全 文 ：收稿日期:2009-12-19;　修订日期:2010-04-25
基金项目:大理学院青年科学基金项目(No.2006X28)
作者简介:熊　伟(1982-),男(汉族),湖南株洲人 ,现任大理学院基础医
学院讲师 ,在读博士研究生 ,硕士学位 ,主要从事糖蛋白生化的研究工作.
＊通讯作者简介:左绍远(1960-), 男(白族),云南大理人 , 现任大理学院
基础医学院教授 ,硕士学位 ,主要从事螺旋藻多糖的研究工作.
云南天然钝顶螺旋藻片多糖提取工艺的
正交实验优化与脱色脱蛋白方法研究
熊　伟1 , 2 ,谭德勇 2 ,陈贵元 1 ,左绍远1＊
(1.大理学院基础医学院 ,云南 大理　671000;　2.云南大学生命科学院 ,云南 昆明　651000)
摘要:目的 研究云南钝顶螺旋藻片中多糖的提取与纯化工艺 , 并筛选出云南钝顶螺旋藻多糖脱色 、脱蛋白的最佳方法。
方法 正交实验设计优选出提取云南钝顶螺旋藻片中多糖的方法 ,以提取多糖物质多糖损失率 、蛋白质去除率为测定指
标 , 分别考察不同实验方法对多糖脱蛋白 、脱色的影响。 结果 云南钝顶螺旋藻片多糖的最佳提取工艺为:水提温度为
80℃,水提时间 2 h,固液比 1∶15, 在此条件下多糖提取率为 2.18%,水提温度和固液比是影响多糖得率的主要因素。三
氯乙酸脱蛋白法为云南钝顶螺旋藻片多糖脱蛋白的最佳方法 ,活性炭脱色法对云南钝顶螺旋藻多糖片的脱色效果优于
过氧化氢脱色法。结论 云南钝顶螺旋藻片粗多糖的纯化 , 脱色与脱蛋白方法的优化为进一步研究云南钝顶螺旋藻片的
生物活性提供了基础。
关键词:正交实验设计;　钝顶螺旋藻片;　多糖;　脱色;　脱蛋白
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.11.100
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)11-2925-02
　　钝顶螺旋藻 Spirulinaplatensisl, 简称 SP, 是蓝藻门 、蓝藻纲 、
断增藻目 、颤藻科中的螺旋藻属低等水生植物。 SP是种微藻 ,
体长约 200 ～ 500 μm, 宽仅为 5 ～ 10 μm, 因藻体呈螺旋状而得
名。在 SP的各种生物活性物质中 , 螺旋藻多糖(简称 PSP)由于
具有广泛而复杂的生物学活性而成为目前 SP研究的热点之
一 [ 1] 。
“复方螺旋藻片(原名 “云南天然钝顶螺旋藻片 ”)”是云南
大理学院研制的新型功能性保健食品 [ 2] , 已获国家发明专利(专
利号:ZL96107910.X)。研究表明 , 该保健品具有降低血糖 [ 3] 、调
节血脂 [ 4] 、增强机体免疫力 [ 5]等多种作用。多糖是该制剂的主
要活性成分之一。为进一步探讨 “复方螺旋藻片”的作用机制 ,
本实验以该保健品为原料 ,采用正交实验设计对其多糖进行了初
步分离纯化并进行含量测定。目前 , 植物多糖的提取通常采取水
提醇沉 [ 6]的方法 , 得到的多糖产品纯度较低 , 主要杂质有色素 、
蛋白质和一些小分子的物质。色素的存在不仅影响多糖的色泽 ,
同时也影响 “复方螺旋藻片”多糖的纯度 , 从而影响其生物活性 ,
阻碍了对多糖的组成及结构与其生物活性关系的理论研究。为
此本实验对该制剂中多糖的提取 、除杂 、脱色等工艺进行研究 ,并
且对不同脱色和脱蛋白方法的效果进行比较和筛选 ,使粗多糖得
到精制 , 为进一步研究该保健食品的作用机制提供实验研究基
础。
1　材料与仪器
1.1　药品与试剂 复方螺旋藻片(原名云南天然钝顶螺旋藻片)
产品 , 片剂 ,瓶装(0.4 g/片 ×50片 /瓶), 云南白药集团大理制药
厂生产 , 批号:20081025。由大理学院左绍远教授提供 。
SephadexG-100凝胶 ,北京慧易得科技有限公司生产;葡萄
糖对照品 、牛血清白蛋白为国药集团化学试剂有限公司进口分
装;考马斯亮蓝 G-250为北京鼎国生物技术有限公司进口分
装;其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2　仪器 B600型低速自动平衡离心机(上海医用分析仪器
