全 文 ：［收稿日期］ 20120618(001)
［基金项目］ 广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻 10124008-6;桂科攻 0992003A-2，KFJJ2010-22)
［第一作者］ 葛文漪，硕士，从事药物质量控制和生化药理学研究，Tel:15994443433，E-mail:gewenyi1986@ 163. com
［通讯作者］ * 黄仁彬，教授，博士生导师，从事抗病毒性肝炎药物和生化药理学研究，Tel:0771-5339805，E-mail:huangrenbin518
@ 163. com
正交设计法优选六月青多糖胶囊提取及醇沉工艺
葛文漪，黄建春，陈兆霓，焦杨，张士军，黄仁彬 *
(广西医科大学药理学教研室，南宁 530021)
［摘要］ 目的:优选六月青多糖胶囊提取、醇沉工艺条件。方法:以多糖含量为指标，采用正交试验考察料液比、煎煮次
数及煎煮时间对六月青多糖胶囊提取工艺的影响;以多糖含量及多糖收率为综合评价指标，选取醇沉时间、醇沉次数、加醇量
及醇沉浓度为考察因素，通过正交试验优选醇沉工艺;采用苯酚-浓硫酸法测定总多糖含量。结果:六月青多糖胶囊最佳提取
工艺为加 10 倍量水煎煮 3 次，每次煎煮 2 h。最佳醇沉条件为水提液过滤后浓缩至 0. 5 g·mL － 1，加 7 倍量 95%乙醇沉淀 12
h，沉淀 1 次。醇沉后多糖纯度达 71. 05%，收率 6. 83%。结论:优选的提取及醇沉工艺条件稳定合理，可为六月青多糖胶囊的
生产提供实验依据。
［关键词］ 六月青胶囊;正交试验;提取工艺;煎煮法;醇沉法
［中图分类号］ R283． 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)21-0042-04
Optimization of Extraction and Precipitation Technology for Liuyueqing
Polysaccharide Capsule by Orthogonal Design
GE Wen-yi，HUANG Jian-chun，CHEN Zhao-ni，JIAO Yang，ZHANG Shi-jun，HUANG Ren-bin*
(Department of Pharmacology，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)
［Abstract］ Objective: To optimize extraction and precipitation technology conditions of Liuyueqing
polysaccharide capsule． Method:With the content of polysaccharide as index， orthogonal test was adopted to
investigate influence of solid-liquid ratio， decoction times and decoction time on extraction technology of
Liuyueqing polysaccharide capsule;With the content and yield of polysaccharide as comprehensive evaluation
index，alcohol precipitation time and times， the amount of ethanol and alcohol precipitation concentration were
chosen as factors， alcohol precipitation technology was optimized by orthogonal test． The content of total
polysaccharides was determined by phenol-concentrated sulfuric acid method． Result: Optimal extraction
technology of Liuyueqing polysaccharide capsule was as follows:decocted three times with 10-fold water，2 hours
each time． Optimum alcohol precipitation conditions were: filtered extraction liquid，mixed and concentrated to
0. 5 g·mL － 1，and then precipitated one time with 7-fold 95% ethanol for 12 hours． Under these conditions，
purity of polysaccharide was up to 71. 05%，yield of it was 6. 83% ． Conclusion:This optimized extraction and
