全 文 ：续表 1
30 31． 45
2 －异亚丙基 －5 －甲基 －4 －己
醛 2 － isopropylidene － 5 － meth-
ylhex － 4 － enal
C10H16O 152 1． 17
31 32． 09
(2，2 －二甲基亚丙基)环己烷
(2，2 － Dimethylpropylidene)cy-
clohexane
C11H20 152 0． 52
32 32． 62 β －马鞭烯醇 β － verbenol C10H16O 152 1． 20
33 33． 03
2，6 －二甲基 －2，6，11 －十一烷
三烯 － 8 － 醇 2，6 － dimethyl －
2，6，11 － undecatrien － 8 － ol
C13H22O 194 0． 23
34 33． 22 β －合金欢烯 β － farnesene C15H24 204 2． 55
35 34． 22 橙花叔醇 nerolidol C15H26O 222 0． 21
36 35． 01 二十烷 eicosane C20H42 282 0． 38
4 讨论
所鉴定出的 36 个化学成分占挥发油总量的 75． 11%，主要
成分为罗勒烯(10． 21%)、β －水芹烯(8． 26%)、柠檬醛(5． 59%)
和沉香醇(5． 39%)。其中单萜类化合物含量最高，其次是倍半
萜类化合物，还含有一些烷烃类化合物［3］。这些物质中不少成
分有芬芳的气味，对人体器官具有刺激或镇静作用，而且有些具
有特殊的药效，如 β －水芹烯既是一种香料和香料中间体，也是
一种具有生物活性的天然杀虫剂，还可以作为原料加工制备很多
重要的化学品;柠檬醛具有杀、驱昆虫作用，用作杀、驱昆虫剂，有
防腐作用，作用比苯酚强，还有抑、杀真菌作用［4］。本研究结果
对山胡椒的进一步开发和利用提供了科学依据。
参考文献:
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收稿日期:2011-09-10; 修订日期:2011-12-26
基金项目:广西壮族自治区科学研究与技术开发计划项目(No． 0992025 － 22) ;广西壮族自治区自然科学基金(No．桂科自 0991137)
作者简介:赵 杰(1985-) ，女(瑶族) ，广西金秀人，现为广西医科大学在读硕士研究生，学士学位，主要从事海洋药物应用研究工作．
* 通讯作者简介:庞 辉(1962-) ，女(汉族) ，广西博白人，现任广西医科大学基础医学院教授，硕士研究生导师，硕士学位，主要从事海洋药物的应用
研究工作．
螺旋藻激酶对人脐静脉内皮细胞
t － PAmRNA、PAI － 1mRNA表达的影响
赵 杰1，肖云晓1，蒋 浩2，庞 辉1*
(1．广西医科大学，广西 南宁 530021; 2．清华大学，北京 100084)
摘要:目的 研究螺旋藻激酶(Spirulina kinase，SPK)对人脐静脉内皮细胞 t － PAmRNA、PAI －1mRNA表达的影响，探讨其抗
血栓作用机制，为开发新型溶栓药物提供理论依据。方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，建立肾上腺素(Adr)损
伤模型加入不同浓度的 SPK，并以肝素(Hep)为阳性对照，与空白组对照，经过 12，24，48 h后，逆转录多聚酶链式反应(RT －
PCR)，扩增产物经凝胶电泳分离后，凝胶图像分析仪照相和扫描，测定各组 t － PAmRNA、PAI － 1mRNA与内参基因三磷酸
甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA的相对表达量。结果 在 Adr损伤模型中，2 mg /ml SPK可以上调 t － PAmRNA表达，超大剂
量 SPK降低 t － PAmRNA表达。SPK还可以随着剂量的增加明显的抑制 PAI －1mRNA的表达，效果强于大剂量的肝素。结
论 SPK可能通过小部分活化 t － PAmRNA的表达，抑制 PAI －1mRNA的表达，从而达到抗血栓的作用。
关键词:螺旋藻激酶; 组织型纤溶酶原激活物; 纤溶酶原激活物抑制物; 逆转录多聚酶链式反应
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 06． 068
中图分类号:R284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2012)06-1471-03
Effects of Spirulina Kinase on the Expression of t － PAmRNA、PAI － 1mRNA in human
Umbilical Vein Endothelial Cell
ZHAO Jie1，XIAO Yun-xiao1，JIANG hao2，PANG Hui1