厂);SH-2型磁力搅拌器(北京洪博达科技有限公司);BT-
224S型电子分析天平(德国赛多利斯仪器公司);SHZ-3循环水
多用真空泵(上海青浦沪西仪器厂);RE-52A型旋转蒸发仪(上
海亚东生化仪器厂);FD-1型冷冻干燥机(北京博医康技术有
限公司);UV2550型紫外分光光度计(日本岛津苏州仪器有限公
司)。
2　方法
2.1　云南钝顶螺旋藻粗多糖的提取 用电子分析天平称取 50g
云南钝顶螺旋藻片剂 , 经研钵充分研磨成细小颗粒状 , 加入 5倍
体积的 95%乙醇加热(70℃)回流 3次 , 2 h/次 , 去除脂类和其它
醇溶性物质 , 倾出上层液。药渣于 50℃烘箱烘干 , 15倍水量
70℃回流提取 2次 , 每次 1 h, 过滤 , 滤液离心(2 000 r/min, 10
min), 上清液浓缩 ,无水乙醇调含醇量终浓度为 80%, 4℃静置过
夜 , 离心(3 000 r/min, 20 min)后沉淀依次用无水乙醇 、丙酮 、乙
醚反复清洗数次 ,抽滤后冷冻干燥 , 得云南钝顶螺旋藻粗多糖。
2.2　云南钝顶螺旋藻多糖的纯化 云南钝顶螺旋藻粗多糖加水
溶解至 100 ml,加入活性炭 , 40℃下脱色 15 min, 滤除活性炭 , 室
温下加入 1倍量体积的三氯乙酸 , 强烈振荡 30 min, 静置过夜 ,
2 000 r/min离心 10 min, 取上层水相 , 上清液用 NaOH调 pH=
7.0,对水透析后减压浓缩至 100 ml, 重复上述过程 3次得浓缩
液 , 无水乙醇调含醇量为 80%, 4℃静置过夜 ,离心后沉淀依次用
无水乙醇 、丙酮 、乙醚反复清洗数次 , 抽滤后冷冻干燥 , 得除蛋白
精制多糖。低温烘干得多糖粉末 ,加水溶解至 10 ml, 经 Sephade-
xG-100凝胶柱分离 ,蒸馏水洗脱 , 采用蒽酮 -浓硫酸法定性 , 分
段收集洗脱液 , 乙醇沉淀 , 干燥后得纯化后的云南钝顶螺旋藻多
糖。
2.3　云南钝顶螺旋藻粗多糖的脱色方法
2.3.1　过氧化氢脱色 取经脱蛋白多糖溶液(0.5 mg/ml), 以氨
水调至 pH=9.0,分别加入 30%过氧化氢适量 , 使其溶液中的终
浓度分别为 0.5%, 1%, 1.5%, 40℃保温 15 min。
2.3.2　活性炭脱色 活性炭经重蒸水清洗过滤 , 干燥(120℃,
8h)冷冻备用。取经脱蛋白多糖溶液(0.5 mg/ml), 分别加入
0.5%、1%、1.5%的活性炭 , 40℃保温 15min。
2.4　云南钝顶螺旋藻粗多糖脱蛋白的方法 水提醇沉法得到的
粗多糖含有一定量的蛋白质 ,本实验以蛋白质去除率及多糖损失
率为指标比较三氯乙酸 -正丁醇法 、三氯乙酸法和 Sveage法 3
种脱蛋白方法。
蛋白脱除率(%)=[ (脱蛋白前蛋白质量 -脱蛋白后蛋白质
量)/脱蛋白前蛋白质量 ] ×100%
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多糖损失率(%)=[ (脱蛋白前多糖质量 -脱蛋白后多糖质量)/
脱蛋白前多糖质量 ] ×100%
2.4.1　三氯乙酸 -Sevage法 取粗多糖溶液(015 mg/ml)50
ml, 加入多糖溶液体积 1倍量 10%三氯乙酸和 1 /5体积的
Sevage试剂(氯仿∶正丁醇 = 4∶1),搅拌 1h, 4 000r/min离心
10 min, 分出上清液 ,测定蛋白质和多糖含量。
2.4.2　三氯乙酸法 取粗多糖溶液(0.5 mg/ml)50 ml, 加入 1倍
量的 20%三氯乙酸 , 搅拌 30 min, 静置过夜 , 4 000r/min离心 10
min,分出上清液 , 加 1 mol/LNaOH调 pH至 7.0, 乙醇沉淀后测
定其蛋白质和多糖含量。
2.4.3　Sevage法 取粗多糖溶液(0.5 mg/ml)50 ml, 加入 1/4体
积的 Sevage试剂(氯仿:正丁醇 =4∶1), 搅拌 1.5h,倒入分液漏
斗中静置 1.5 h, 分出水层 ,测定蛋白质和多糖含量。
2.5　多糖及蛋白质含量测定方法 多糖含量采用蒽酮 -浓硫酸
