全 文 ：参考文献:
[ 1 ]　Schw am eis E, Dom inkus M , Krep ler P, et a l. Reconstruc2
t ion of the pelvis after tumo r resection in ch ildren and ado les2
cen ts [J ]1 C lin O rthop , 2002, 402: 22022351
[ 2 ]　N akam ura H , O ish i S, Yagyu H , et a l. Comparative study
of bone reso rp tion m arkers fo r the diagno sis of bone m etasta2
sis in lung cancer [J ]1 N ihon K oky uk i Gakka i Z assh i, 2002,
40 (5) : 35523591 [ 3 ]　韩　锐1 抗癌药物研究与实验技术 [M ]1 北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 19971[ 4 ]　郑培楠, 李朝峰, 赵长琦1 鬼臼毒素及其衍生物 [J ]1 天然产物研究与开发, 2004, 16 (1) : 802821[ 5 ]　马　杰, 王　洁, 钟　鸣, 等1 Genistein 对腺样囊性癌细胞SA CC283 中细胞周期蛋白表达的影响 [J ]1 上海口腔医学,2006, 15 (1) : 692721
川芎嗪对缺氧人脐静脉内皮细胞抗凝和纤溶功能的影响
张国平1, 孙　梅1, 杨洁红2, 万海同2Ξ
(11 浙江大学医学院附属第二医院 中医科, 浙江 杭州　310009; 21 浙江中医药大学心脑血管病研究所, 浙江 杭州　310053)
摘　要: 目的　应用人脐静脉内皮细胞 (HUV EC s) 缺氧模型, 观察川芎嗪对其抗凝和纤溶功能的影响。方法　制
备正常人脐静脉原代 EC, 待 EC 培养达融合状态后, 将其放入含 95% N 2、5% CO 2混合气体的缺氧环境, 制备人脐
静脉原代 EC 缺氧损伤模型。并设正常组, 模型组, 川芎嗪组, 观察各组细胞培养上清液中漂浮细胞数、抗凝、纤溶
指标等变化。结果　与对照组相比, 模型组培养液中的漂浮细胞数显著增高, 前列环素 (62keto2PGF 1Α) 水平显著下
降, 组织型纤溶酶原激活物抑制物 (PA I) 活性显著增高, 组织型纤溶酶原激活物 ( t2PA ) 活性显著降低, 内皮素
(ET ) 水平显著增高, NO 水平显著降低; 川芎嗪具有显著提高 62keto2PGF 1Α水平, 调节 PA I、t2PA 活性和 ET、NO
水平的作用。结论　本实验制备的人脐静脉原代 EC 缺氧损伤模型存在着 EC 受损, 分泌功能下降, 血管舒缩功能
失调; 川芎嗪具有保护在缺氧环境下 EC 受损, 调节 EC 分泌功能和血管舒缩功能。
关键词: 川芎嗪; 内皮细胞; 缺氧; 前列环素; 组织型纤溶酶原激活物; 内皮素
中图分类号: R 286132　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 025322670 (2008) 0120071203
Effect of tetram ethylpyraz ine on hypox ic m odel in human um b il ica l ve in endothel ium cells
and its function s of an ticoagula tion and f ibr inolysis
ZHAN G Guo2p ing, SUN M ei, YAN G J ie2hong, W AN H ai2tong
(11D epartm ent of T radit ional Ch inese M edicine, Second A ffilia ted Ho sp ita l, Co llege of M edicine,
Zhejiang U niversity, H angzhou 310009, Ch ina; 2. Inst itu te of Cardio2cerebral D iseases,
Zhejiang Co llege of T radit ional Ch inese M edicine, H angzhou 310053, Ch ina)
Abstract: Objective　To set the hypox ic model in hum an um b ilica l vein endo thelium cells (HUV EC s)
and ob serve the effect of tet ram ethylpyrazine in its funct ion s of an t icoagu la t ion and fib rino lysis. M ethods
P reparing the no rm al p rim ary HUV EC s, w hen the cu ltu red endo thelia l cells (EC s) w ere ino scu la ted they
w ere pu t in to the anox ic condit ion w ith 95% N 2 and 5% CO 2 to m ake hypox ic model in p rim ary HUV EC s.