(1． Department of Physiology，Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi，530021，China;2． Qinghua Uni-
versity，Beijing，100084，China)
Abstract:Objective To study the effects of spirulina kinase from spirulina on the expression of t － PAmRNA，PAI － 1mRNA in
human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)and to explore the mechanism of its anti － thrombotic and provide theoretical
basis for the development of new thrombolytic drugs．Methods The third to fifth genetation of HUVECs were incubated respective-
ly with adrenaline (Adr)damage model － different concentrations of SPK and heparin (Hep)as a positive control，for 12，24，
48hours． Meanwhile ，cells were also accordingly exposed to 2mg /mlSPK alone． After reverse transcription － polymerase chain reac-
tion (RT － PCR ) ，PCR products were separated by gel electrophoresis，and gel images were analyzed and scanned to measure the
relative expression of t － PAmRNA，PAI － 1mRNA with the reference gene GAPDHmRNA． Results In Adr injury models，2mg /
mlSPK could increase the expression of t － PAmRNA，concentration of SPK to reduce the expression of t － PAmRNA． SPK also sig-
nificantly inhibited the expression of PAI － 1mRNA with increasing concentration． The effect was stronger than high concentration
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of heparin． Conclusion SPK possibly activate the expression of t － PAmRNA，inhibit the expression of PAI － 1mRNA to achieve
the antithrombotic effect．
Key words:Spirulina kinase (SPK) ;Tissue － type plasminogen activator (t － PA) ;Plasminogen activator inhibitor (PAI
－ 1) ;Reverse transcription － polymerase chain reaction (RT － PCR)
近年来，随着人们生活水平的提高、人口老龄化的出现，血栓
性疾病发病率、致死率、致残率日益增高，溶栓治疗被提到了新的
议程。现今溶栓药物已发展到第四代，以生物技术改造的新型纤
溶酶原激活剂和以来自微生物和植物的新型天然来源溶栓药为
代表，研制具有高效、低毒、特异性高、副作用小、价格合理的溶栓
药物已成为国内外医药界研究热点［1］。
螺旋藻(Spirulina)属原核生物，水体生存，具有宝贵的营养
价值，富含蛋白质、氨基酸、维生素、纤维素、微量元素、多糖、γ －
亚麻酸，并具有抗氧化、抗衰老、抗损伤、抗辐射、降血脂、促进蛋
白合成、提高免疫力等药理作用［2］。
广西北海广泛养殖的螺旋藻，我们经筛选特殊菌种，发酵酶
化产生了含蛋白激酶的特殊螺旋藻粉，并分离纯化了其中的蛋白
激酶(称为螺旋藻激酶，Spirulinakinase，SPK) ，SPK经前期研究发
现具有抗凝、溶栓作用［3］。本实验体外培养人脐静脉内皮细胞，
探讨 SPK对内皮细胞组织型纤溶酶原激活物(t － PA)和纤溶酶