法 [ 7] , 以葡萄糖为标准品绘制标准曲线。
蛋白质含量采用考马斯亮蓝法 [ 8] , 以牛血清白蛋白为标准品绘
制标准曲线。
钝顶螺旋藻粗多糖提取率(%)=[粗多糖质量(g)/原料质量
(g)] ×100%
3　结果
3.1　云南钝顶螺旋藻多糖提取的工艺 根据单因素初步实验 ,影
响云南钝顶螺旋藻多糖提取率的主要因素有水提温度 、水提时
间 、固液比 , 为综合分析各因素的影响 ,按 3因素 3水平表采用
L9(34)正交实验设计 ,各因素水平(见表 1)每个实验重复 3次 ,
确定最佳提取工艺 , 对正交实验所得的最佳提取工艺进行验证性
实验。
表 1　因素水平表
水平 A水提温度 /℃
B
水提时间 t/h
C
固液比
1 60 0.5 1∶15
2 70 1 1∶20
3 80 2 1∶25
由表 2可知 , 影响云南钝顶螺旋藻多糖提取率的各因素排列
为水提温度(A)>水提时间(B)>固液比(C), 水提温度对云南
钝顶螺旋藻多糖提取率的影响达到显著水平。 根据正交实验的
观点 , 只选取有显著性意义因素的最好水平搭配 , 确定出最佳方
案。而对于不显著性的因素 , 原则上可以由实际条件酌情处理。
综合各因素 K值和极差方差分析比较 , 得出云南钝顶螺旋藻多
糖的最佳工艺为:水提温度 80℃,水提时间 2 h,固液比 1∶15,此
工艺条件下云南钝顶螺旋藻多糖的提取率为 2.18%, 多糖含量
为 13.65%。
表 2　正交实验设计结果
实验号 A B C 粗多糖提取率(%)多糖含量(%)
1 60 0.5 1∶ 15 1.30 12.88
2 60 1 1∶ 20 1.36 13.12
3 60 2 1∶ 25 1.51 12.11
4 70 1 1∶ 15 1.57 11.52
5 70 2 1∶ 20 1.70 13.45
6 70 0.5 1∶ 25 1.42 12.13
7 80 2 1∶ 15 2.18 13.65
8 80 0.5 1∶ 20 1.58 12.46
9 80 1 1∶ 25 1.69 11.78
k1 1.47 1.74 1.53k2 1.67 1.65 1.64k3 1.88 1.64 1.86极差 R 0.39 0.10 0.33
方差 0.11 0.01 0.08
　　n=3
3.2　云南钝顶螺旋藻多糖脱色方法的比较 脱色后的溶液于
200 ～ 700 nm下进行紫外分光光度法扫描 , 检测脱色效果 , 葡萄
糖溶液为对照品进行比较 ,以多糖损失率为指标考察不同浓度过
氧化氢和活性炭脱色的效果 [ 9] 。比较不同浓度活性炭脱色和过
氧化氢脱色效果及多糖损失率。结果见表 3。
表 3　不同脱色方法对云南钝顶螺旋藻多糖含量的影响 %
脱色方法 脱色剂含量 多糖损失率
0.5 54.72
过氧化氢脱色 1.0 64.81
1.5 78.15
0.5 25.61
活性炭脱色 1.0 34.51
1.5 46.21
　　n=3
从表 3可知 , 活性炭对云南钝顶螺旋藻多糖的吸附能力较
强 , 其脱色效果比过氧化氢好 , 多糖损失率较低。脱色剂种类以
及浓度对多糖脱色效果显示出差异 ,而用量升高时候多糖损失率
明显增加 ,通常取 0.5% ～ 1%的活性炭能取得满意的效果。
3.3　云南钝顶螺旋藻多糖脱蛋白方法的比较 多糖中的游离蛋
白质可用蛋白质沉淀剂如三氯乙酸 、鞣酸等除去 , 少量蛋白质可
选用 Sevage法除去 [ 9] 。以蛋白质去除率 、多糖损失率为指标比
较三氯乙酸 -正丁醇法 、三氯乙酸法和 Sevage法脱蛋白的效果 ,
优化筛选出适合工业生产的简单 、高效的云南钝顶螺旋藻多糖脱
蛋白方法。比较上述 3种方法脱蛋白的效果。结果见表 4。
表 4　不同方法对云南钝顶螺旋藻多糖脱蛋白效果比较 %
脱蛋白方法 蛋白质去除率 多糖损失率
三氯乙酸 -Sevage法 60.26 11.21
三氯乙酸法 52.03 2.85
Sevage法 17.85 63.51
　　n=4
从表 4可知 , 3种脱蛋白质方法中 , 蛋白质去除率最高 ,效果
最好的为三氯乙酸 -Sevage法 , 蛋白质去除率达 60.26%, 但该
