全 文 ：收稿日期:2009-11-30; 修订日期:2010-04-02
基金项目:广西壮族自治区科学研究与技术开发计划项目(No． 0322024-5E)
作者简介:张志伟(1981-) ，男(汉族) ，河北保定人，现为广西中医学院附
属瑞康医院分子生物学实验室研究实习员，硕士学位，主要从事生化药理
学研究工作．
* 通讯作者简介:黄仁彬(1955-) ，男(汉族) ，广西灵山人，现任广西医科
大学药学院教授，博士研究生导师，主要从事生化药理学工作．
六月青石油醚萃取物体外对胃癌细胞
SGC － 7901 凋亡的影响及其作用机制研究
张志伟1，2，黄仁彬1* ，王乃平3
(1． 广西医科大学，广西 南宁 530000;
2． 广西中医学院附属瑞康医院，广西 南宁 530011; 3． 广西中医学院，广西 南宁 530001)
摘要:目的 研究六月青石油醚萃取物(petroleum ether extract of LYQ，LYQPE)对人胃腺癌 SGC － 7901 细胞凋亡的影响及
其部分作用机制。方法 用不同浓度的 LYQPE作用于 SGC － 7901，作用 48 h后，流式细胞术检测对细胞凋亡及其凋亡相
关蛋白 p53 影响;RT － PCR检测凋亡相关基因 p53 mRNA和黏附基因 CD44 mRNA的变化;电镜观察超微结构变化。结
果 LYQPE体外作用于 SGC － 7901，在 40 ～ 320 μg /ml时呈不同程度的促进凋亡;呈剂量依赖性的抑制 p53 蛋白、mRNA
水平和 CD44 mRNA水平的表达;在 160μg /ml时，电镜观察可见典型的凋亡形态学改变。结论 LYQPE对 SGC － 7901 有
明显促凋亡作用;LYQPE抑制 SGC － 7901 p53 蛋白、mRNA水平和 CD44 mRNA 水平的表达有可能是促进 SGC － 7901 凋
亡的作用机制。
关键词:六月青石油醚萃取物; SGC － 7901; 流式细胞术; 细胞凋亡; RT － PCR; 电镜
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2010． 10． 069
中图分类号:R962 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2010)10-2574-03
胃癌是我国最常见的肿瘤之一，其死亡人数在我国居恶性
肿瘤的首位［1］。手术对早期胃癌有较好的疗效，但对中晚期的
胃癌疗效欠佳。因此寻找疗效好、副作用小的治疗方法仍是目前
肿瘤研究的焦点之一。六月青系爵床科植物肖鸡笼的干燥地上
部分，是一种广西民间草药。《本草拾遗》记载，其能活血、凉血、
舒肝泻湿、消肿止痛，主要用于急慢性肝炎、黄疸等［2］。中医学
理论中肝克脾，胃为脾之腑，胃与脾相表里，说明肝与胃是有中医
理论功能联系的。前期实验对六月青各化学部位进行了初步筛
选，结果表明六月青石油醚部位体外对胃腺癌细胞系 SGC － 7901
和 MKN －45 有明显的抑制作用。关于六月青的研究资料报道
中，石油醚部位能显著增加小鼠胸腺重量和小鼠血清溶菌酶的含
量［3］，表明六月青石油醚萃取物有一定的增强免疫作用。本实
验室用醇提石油醚萃取的方法得 LYQPE，经初步的实验，有较好
的抗瘤效果，且未发现明显的毒副作用。本实验旨在研究六月青
石油醚萃取物对人胃腺癌 SGC － 7901 细胞凋亡的影响及其部分
作用机制。
1 材料与仪器
1． 1 细胞 SGC － 7901 胃癌细胞株由第四军医大学试验动物中
心提供，由本实验室自行传代培养。细胞常规培养于含 10%新
生牛血清的 RPMI － 1640 培养液中，在 37℃ 5% CO2 及饱和湿度
下培养，隔天换液，待细胞生长 80% ～ 90%密度时，用 0． 25%胰
蛋白酶消化，按 1∶ 2 比例传代。
1． 2 药物 六月青，采于广西灵山县，经广西中医药研究所鉴定，
其地上部分粗粉用 85%乙醇回流提取，过滤得滤液经旋转蒸发
回收乙醇，浓缩液用溶剂石油醚萃取，萃取液经旋转蒸发回收石
油醚后收集，恒温箱烘干得 LYQPE 备用;5 － FU，上海旭东海普
药厂，批号:061006;LYQPE 用含 10% DMSO 的 RPMI － 1640 溶
液配制成浓度分别为 6． 4，3． 2，1． 6，0． 8 mg /ml的溶液各 5 ml，备
用。5 － FU作为阳性药用含 10% DMSO 的 RPMI － 1640 溶液配
制成 2 mg /ml的溶液 5 ml，备用。
1． 3 试剂 Annex V 凋亡试剂盒，Biovision 公司;p53 检测试剂