precipitation procedure was proved to be stable and reliable，it could provide experimental basis for Liuyueqing
polysaccharide capsule．
［Key words］ Liuyueqing polysaccharide capsule;orthogonal design;extraction technology;decoction
method;alcohol precipitation method
六月青为广西特色民间草药，在《本草拾遗》中 记载，其能活血、凉血、疏肝泻湿、消肿止痛，主要用
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第 18 卷第 21 期
2012 年 11 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 21
Nov．，2012
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.21.057
于急慢性肝炎、黄疸等［1］。本课题组前期试验结果
表明，六月青总多糖作为六月青的活性成分之一，具
有明显的体外抗氧化作用，对四氯化碳所致小鼠急
性化学性肝损伤及刀豆蛋白 A 致免疫性肝损伤均
具有显著的保护作用，同时可减轻四氯化碳诱导的
大鼠肝纤维化，其作用机制可能与抗氧自由基、抑制
脂质过氧化、抑制肝脏胶原纤维的合成和沉积有
关［2］。六月青多糖胶囊系根据中医理论和民间治
疗肝炎经验研制的纯中药单方制剂，由六月青总多
糖及相应辅料组成。本研究为尽可能提取完全六月
青药材中总多糖活性成分，依据正交试验设计原理，
分别对水煎煮工艺和醇沉工艺进行考察［3-5］，以优
选最佳工艺条件，为六月青多糖胶囊制剂的开发研
究提供工艺支持和科学依据。
1 材料
722S 型紫外-可见光分光光度计(上海精密科
学仪器有限公司) ，EL204 METTLER TOLEDO 型电
子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司) ，DHJF-2005
型低温恒温搅拌反应浴(郑州长城科工贸有限公
司) ，DZF-300 型真空干燥箱(郑州长城科工贸有限
公司)。
六月青采于广西灵山县，经广西中医药研究院
赖茂祥研究员鉴定为爵床科肖鸡笼属植物肖鸡笼
(顶花马兰)Taraphochlamys affinis (Giff)Bremekhu
的干燥地上部分。D-无水葡萄糖对照品(中国药品
生物制品检定所，批号 110833-200904) ，水为重蒸
水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 六月青多糖含量测定
2. 1. 1 对照品溶液的配制 精密称取 105 ℃干燥
至恒重的葡萄糖对照品 20 mg，置于 100 mL 量瓶
中，加水溶解并定容至刻度，混匀，即得。
2. 1. 2 供试品溶液的配制 精密称取六月青提取
物粉末 40 mg，加水溶解并定容于 100 mL 量瓶中，
即得。
2. 1. 3 标准曲线的绘制 精确吸取对照品储备溶
液 0. 2，0. 4，0. 6，0. 8，1. 0 mL 分置于 10 mL 具塞玻
璃试管中，加水稀释至 2. 0 mL，摇匀，另取蒸馏水
2. 0 mL 于试管中作为空白对照，分别加入 6%重蒸
苯酚溶液 1 mL，沿壁迅速滴加浓硫酸 5 mL，旋涡混
匀，沸水浴中加热 10 min，冷却至室温，于 490 nm 处
测定吸光度(A)。以 A 对葡萄糖质量浓度作回归处
理，得回归方程 A = 0. 007 4C + 0. 070 5 (R2 =
0. 999 6) ，表明葡萄糖质量浓度在 20 ～ 100 mg·L － 1
与 A 呈良好线性关系。
2. 1. 4 精密度试验 精密量取对照品溶液 1 mL 于
10 mL 具塞玻璃试管中，按 2. 1. 3 项下的方法操作，
连续 5 次测定其 A，结果 RSD 0. 82%，说明仪器精密
度符合要求。
2. 1. 5 重复性试验 取六月青提取物细粉 6 份，依
2. 1. 2 项下方法配制供试品溶液，按 2. 1. 3 项下的
方法操作分别测定 A，得出六月青总多糖平均质量
分数 65. 36%，RSD 1. 34%，说明重复性良好。
2. 1. 6 稳定性试验 精确量取同一供试品溶液 1
mL，分别于配制后 0. 5，1，2，4，8，12 h 取样，按
2. 1. 3 项下方法测定 A，RSD 1. 05%，说明供试品在
12 h 内稳定。
2. 1. 7 加样回收率的测定 精密称取已知含量的
六月青多糖 6 份，分别精密加入葡萄糖对照品适量，
按 2. 1. 2 项下方法配制供试品溶液，按 2. 1. 3 项下
方法测定 A，得平均回收率 99. 04%，RSD 1. 65%，表
明该方法系统误差小。