方法处理后的多糖损失率也较高 , 达到 11.21%;采用 Sevage法
脱除蛋白质的效果较差 , 蛋白质去除率仅为 17.85%, 需要多次
使用 , 而每次使用 Sevage试剂除去蛋白质的变性胶状物时 ,不可
避免溶有多糖 ,造成多糖损失率达 63.51%。三氯乙酸作为一种
有机酸 , 可以使得样品中的蛋白质因为有机酸而变性沉淀 , 采用
三氯乙酸法去除蛋白质(52.03%)的同时多糖损失率(2.85%)
较低 , 综合考虑蛋白质去除率和多糖损失率两个指标 , 三氯乙酸
法是较理想的脱蛋白方法。
4　讨论
实验中通过正交实验设计水提醇沉法提取云南钝顶螺旋藻
多糖 , 提取过程中考察了不同的水提温度(A)、水提时间(B)和
固液比(C)对多糖提取量的影响 ,以最小的 RB做误差估计 , RA、
RC分别是 RB的 3.9倍和 3.3倍。因此 , A、C是影响多糖得率
的主要因素 , B则是次要因素 , 结合各因素的 K值(越大越好)可
得优选水提温度 80℃,水提时间 2 h,固液比 1∶15进行提取 , 多
糖产率较高。此外 ,在多糖的提取过程中还发现 , 冰乙醇用量越
大 , 沉降时间越长 ,多糖沉淀越彻底 ,得率越高。实验中控制溶液
的醇浓度约 80%,过夜沉降。 温度升高 , 不利于多糖的沉降 , 故
选择 4℃冰箱中冷藏静置。
提取出来的云南钝顶螺旋藻粗多糖呈绿色 ,色素的存在影响
色泽和纯度 ,而多糖进一步分离纯化往往选用离子交换色谱法 ,
残留的色素会降低离子交换树脂的交换能力 ,因此脱色在多糖纯
化过程中有着非常重要的作用。此外 ,云南钝顶螺旋藻粗多糖中
蛋白质的存在会影响对多糖生物活性的进一步研究 ,因此有必要
进行脱色和脱蛋白方法的研究。
过氧化氢脱色的原理是其在受热过程迅速分解 ,产生初生态
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.11
氧而破坏有色物质 , 对多糖的脱色效果较活性炭差且多糖损失率
较高。活性炭为黑色细微粉末 , 无毒 、无臭 、无味 ,具有多孔结构 ,
能吸附糖液中的色素物质 ,但同时也会吸附掉部分多糖 , 造成多
糖的组分损失 , 所以在选择脱色剂用量上 , 并不是用量越高越好 ,
而应同时考虑脱色效果与多糖损失两者的综合效应。此外 ,实验
还比较了同种方法对云南钝顶螺旋藻多糖脱蛋白前后脱色效果。
脱蛋白后进行脱色 , 溶液透光率明显提高 , 用 1.5%活性炭 40℃
保温 15 min, 糖溶液呈透明状。蛋白质的存在影响了色素的去
除 , 这可能与色素的性质有关 , 推测其大多为结合色素。
多糖主要以两种形式存在 , 一是以纯糖链 ,另一种是糖链与
肽链结合 , 形成糖肽或糖蛋白 , 多糖脱蛋白并不是彻底去除蛋白
质 , 主要是去除游离蛋白质 , 因此在选择脱蛋白方法时应该注意
避免多糖 -蛋白质复合物的降解 ,从而造成多糖 -蛋白质特有的
生理活性下降。粗多糖中蛋白质的去除通常采用 4种方法即酶
法 、Sevage法 、三氟三氯乙烷法和三氯乙酸法 [ 10] 。本文对三氯乙
酸 -Sevage法 、三氯乙酸法和 Sevage法 3种脱蛋白方法进行了比
较 , 结果表明三氯乙酸法对云南钝顶螺旋藻多糖的脱蛋白效果较
好 , 而且多糖损失率较小。 因此 , 选用三氯乙酸法进行 3次脱蛋
白能够较好的去除蛋白质 ,但在一定程度上也有可能造成一部分
多糖 -蛋白质复合物的损失 , 是否影响到多糖的活性 ,有待于进
一步研究。
参考文献:
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性蛋白质含量方法的研究 [ J].苏州大学学报(自然科学版), 2006,
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收稿日期:2009-12-28;　修订日期:2010-04-25
基金项目:江苏省镇江市科技项目(No.NY2008019)
作者简介:朱晶英(1984-),女(汉族),福建武平人 ,现为江苏大学食品与
生物工程学院硕士研究生 ,主要从事天然产物功能性研究工作.