盒，BD Bioscience 公司;RPMI － 1640 培养液，购自美国 Gibco 公
司;PBS，美国 Gibco 公司;胰蛋白酶，美国 Amersco 公司;Trizol，
美国 Invitrigen 公司;First strand cDNA synthesis kit，美国 MBI;
DEPC美国 Sigma公司;2 × PCR TaqMix，Takara公司;PCR扩增引
物，北京三博远志公司;戊二醛，美国 Sigma公司。
1． 4 仪器 PTC 200 多通道 PCR 扩增仪，美国 MJ 公司生产;Ep-
ics XL流式细胞仪，美国 Beckmon － Coulter公司生产。
2 方法
2． 1 细胞凋亡的流式细胞术检测 取对数生长期 SGC － 7901
1 × 105培养于 50 ml培养瓶中 24 h，LYQPE 设终浓度分别为 40，
80，160，320 μg /ml，5 － FU 100 μg /ml 和空白对照组。共同培养
48h，0． 25%胰酶消化，PBS 冲洗 2 次，用 100 μl 含钙离子 buffer
重悬，加 5 μl Annex V － FITC染料染色 20 ～ 30 min，加 5 μl PI燃
料染色 5 min，加入适量含钙离子 buffer 调整细胞浓度到 1 × 105
个 /ml左右，上流式细胞仪检测。激发波长为 488 nm，发射波长
530 nm。
2． 2 流式细胞仪检测 p53 蛋白 取对数生长期 SGC － 7901 细胞
1 × 105 培养于 50 ml培养瓶中 24 h，LYQPE 设终浓度分别为 40，
80，160，320 μg /ml，5 － FU 100 μg /ml 和空白对照组。共同培养
48 h，0． 25%胰酶消化，PBS冲洗 2 次，加入 1%多聚甲醛 100μl固
定 15 min，3 ml PBS洗 1 次，加入 0． 1% saponin 100 μl破膜 5 ～ 10
min，分成两管，分别加入 10 μl IgG － FITC和 p53 － FITC，染色 15
min，3 ml PBS 洗 1 次，加入 0． 5 ～ 1． 0ml PBS 上机检测。激发波
长为 488 nm，发射波长 530 nm。
2． 3 p53 和 CD44RT － PCR检测 取对数生长期 SGC － 7901 细胞
1 × 105 培养于 50 ml培养瓶中 24 h，LYQPE 设终浓度分别为 40，
80，160，320 μg /ml，5 － FU 100 μg /ml 和空白对照组。共同培养
48 h，细胞总 RNA的提取参照 Trizol试剂盒说明书进行。逆转录
反应后，加入下列引物进行 PCR扩增:p53(117 bp)上游 5＇－ TTT-
GGGTCTTTGAACCCTTG － 3＇，下游 5＇－ CCACAACAAAACACCAGT-
GC － 3＇;CD44(134 bp)上游 5＇－ CCAGCTAAGGACATTTCC CA － 3
＇，下游 5＇－ ACTAGTACACCCCAACCCCC － 3＇;同时以 GAPDH (452
bp)上游 5＇－ ACCACAG TCCATGCCATCACT － 3＇，下游 5＇－ TCCAC-
CACCCTGTTGCTGTA － 3＇作为反应内参照．扩增产物经2． 0%琼脂
糖凝胶电泳分离，凝胶图像分析仪检测 p53 和 CD44 与 GAPDH
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扩增片段灰度的比值。
2． 4 超微结构的电镜观察 取对数生长期 SGC － 7901 细胞 1 ×
105 培养于 50 ml 培养瓶中 24 h，LYQPE 设终浓度为 160 μg /ml
和空白对照组。共同培养 48 h，0． 25%胰酶消化，离心，2%戊二
醛固定，送电镜室制备标本，照相。
2． 5 统计学处理 采用 SPSS13． 0 统计软件，量的数据均以 珋x ± s
表示，比较采用 t检验，率的比较采用卡方检验。
3 结果
3． 1 LYQPE对 SGC － 7901 细胞凋亡的影响 与对照组相比，40
～320 μg /ml LYQPE不同程度的促进 SGC － 7901 凋亡，但有一个
明显的规律是随着 LYQPE 计量的增加，正常细胞的比例逐渐下
降，在 80 μg /ml LYQPE以促进 SGC － 7901 凋亡为主(28． 2%) ，在
320 μg /ml LYQPE以促进 SGC －7901坏死为主(24． 6%)。结果见