2. 1. 8 换算因子的测定 精密称取六月青提取物
适量，采用 gevage 法除去蛋白后用水透析 72 h，浓
缩至适量。置于 100 mL 量瓶中，加蒸馏水溶解并稀
释至刻度，取 1. 0 mL，按 2. 1. 3 项下方法测定 A，依
下式计算换算因子，测得换算因子为 1. 136 7。
f = m /(C × D)
式中 m 为称取多糖的质量;C 为多糖液中葡萄
糖质量浓度;D 为多糖的稀释倍数［6］。
2. 1. 9 样品测定 精密称取由正交设计不同工艺
制备的六月青多糖细粉 50 mg，置于 100 mL 量瓶
中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，精密量取 1. 0 mL
溶液，按 2. 1. 3 项下方法测定 A，计算葡萄糖质量浓
度，按以下公式计算六月青总多糖的含量。
六月青多糖含量 = C × D × f /W × 100%［6］
式中 C 为样品溶液中葡萄糖质量浓度;D 为样
品溶液的稀释倍数;f 为换算因子;W 为称取的样品
质量。
2. 2 吸水率的测定 称取干燥六月青生药材 200
g，平行 3 份，加 6 倍量水浸泡，每隔 0. 5 h 观察 1 次
浸透程度，滤出未被吸收的药液，测定药渣湿重，直
至质量不增加为止。按公式:吸水率 = (药渣湿
重 －药材干重)/药材干重 × 100%，计算药材吸水
率。3 次试验中，药渣湿重分别为 406. 16，402. 57，
404. 39 g，计算得六月青药材平均吸水率 102. 26%，
即首次应多加入 1 倍量水。
2. 3 水煎煮工艺优选 根据六月青生药材性质及
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葛文漪，等:正交设计法优选六月青多糖胶囊提取及醇沉工艺
预试验结果，确定选取料液比、煎煮次数和煎煮时间
为 3 个主要考察因素，因素水平见表 1，以多糖纯度
为考察指标，对水煎煮提取工艺进行优选。按处方
称取六月青生药材 27 份(每组试验平行操作 3
次) ，每份重 200 g，按 L9(3
4)正交试验表进行试验，
煎煮液趁热过滤，合并滤液，减压浓缩，真空干燥，粉
碎，按 2. 1. 9 项下的方法测定多糖含量。试验安排
及结果见表 2，方差分析见表 3。
表 1 六月青多糖胶囊水煎煮提取工艺正交试验因素水平
水平
A
料液比
B
煎煮数 /次
C
煎煮时间 / h
1 1∶ 6 1 1
2 1∶ 8 2 1. 5
3 1∶ 10 3 2
表 2 六月青多糖胶囊水煎煮提取工艺正交试验安排
No． A B C D 多糖 /%
1 1 1 1 1 19. 45
2 1 2 2 2 23. 18
3 1 3 3 3 27. 09
4 2 1 2 3 21. 95
5 2 2 3 1 25. 71
6 2 3 1 2 24. 43
7 3 1 3 2 27. 48
8 3 2 1 3 25. 38
9 3 3 2 1 30. 12
K1 23． 240 22． 960 23． 087 25． 093
K2 24． 030 24． 757 25． 083 25． 030
K3 27． 660 27． 213 26． 760 24． 807
R 4． 420 4． 253 3． 673 0． 286
表 3 水煎煮工艺方差分析
变异来源 SS f MS F P
A 11. 112 2 5. 556 245. 125 ＜ 0. 01
B 9. 118 2 4. 559 201. 132 ＜ 0. 01
C 6. 764 2 3. 382 149. 199 ＜ 0. 01
D(误差) 0. 045 2 0. 022
注:F0. 05(2，2)= 19;F0. 01(2，2)= 99(表 6 同)。
由表 2，3 可知，A，B，C 三因素对多糖含量的影
响均具有统计学意义上的显著性差异，影响因素大
小顺序为 A ＞ B ＞ C，确定水煎煮最佳工艺条件为
A3B3C3，即加 11，10，10 倍量水煎煮 3 次，每次煎
煮2 h。
2. 4 醇沉工艺优选 在预试验基础上，采用正交试
验考察加醇量、醇沉浓度、醇沉时间和醇沉次数 4 个
因素对试验结果的影响，以收率和多糖含量为综合
评分指标［7］，对醇沉工艺进行优选，每个因素选取 3
个水平，因素水平见表 4。称取六月青生药材，按优
选的水煎煮工艺提取，过滤，合并滤液，减压浓缩至
0. 5 g·mL － 1，均分成 27 份(每组试验平行操作 3
次) ，按表 5 中条件置于 4 ℃冰箱进行醇沉，4 000 r·
min － 1离心 15 min，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮
洗涤，即得六月青总多糖，干燥，称量，计算多糖
收率。
表 4 六月青多糖胶囊醇沉工艺正交试验因素水平
水平
A
加醇量 /倍
B
醇沉浓度 /%
C
醇沉时间 / h
D
醇沉数 /次
1 5 95 24 1
2 6 85 12 2
3 7 75 8 3
表 5 六月青多糖胶囊醇沉工艺正交试验安排
No． A B C D
收率
/%
多糖纯
度 /%