原激活物抑制物(PAI － 1)mRNA 表达的影响，探讨抗凝、溶栓的
作用机制。
1 材料与仪器
1． 1 原料 螺旋藻激酶发酵提取物粉剂，由广西北海市康福保健
食品有限公司提供。
1． 2 细胞系 人脐静脉内皮细胞细胞系(HUVEC304) ，美国 Sci-
enCell公司。
1． 3 试剂 内皮细胞培养基 RPMI1640、胎牛血清，美国 GIBCO
公司;肾上腺素针剂，上海禾丰制药有限公司;青霉素、链霉素，华
北制药集团有限责任公司;胰蛋白酶，美国 Amerssco 公司;总
RNA提取试剂盒(离心柱型)DP419，电泳Marker1，天根生化科技
北京有限公司;RT － PCR试剂盒，Fermentas公司;琼脂糖，西班牙
Biowest公司;引物合成，上海生工生物工程公司。
1． 4 仪器 二氧化碳培养箱(美国 SHELLAB 公司) ;倒置显微
镜、凝胶成像分析系统(日本奥林巴司公司) ;核酸蛋白测定仪
(美国伯乐公司) ;梯度 PCR仪(德国 Biometra公司) ;电泳仪(北
京六一仪器厂) ;酶联免疫检测仪(Thermo Labsystem公司)。
2 方法
2． 1 螺旋藻激酶的分离纯化 螺旋藻干粉蒸馏水搅拌混匀，低温
离心收集上清液，45%硫酸铵盐析收集上清、75%硫酸铵盐析收
集沉淀，透析，冻干，凝胶层析［4］，冻干保存备用。得到的螺旋藻
蛋白激酶 SPK比活达 2 631． 1IU /mg，活力回收率 42． 3%，纯化倍
数 6． 1 倍。
2． 2 HUVEC 的培养处理 复苏购置冻存的 HUVECs，加入含
10%血清、100 U /ml青霉素、100 μg /ml 链霉素、0． 03%谷氨酰胺
的 RPMI1640 培养基，37℃，5% CO2 细胞培养箱中静置培养，每
隔 2 天换液一次，待细胞生长到 80%用 0． 25%胰蛋白酶消化传
代，选择生长状态良好的第 3 ～ 5 代用于实验。
2． 3 Adr和 SPK增敏浓度确定 制备细胞悬液接种于 96 孔板，
培养 12 h后，分别加入 10，25，50，100，200 μg /ml 浓度的 Adr 培
养液，1 μl /ml，10μl /ml，100 μl /ml，500 μl /ml，1 mg /ml，2 mg /ml，
3 mg /ml，4 mg /ml，5 mg /ml，6 mg /ml浓度的 SPK 培养液，并设置
空白对照组，各实验组分别设置 6 孔，孵育 24 h后每孔加入 10 μl
MTT溶液，37℃继续孵育 4 h，终止培养。每孔加入 150 μl 的
DMSO，振荡 5 min，使二甲基亚飒充分溶解。选择 490 nm 波长，
在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，计算各孔内皮细胞的抑
制率。增敏浓度确定结果:肾上腺素组选取浓度 = 100 μg /ml 组
抑制率为 32． 92%≥30%，判定为药敏阳性，作为损伤模型组浓
度;SPK组在 1 ～ 2 mg /ml 浓度间细胞活力增加，具有明显的量
效关系，在 2 mg /ml时达到最大，当浓度 = 3 mg /ml 时，细胞活力
开始下降其抑制率≤20%，选低于取作为低细胞毒性或无细胞毒
性浓度作为增敏浓度。
2． 4 实验分组 制备细胞悬液浓度调节至 8 × 104 接种于 12 孔
板，1 ～ 9 孔分别分为 A ～ I 组，每孔终液量 2 ml，每组重复 9 孔。
A:空白组:培养基。B:SPK 对照组:2 mg /ml SPK。C:损伤模型
组:100 μg /ml Adr。D:肝素对照组:100 μg /ml Adr + 5 mg /ml
Hep。E:损伤组 + SPK 低剂量组:100 μg /ml Adr + 0． 5 mg /ml
SPK。F:损伤组 + SPK 较低剂量组 100 μg /ml Adr + 1 mg /ml
SPK。G:损伤组 + SPK中剂量组 100 μg /ml Adr + 2 mg /ml SPK 。
H:损伤组 + SPK高剂量组 100 μg /ml Adr + 3 mg /ml SPK 。I:损
伤组 + SPK 超剂量组 100 μg /ml Adr + 4 mg /ml SPK，分别孵育
12，24，48 h，在试验终点裂解细胞提取总 RNA。
2． 5 总 RNA抽提，目的片段的扩增和 RT － PCR 产物的半定量
分析 ⑴用总 RNA提取试剂盒提取细胞总 RNA，选取①紫外分
光光度仪测定吸光度，RNA 理想纯度:OD260 /O280比值在 1． 8 ～
2． 0之间。②2%琼脂糖变性电泳观察 RNA完整性和强度［5］，18s
和 28s比值为 1∶ 2 的样本进行下一步实验。⑵严格按照逆转录
试剂盒进行逆转录，以 Oligo(dT)t8为引物，反转录合成 cDNA，总