表 1。
表 1 LYQPE作用 48h，流式细胞术检测 SGC － 7901 坏死、
正常和凋亡细胞比例变化
组别 剂量 C /μg·ml － 1
细胞状态(%)
－ 死亡 正常 凋亡
空白对照 － 7． 15 10． 06 75． 4 6． 87
5 － FU 100＊＊ 8． 31 55． 2 17 19． 7
LYQPE 40＊＊ 3． 52 11． 4 66． 4 18． 7
LYQPE 80＊＊ 1． 68 6． 34 63． 7 28． 2
LYQPE 160＊＊ 10． 2 22． 4 53． 2 14． 2
LYQPE 320＊＊ 15． 5 24． 6 50． 9 8． 96
与空白对照组比较，＊＊P ＜0． 01
3． 2 LYQPE对 SGC － 7901 p53 的影响
3． 2． 1 p53 蛋白表达的流式细胞术检测 与空白对照组
(55． 4%)相比，40 ～ 320 μg /ml LYQPE呈剂量依赖性地抑制 SGC
－ 7901 的 p53 蛋白表达，随着剂量增加，p53 蛋白阳性表达细胞
分别为:23． 40% ＊＊，17． 70% ＊＊，12． 80% ＊＊和 8． 81% ＊＊(＊＊ P
＜ 0． 01)。结果见图 1。
图 1 LYQPE作用 48 h对 SGC － 7901 p53 蛋白表达的影响
3． 2． 2 p53 mRNA表达的 RT － PCR检测 p53 与 GAPDH mRNA
的比值(珋x ± s，n = 3) ，与空白对照组(0． 767 ± 0． 028)相比，40 ～
320 μg /ml LYQPE呈剂量依赖性地抑制 SGC － 7901 的 p53 mR-
NA表达，随着剂量增加，p53 mRNA相对表达量分别为:0． 657 ±
0． 022、0． 645 ± 0． 016＊＊、0． 571 ± 0． 026＊＊和 0． 555 0． 021＊＊(＊＊
P ＜ 0． 01) ，结果见图 2。
3． 3 CD44 mRNA 表达的 RT － PCR 检测 CD44 与 GAPDH mR-
NA的比值(珋x ± s，n = 3) ，与空白对照组(0． 417 ± 0． 029)相比，40
～ 320 μg /ml LYQPE 呈剂量依赖性地抑制 SGC － 7901 的 CD44
mRNA表达，随着剂量增加，CD44 mRNA 相对表达量分别为:
0． 430 ± 0． 019，0． 342 ± 0． 019* ，0． 253 ± 0． 018＊＊和 0． 152 ±
0． 022＊＊(＊＊P ＜ 0． 01)。结果见图 3。
3． 4 SGC － 7901 超微结构变化的电镜观察 A1、A2 和 A3 为正
常 SGC － 7901 细胞，可见细胞膜、核膜完整，胞核大，核质均匀，
核仁明显，细胞微绒毛，即指状突起，胞浆核糖体丰富。A4、A5 和
A6 为 LYQPE作用后的 SGC － 7901，可见胞质内大量空泡，胞核
变形，核碎裂，胞核消失，全胞深染，细胞器消失。结果见图 4。
M:marker;P:5 － FU 100 μg /ml;
C:空白对照组;L、I、H和 VH:
依次为 LYQPE 40，80，160 和 320 μg /ml
图 2 LYQPE作用 48h，RT － PCR检测 SGC － 7901
p53 的 mRNA表达量的变化
M:marker;P:5 － FU 100μg /ml;C:空白对照组;L、I、H和
VH:依次为 LYQPE 40、80、160 和 320 μg /ml
图 3 LYQPE作用 48 h，RT － PCR检测
SGC － 7901 CD44 的 mRNA表达量的变化
A1 ～ A3:为正常 SGC － 7 － 901 细胞，
A4 ～ A6:为 ZYQPE作用后 SGC － 7 － 901 细胞
图 4 LYQPE作用 48 h，透射电镜观察，SGC － 7 － 901 超微结构变化
4 讨论
胃癌的发病率高并且难治，目前以手术、放疗和化疗为主要
治疗手段。研究证实胃癌患者在接受放化疗手术后，如能给予药
物辅助治疗将对改善患者生活质量和提高生存率具有重要意
义［4］。
从中药中寻找抗肿瘤有效成分具有广阔的前景，已经引起国
内外许多学者的关注。六月青在广西分布广泛，一些初步的试验
证实其有一定的抗肿瘤活性，本实验室前期动物试验结果表明
LYQPE能抑制 S180荷瘤小鼠移植性肿瘤，本研究中所选胃癌细
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胞，SGC － 7901 是常用于研究的中分化胃癌细胞株。