苦瓜伤流液喷干粉降血糖作用及急性毒性实验研究
朱晶英 ,董　英 ,张艳芳
(江苏大学食品与生物工程学院 ,江苏 镇江　212013)
摘要:目的 研究苦瓜伤流液喷干粉的降糖作用及其急性毒性。方法 选用链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病小鼠模型 ,观察
苦瓜伤流液喷干粉对糖尿病小鼠空腹血糖值 、血脂水平及肝糖原含量的影响 , 并通过急性毒性试验确定其 LD50。结果
苦瓜伤流液喷干粉能显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖值及血脂水平 ,并增加糖尿病小鼠肝糖原含量;急性毒性试验结果
表明 , 苦瓜伤流液喷干粉的经口 LD50在 11 400 ～ 12 300 mg/kg之间 , 参照我国食品毒理急性毒性分级标准 , 苦瓜伤流液喷
干粉属实际无毒。结论 苦瓜伤流液喷干粉可以作为糖尿病患者的辅助降糖食品。
关键词:苦瓜伤流液喷干粉;　降血糖;　急性毒性实验
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.11.101
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)11-2927-03
　　糖尿病是常见的代谢性疾病 ,它的发病率呈逐年上升趋势 ,
因此糖尿病的预防和治疗日益受到关注。苦瓜药食兼用 ,是著名
民间中草药 , 在我国已有五百余年的应用史 [ 1] 。 《本草纲目》曰:
苦瓜 “去邪热 , 解劳乏 ,清心明目” [ 2] 。近年来 , 许多药理实验研
究表明苦瓜及苦瓜提取物具有降血糖活性 [ 3 ～ 5] 。植物伤流液是
植株茎干切断后木质部液流在根压作用下流出体外的汁液 [ 6] 。
现代研究表明植物伤流液中含有大量矿质元素 、植物激素 、糖类 、
蛋白质 、酚类等活性物质 [ 7] 。 苦瓜伤流液是指在苦瓜收获结束
时 , 将其主茎在一定高度切断后 , 在其切口处收集的流出液。因
其不影响苦瓜收成 ,可作为苦瓜资源综合利用的途径。目前 ,关
于苦瓜肉 、苦瓜籽提取物的降糖活性已有大量报道 , 而对苦瓜伤
流液的药理活性却研究甚少 ,除本课题组有相关报道外 [ 8] , 在国
内外仍是空白。本文利用苦瓜伤流液为原料 ,采用喷雾干燥制成
干粉 , 研究其对链脲霉素诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用 , 并进
行急性毒性试验研究 ,为苦瓜伤流液的利用提供试验依据。
1　材料
1.1　原料与试剂 新鲜苦瓜伤流液 , 采自江苏省扬中市国家级苦
瓜种植示范区;链脲霉素 , 美国 Sigma化学试剂公司产品;二甲双
胍(分析纯), 上海华氏制药有限公司;血糖测定试纸 , 美国强生
公司产品;肝糖原 、总胆固醇 、甘油三酯 、高密度脂蛋白测定试剂
盒 , 南京建成生物工程研究所产品;麦芽糊精(DE=18)(食用
级),上海化学试剂公司产品 。
1.2　动物与饲料 降血糖试验动物:健康 ICR雄性小鼠 , 体质量
(25±2)g, 由扬州大学比较医学中心提供(动物合格证号 SCXK
苏 2007-0001)。
急性毒性试验动物:昆明种小鼠 , 雌雄各半 , 体质量(23 ±2)
g,由南京江宁试验动物中心提供(动物合格证号 SCXK苏 2002-
0018)。
饲料:小鼠基础饲料 , 由南京安立默科技有限公司提供。
1.3　仪器与设备 B-290小型喷雾干燥机 , BUCHI公司产品;
TOUCHI血糖监测仪 ,美国强生公司产品;R4冷冻离心机 BR4i,
法国 JOUAN公司产品;B040234全自动酶标仪 , 芬兰 Thermo公
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.11 时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期