体积 20 μl。⑶取 cDNA样本 2 μl进行扩增，引物序列(5＇－ 3＇) :t
－ PA 上游 GGATTCGTGACAACATGCGAC 下游 TTTGAGGAA-
CATGACGGGCCA，扩增片段为 500bp;PAI － 1 上游 TGCCCTC-
TACTTCAACGG 下游 GTCGGTCATTCCCAGGTT，扩增片段为
390bp;GAPDH 上游 TGAACGGGAAGCTCACTGG 下游 TCCAC-
CACCCTGTTGCTGTA，扩增片段为 307bp ［5］。反应条件:t － PA /
GAPDH:预变性 94℃ 2 min，变性 94℃ 20 s，退火 57℃ 30 s，延伸
72℃ 30 s，35 个循环，终延伸 72℃ 10 min;PAI － 1 /GAPDH:预变
性 94℃ 2 min，变性 94℃ 20 s，退火 62℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，35
个循环，终延伸 72℃ 10 min．⑷PCR 产物进行溴化乙锭(EB)染
色的 2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶图像分析仪摄片，quantity one
4． 62 对电泳各条带进行分析，并计算其相对表达量。
2． 6 统计学处理方法 数据以 珋x ± s表示，用 SPSS17． 0 进行统计
分析，多组间均数比较采用单因素方差分析 One － way ANOVA，
两两比较采用最小显著法(LSD)。
3 结果
3． 1 人脐静脉内皮细胞 t － PAmRNA表达结果 给药 12 h后，D、
E、F、G组较 C组有轻微上调 t － PAmRNA 的表达(P ＜ 0． 05) ;H
组在 24 h后较 C组有明显上调(P ＜ 0． 05) ，B组在各个时间段都
未见明显差异;G 组在 12，24，48 h 都有明显的高表达(P ＜
0． 05)。I组在 24，48 h 都呈现低表达趋势(P ＜ 0． 01)。24，48 h
后各组 t － PAmRNA的表达较 12 h 有大幅度的增长。以上统计
表明螺旋激酶单独作用于人脐静脉血管内皮细胞时对 t － PAmR-
NA没有明显影响，但在肾上腺素所致细胞损伤时，中剂量 2 mg /
ml SPK可以增加 t － PAmRNA 的表达。在高剂量和超剂量组在
细胞损伤后降低了 t － PAmRNA的表达。见表 1、图 1。
3． 2 人脐静脉内皮细胞 PAI － 1mRNA表达结果 给药 12，24，48
h，C组与 A组相比明显上升(P ＜ 0． 05) ;12 h 后 D、F、G 组较 C
组降低(P ＜ 0． 05) ，H、I组明显下降(P ＜ 0． 01) ;给药 24 h 后，D、
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 6 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 6
F、G、H、I组较 C组明显下调(P ＜ 0． 01)。24，48 h 后各组 PAI －
1mRNA的表达较 12 h 有明显的增长。与 D 组相比 E、F、G 组
PAI － 1mRNA 表达下调没有显著差异，随着剂量加大 PAI －
1mRNA表达下调明显(P ＜ 0． 01)。B 组在各个时间段都未见明
显差异。以上统计表明螺旋激酶单独作用于人脐静脉血管内皮
细胞时对 PAI － 1mRNA 没有明显影响，但在肾上腺素所致细胞
损伤时，随着 SPK 剂量的增加 t － PAmRNA 的表达下调越明显。
中低剂量 SPK与高剂量肝素相比无明显差异性，均可降低 t －
PAmRNA。表 2、图 2。
表 1 SPK对人脐静脉内皮细胞 t － PAmRNA表达的影响(珋x ± s)
组别 12h 24h 48h
A 0． 4038 ± 0． 0532 0． 8297 ± 0． 0480 1． 0110 ± 0． 5316
B 0． 4642 ± 0． 0565 0． 8680 ± 0． 0651 1． 0097 ± 0． 0632
C 0． 3953 ± 0． 0618 0． 8035 ± 0． 0422 0． 9125 ± 0． 0317★
D 0． 5760 ± 0． 0701▲ 0． 9297 ± 0． 0493 1． 0750 ± 0． 0725
E 0． 6121 ± 0． 0825▲ 0． 7959 ± 0． 0979 0． 8807 ± 0． 0430
F 0． 6535 ± 0． 0770▲ 0． 8517 ± 0． 0742 0． 9905 ± 0． 0548▲
G 0． 7093 ± 0． 0718▲ 0． 9803 ± 0． 0549▲ 1． 2271 ± 0． 0847▲