综合
评分
1 1 1 1 1 4. 14 64. 38 84. 26
2 1 2 2 2 4. 60 57. 21 76. 95
3 1 3 3 3 3. 80 53. 05 70. 30
4 2 1 2 3 3. 33 59. 19 76. 38
5 2 2 3 1 3. 82 41. 72 57. 19
6 2 3 1 2 5. 58 49. 08 69. 73
7 3 1 3 2 8. 82 52. 56 81. 13
8 3 2 1 3 5. 26 58. 85 80. 37
9 3 3 2 1 4. 06 68. 79 89. 21
K1 77． 170 80． 590 78． 120 76． 887
K2 67． 767 71． 503 80． 847 75． 937
K3 83． 570 76． 413 69． 540 75． 683
R 15． 803 9． 087 11． 307 1． 204
注:综合评分 = (收率 /最大收率)× 20 + (多糖含量 /最大多糖
含量)× 80［8］。
表 6 醇沉工艺综合评分方差分析
变异来源 SS f MS F P
A 126. 376 2 63. 188 156. 989 ＜ 0. 01
B 41. 373 2 20. 687 51. 395 ＜ 0. 05
C 69. 631 2 34. 815 86. 498 ＜ 0. 05
D(误差) 0. 805 2 0. 403 1. 000
由表 5 直观分析可知，以极差最小的 D 因素为
误差项进行方差分析，因素 B，C 对试验结果影响均
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 21
Nov．，2012
具有统计学意义上的显著性差异，A 因素则有极显
著性差异，各影响因素大小顺序为 A ＞ C ＞ B ＞ D，
确定乙醇沉淀工艺最佳条件为 A3B1C2D1，即加 7 倍
量 95%乙醇沉淀 1 次，醇沉时间 12 h。
2. 5 验证试验 取干燥六月青生药材，分别加入
11，10，10 倍量水煎煮 3 次，每次 2 h，水提液过滤，
合并，浓缩至 0. 5 g·mL － 1;所得浓缩液加入 7 倍量
95%乙醇沉淀，4 ℃静置 12 h，将提取液及沉淀以
4 000 r·min － 1离心 15 min，抽滤取沉淀，无水乙醇、
丙酮洗涤，40 ℃干燥至恒重，粉碎，即得。重复提
取 3 次，六月青多糖质量分数分别为 70. 13%，
71. 09%，71. 94%，按公式:六月青总多糖提取率 =
(提取物质量 × 多糖质量分数)/六月青药材投入
量 × 100%［9］，计算多糖提取率平均值达 6. 83%，
RSD 1. 25%，说明该提取工艺稳定可行。
3 讨论
多糖是一类由单糖分子经脱水以苷键缩合而成
的天然高分子化合物，一般为非晶形。提取多糖常
用水、稀酸或稀碱等，由于酸、碱度较难控制，易影响
提取效果［10］，本研究以水作为溶媒，利用多糖易溶
于水、难溶于一定体积分数乙醇的性质，将六月青先
用热水浸提，再加乙醇沉淀。通过正交设计，对水提
醇沉工艺进行优化，以多糖含量和得率作为综合考
察指标，对两项指标进行加权求和得到综合评分，使
结果分析更为客观。由水煎煮试验方差分析得知，
加水量和煎煮次数对多糖含量影响很大，溶剂体积
增加了介质推动力，新溶剂的多次加入使渗透压变
大，均利于多糖的溶出，适宜的条件有助于节约能
源，提高生产效率。
醇沉试验方差分析显示，乙醇加入倍数和浓度、
静置时间对总多糖得率影响显著，浓度过低易致多
糖不能充分从提取液中析出，充足的醇沉时间和适
当醇沉次数既能减少原料消耗又能增加多糖有效析
出。4 ℃环境下醇沉时，能进一步降低多糖在醇溶
液中的溶解度，提高多糖得率。
多糖的含量测定是多糖类药物质量控制的重要
内容，也是筛选提取工艺优劣的基础。苯酚-浓硫酸
法原理系多糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅
速脱水生成糠醛或其衍生物，可与苯酚试剂缩合产
生有色化合物，反应后溶液呈橙黄色，在波长 490
nm 及一定波度范围内有特征吸收，其吸光度与多糖
含量呈线性正比关系，因此可利用分光光度计测定
吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量。
该法简单快速、灵敏度高，便于实际应用。本研究采
用精制六月青总多糖测得其对葡萄糖的换算因子，
由于组成与待测物接近，避免了因使用葡萄糖作为
标准而引起的误差。苯酚极易氧化，操作时应避光
或操作迅速，试验中所用苯酚为重蒸苯酚，将苯酚与
铝片、碳酸氢钠混合加热蒸馏后收集 182 ℃的馏分，
配制成相应浓度，溶液浓度不宜过高，否则会影响反
应稳定性，硫酸应保持较高纯度，同时注意操作步骤
统一和反应时间一致，以确保数据重复性和可靠性。
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［责任编辑 仝燕］
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