BV 大青叶供试品溶液(邻氨基苯
甲酸浓度约为 0.18mg ·mL -1 , 并调节其 pH 3.5)按 2BV ·h -1
的速度上柱吸附 , 迅速以 1BV 蒸馏水快速淋洗 , 以 3BV 的
60%乙醇按 2BV ·h -1的速度洗脱 ,收集洗脱液 ,即得 。通过验
证试验 ,表明所优化的 HPD100型树脂分离纯化大青叶有机酸
部位的工艺参数稳定 、可行 。
3 讨论
本试验采用酸性乙醇提取大青叶药材 , 以邻氨基苯甲酸为
考察指标 , 对非极性的 HPD100 、D101 , 极性的 NKA -9和弱
极性的 AB-8等型号大孔树脂的吸附性能进行了考察 。结果
表明 , HPD100型树脂对大青叶中有机酸组分的吸附与解吸性
能较好 ,所得参数组合应用效果良好 ,经济省时 。由于大孔吸附
树脂的纯化效果受树脂结构 、吸附或洗脱条件 、待分离物质结
构等因素的制约 , 其纯化过程中存在有效成分的量及种类的变
化 , 故务必结合 HPLC 等定量分析手段以期考察有效部位化
学成分(群)的变化 ,从而科学指导工艺研究 。
由于大青叶药材中有机酸类成分已被证明具有与清热解
毒功效相符的活性 , 虽然以邻氨基苯甲酸作为研究对象不能全
面反映药材中总有机酸的含量及其分布特征 , 但也不失为中药
有效部位分离纯化研究过程中一条便捷的思路 , 有利于根据着
重点直接获取近似的研究结论 。在此基础上 , 可以进一步增加
研究指标或采用 HPLC 指纹图谱研究方法对其进行扩大化比
较研究 ,拓展本类研究的适用范围 。
参考文献
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Δ河南省自然科学基金资助项目(0411045100)
*讲师 , 硕士研究生。研究方向:心血管药理学。电话:0371-
62576841。E-mail:mxq1974@yahoo.com.cn
#通讯作者:教授 ,硕士研究生导师。研究方向:心血管药理学。电
话:0371-66658656。 E-mail:f rf@zzu.edu.cn
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(收稿日期:2006-07-17 修回日期:2006-10-18)
Ef fects of Prostaglandin E1 on Hypoxia/Reoxygenation Apoptosis and the Expression of bcl-2 and bax in
Cardiocytes of the Neonate Rats
MA Xiangqin(Dept.of Pharmaco logy , He nan Medical Colleg e for Staff and Workers , Zheng zhou 450003 ,
China)
FU Runfang , FENG Guoqing , WENG Shiai(Dept.of Pha rmacolo gy , College of Basic M edical Sciences ,
Zheng zhou University , Zhengzhou 450001 , China)
SONG Lijie(Dept.of Onco logy , The First Aff iliated Hospi tal o f Zheng zhou Universi ty , Zhengzhou 450052 ,
China)
ABSTRACT OBJECT IVE:To study the action mechanism of p rostag landin E 1(PGE1)in the inhibition o f hypox ia/reoxy-
genation apoptosis o f cardiomyocy tes in the cultu red neonat al rats.M ETHODS:The hypox ia/reoxygenation model w as m ade
wit h t he neonatal rat ca rdiomyocy tes cultured by ex vivo purification , w ith drugs adm inistered in PGE1(high , medium and low
dosages)groups during hypox ia/reoxygenation.Hypox ia/reoxygena tion apoptosis w as studied by electron microscope and in
situ end-labeling (ISEL).The expressions o f bcl-2 and bax w ere de tected by immunochem istry technique.RESULTS :In
PGE 1(high , medium and low dosages)groups compared w ith m odel g roup , the rate of apoptosis o f cardiom yocy tes decreased
significantly , the expression of bac-2 increased significantly w hile the expression o f bax decreased significantly (P <0.01).
CONCLUS ION :Hypox ia/reoxygenation injury m odel established by ex vivo pur ification culture o f cardiomyocy tes of neonatal
rats can induce cardiomyocy te apop tosis , w hile PGE1 can significantly inhibit the cardiomyocy te apoptosis , the mechanism s are
possibly due to the increasing o f the expression of bcl-2 and inhibition o f the expression o f bax.
KEY WORDS Prostag landin E1;Hypox ia/Reoxygenation;Neonate ra t;Cardiocy tes;Apoptosis;bcl-2;bax
前列腺素 E 1对缺氧复氧乳鼠心肌细胞凋亡及 bcl -2 、bax 蛋白表达的影响 Δ
马香芹 1* ,付润芳 2 # ,宋丽杰 3 ,冯国清 2 ,翁世艾 2(1.河南职工医学院药理学教研室 ,郑州市 450003;2.郑州
大学基础医学院药理学教研室 ,郑州市 450001;3.郑州大学第一附属医院肿瘤科 ,郑州市 450052)
中图分类号 R966;R977.6;R965.1 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2007)16-1217-03
摘 要 目的:探讨前列腺素 E1(PGE 1)抑制缺氧复氧乳鼠心肌细胞凋亡的作用机制 。方法:采用离体纯化培养的乳鼠心肌细胞建
立缺氧复氧损伤模型 , PGE 1高 、中 、低各剂量组在缺氧复氧期分别给药;各组采用电镜技术和原位末端标记技术检测心肌细胞的
凋亡情况 ,免疫组化技术检测 bcl-2 、bax 蛋白表达情况 。结果:与模型组比较 , PGE1组心肌细胞的凋亡率显著降低 ,bcl-2蛋白表
达明显上调而 bax 蛋白表达明显下调(P <0.01)。结论:离体培养的乳鼠心肌细胞建立的缺氧复氧损伤模型可诱导心肌细胞的凋
亡 ,而 PGE1可明显抑制这种凋亡的发生 ,其机制可能与促进 bcl-2蛋白表达、抑制 bax 蛋白表达有关。
关键词 前列腺素 E1;缺氧复氧;乳鼠;心肌细胞;凋亡;bcl-2;bax