H 0． 5842 ± 0． 0825 1． 0149 ± 0． 0785▲ 0． 9457 ± 0． 0667
I 0． 4338 ± 0． 0878 0． 6423 ± 0． 0388◆ 0． 7803 ± 0． 0440◆
与 A组比下降，★P ＜ 0． 01;与 C 组比升高，▲P ＜ 0． 05;与 C 组比降
低，◆P ＜ 0． 01
表 2 SPK对人脐静脉内皮细胞 PAI － 1mRNA表达的影响(珋x ± s)
组别 12h 24h 48h
A 0． 4673 ± 0． 0430 0． 6007 ± 0． 0461 0． 6822 ± 0． 0928
B 0． 4835 ± 0． 0272 0． 6016 ± 0． 0717 0． 6171 ± 0． 1019
C 0． 6769 ± 0． 0670△ 0． 8377 ± 0． 0615☆ 0． 9213 ± 0． 0671△
D 0． 5048 ± 0． 0960▼ 0． 5082 ± 0． 0920◆ 0． 5013 ± 0． 0680◆
E 0． 6013 ± 0． 0869 0． 5801 ± 0． 1189◆ 0． 5782 ± 0． 0112◆
F 0． 5041 ± 0． 1031▼ 0． 6164 ± 0． 0803◆ 0． 5436 ± 0． 0909◆
G 0． 4670 ± 0． 1017▼ 0． 5305 ± 0． 0469◆ 0． 4668 ± 0． 0678◆
H 0． 4008 ± 0． 0775◆ 0． 4341 ± 0． 0905◆ 0． 4324 ± 0． 0278◆
I 0． 3313 ± 0． 0881◆ 0． 2832 ± 0． 0752◆ 0． 1972 ± 0． 0601◆
与 A组比升高，△P ＜ 0． 05，☆P ＜ 0． 01;与 C 组比降低，▼ P ＜ 0． 05，
◆P ＜ 0． 01
图 1 t － PAmRNA半定量分析
4 讨论
内皮细胞能合成和分泌生理性纤溶酶原激活物，即组织型纤
溶酶原激活物(t － PA) ，t － PA是体内最主要的纤溶酶原激活物，
在体外具有良好的纤维蛋白降解特性，在临床上重组型纤溶酶原
激活物已作为第二、三代的溶栓药的代表药物［1］。目前有相关
报道认为 t － PA主要储存在 Weibel － Palade小体中，在内皮细胞
受到刺激、损伤时从 Weibel － Palade 小体释放［6］，从实验结果来
看，在 24 h和 48 h组别中，随着细胞增殖，t － PAmRNA的表达在
量上表现出相应的增长，但在 Ad和 SPK干预下没有出现明显的
量效关系，只在大于 2 mg /L时才出现明显的增殖，说明肾上腺素
及螺旋藻激酶对 t － PA 释放的影响可能主要在 Weibel － Palade
小体上，少部分通过合成来实现。内皮系统同时还合成和分泌纤
溶酶原激活物抑制剂(PAI － 1) ，而 PAI － 1 是 t － PA的快速抑制
剂，血浆中的 PAI主要来源于血管内皮细胞和肝细胞，还有小部
分存储于血小板。血浆中的 PAI － 1 主要功能是 t － PA、u － PA
的快速抑制剂，以 1∶ 1 的比例形成 PAI － t － PA 或 PAI － u － PA
复合物，从而使 t － PA或 u － PA失去活性［7 ～ 9］。
图 2 PAI － 1mRNA半定量分析
在正常情况下，内皮细胞分泌和表达 t － PA 和 PAI － I，纤溶
酶原系统维持着血管通畅和止血。t － PA 的作用受 PAIs 调控，
在生理条件下起主要作用的是 PAI － I。在心脑血管疾病发生
时，体内血浆的纤溶系统失衡，PAI － 1 的增多导致血中 t － PA的
水平下降。有利于血栓形成和动脉粥样硬化的出现，从而诱导
PAI － 1mRNA表达［10］。
本实验结果显示，SPK在中等剂量 2 mg /ml剂量范围单独对
细胞表达 t － PAmRNA、PAI － 1mRNA 没有明显影响。在肾上腺
素作用后，SPK 0． 5 ～ 3 mg /ml的剂量作用和大剂量 5 mg /ml肝素
作用效果一致，随着剂量加大逐步降低 PAI － 1mRNA 的表达，并
有明显的量效关系。但在 SPK ＞ 3mg /ml 较高剂量作用下均出现
t － PAmRNA、PAI － 1mRNA表达明显下调，并结合增敏浓度测定
结果表明 SPK中低剂量对细胞有保护作用，过高剂量可能会对
细胞有毒性作用。由此可见，螺旋藻激酶 SPK 的抗血栓作用在
调控 PAI － 1mRNA表达上有明显相关性，有助于进一步揭示螺
旋藻激酶 SPK溶栓机制，对临床预防和治疗心脑血管疾病开发
新药有重要的意义。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 6 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 6 期