细胞凋亡(apoptosis)或称程序性细胞死亡(programmed cell
death，PCD) ，即有核细胞在一定条件下启动自身的内部机制使
得内源性 DNA内切酶激活而引起的细胞死亡过程，即受基因、信
使调控的单个细胞自杀过程［5］。凋亡早期形态学改变为:① 细
胞皱缩胞浆凝缩，细胞器互相靠近。② 核的致密化是凋亡细胞
最重要的形态特点，此时见到核染色质浓聚、固缩，沿着核膜排
列，形成不同的形状(如新月状或环状)聚集在核膜周边，然后染
色质逐步分裂成碎片。③ 细胞器浓缩，细胞膜下陷，包裹核碎片
和细胞器，形成凋亡小体［6］。随肿瘤分子生物学研究的深入，人
们已发现愈来愈多的化疗药物可引起肿瘤细胞凋亡［7，8］，诱导凋
亡将是筛选抗肿瘤药物的重要研究方向，也是评价药物疗效的可
靠指标。磷脂酰丝氨酸外翻分析法(Annexin V － PI)［9］将 Annex-
in V与 PI匹配使用，可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分
开来。本实验利用磷脂酰丝氨酸外翻分析法所得结果显示，
LYQPE能明显促进 SGC － 7901 凋亡，在大剂量主要是导致 SGC
－ 7901 直接坏死。
p53 基因是影响凋亡过程［10］的重要分子事件，正常存在于
细胞内的 p53 基因为野生型，诱导细胞凋亡与其 DNA结合功能
及基因调控功能有关，对肿瘤细胞增殖起抑制作用［11］。野生型
p53 在细胞生长过程中，以一种“分子警察”(molecular police)的
身份监控细胞内 DNA 状态，p53 基因产物参与 G1 － S 和 G2 － M
检查点而对细胞周期调控，如果细胞 DNA 受损，p53 表达增加可
诱发细胞周期停止，以利 DNA 修复，而一旦修复失败，p53 蛋白
可持续增高，野生型 p53 蛋白产物可作为凋亡的强诱导物诱导受
损细胞和瘤细胞的凋亡而抑制肿瘤的发生和生长。p53 缺乏时，
Bcl － 2 蛋白增高，Bax蛋白表达降低，可使细胞凋亡明显受抑，导
致突变细胞扩展。而当 p53 基因发生突变时，突变型 p53 能与野
生型 p53 亚单位结合形成寡聚体干扰其功能，可致细胞过度增
殖，失去其正常的抑癌功能，细胞凋亡受抑。Hiao等［12］用免疫组
化 CM － 1 单抗发现 60%的胃癌中有 p53 基因的表达异常。因
此，可通过诱导野生型 p53 表达或抑制突变型 p53 表达来促进肿
瘤细胞凋亡［13］。SGC － 7901 为 p53 突变型胃癌细胞株［14］，本实
验结果显示，LYQPE 能够在蛋白和 mRNA 水平抑制突变型 p53
的表达，从而体细胞进入正常的凋亡途径。
CD44 是一种分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，属于表
面黏附因子，CD44 的高水平表达与肿瘤的转移和浸润密切相关
已被大多数研究所证实［15 ～ 18］。CD44 基因的外显子按剪接方式
的不同分为标准(CD44s)及变异型(CD44v) ，而变异型按外显子
拼接类型不同又分为许多亚型，其拼接变异体主要表达在上皮源
型细胞和肿瘤组织中［19］。变异型 CD44 作为一种透明质酸的受
体，分子的 NH2 末端功能区能链接细胞外间质受基底膜的透明
质酸盐调节细胞的运动和形态，同时“锚”定在宿主细胞外间质
及基底膜上，CD44v6 阳性细胞更易与毛细血管后小静脉中的高
柱状内皮细胞结合，使肿瘤细胞更易进入淋巴系统和循环系统，
同时透明质酸降解产物还能启动血管的发生，为侵袭转移奠定基
础 CD44v6 分子在人类胃癌组织中的阳性表达率为 64% ～ 77%，
其阳性表达与胃癌的进展程度有关［20］。孙喜文等［21］发现，胃癌
原发灶 CD44v6 阳性表达率为 62%。周世庆等［22］发现，人胃癌
细胞株 SGC － 7901 细胞中 CD44v6 阳性表达率为 69． 4%，与国内
外报道基本一致。本试验结果显示，LYQPE 能够降低 SGC －
7901 的 CD44 mRNA水平的表达使其蛋白表达减少，从而使细胞
脱壁、漂浮、停止生长，进而导致其凋亡，死亡。
细胞凋亡时超微结构呈现典型改变，如胞质的固缩，染色质
浓缩成半月形或帽状附于核膜，核的碎裂和凋亡小体形成等，这
些特征为透射电子显微镜下判定细胞凋亡提供了最直观、最可靠
的依据。我们的电镜结果从细胞超微结构水平验证了 LYQPE对
SGC － 7901 的抑制作用和促凋亡作用。
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