N o rm al, model, and tet ram ethylpyrazine group s w ere divided and u sed to ob serve the difference of f loa t ing
cells, an t icoagu la t ion and fib rino lysis indexes in supernatan t of each group. Results　Compared w ith the
con tro l group , the num ber of f loa t ing cells in supernatan t w as increased obviou sly, the level of 62keto2
PGF 1Αw as declined sign if ican t ly, the act ivity of p lasm inogen act iva to r inh ib ito r (PA I) and the level of en2
do thelin (ET ) w ere enhanced obviou sly, the act ivity of t issue p lasm inogen act iva to r ( t2PA ) and the level
of NO w ere declined sign if ican t ly in model group; the level of 62keto2PGF 1Αw as ra ised sign if ican t ly, the ac2
t ivity of PA I and t2PA , and the levels of ET and NO cou ld be regu la ted in the tet ram ethylpyrazine group.
Conclusion　 In the hypox ic model of p rim ary HUV EC s m ade in th is experim en t, EC s are in ju red, secret2
ing funct ion is declined, vasomo tion is ou t of con tro l. T etram ethylpyrazine cou ld p ro tect hypox ic EC s from
being in ju red, regu la te the secret ing funct ion of EC s and the vasomo tion. T he model cou ld p rovide a
m ethod fo r basic study and m edicine select ion of an t icoagu la t ion and fib rino lysis.
Key words: tet ram ethylpyrazine; endo thelia l cells (EC s) ; hypox ia; p ro stacyclin; t issue p lasm inogen
act iva to r ( t2PA ) ; endo thelin (ET )
·17·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
收稿日期: 2007204215
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30371789) ; 浙江省自然科学基金资助项目 (Z204424)
作者简介: 张国平 (1967—) , 男, 浙江嵊州市人, 主治医师, 医学硕士, 主要从事心脑血管病的中西医结合临床研究。
E2m ail: zhangguop ing@zj. com3 通讯作者　万海同　E2m ail: w anhaitong@zjtcm. net
　　血管内皮细胞 (EC ) 作为一种抗血栓形成细
胞, 其分泌的生物活性物质在抗凝、纤溶和抗血小板
活化等方面起着重要作用, EC 的损伤是心脑血管
等许多疾病的病理基础。本实验在建立人脐静脉内
皮细胞缺氧损伤模型的基础上, 观察了川芎嗪对其
抗凝和纤溶等功能的影响。
1　材料
111　材料及试剂: 新生儿脐带由浙江大学妇产科医
院提供。川芎嗪对照品购自中国药品生物制品检定
所。R PM I21640 培养液 (含青霉素 100 U ömL、链霉
素 100 ΛgömL、20% 小牛血清) , 用 T ris 调整 pH
值至 712～ 714; É 型胶原酶, 美国 Sigm a 公司产品;
新生牛血清由杭州四季青生物材料工程研究所提
供; 兔抗人Ð 因子抗体 (É 抗)、F ITC2羊抗兔2IgG
抗体 (Ê 抗) 由华美生物工程公司提供。CO 2恒温培
养箱 (BB 5060 型, H eraeu s 上海) ; 光学倒置显微镜
(CO IC)、倒置相差荧光显微镜, N ikon 公司; BX70
型荧光显微镜 (O lympu s, 日本) , b io 型酶标仪,
SN —682 型Χ2计数仪 (上海日环核仪厂)。
112　药品制备: 川芎经乙醇回流热提, 滤出提取液,
浓缩, 酸碱处理, 精制, 川芎嗪得率为 0153% , 质量
分数为 95% , 川芎嗪溶于不含小牛血清的培养液
中, 川芎嗪的终浓度为 0150 mmo löL (该剂量是根
据临床使用剂量换算并结合早期 EC 培养的预试验
结果而定)。
2　方法
211　正常人脐静脉原代 EC 制备: 参照 Jaffe 方
法[1 ] , 并加以改进。以 PBS (pH 值为 712～ 714) 冲
洗脐静脉管腔至洗出液无色透明, 再以 011% 胶原
酶 (pH 714) 作用 15 m in 后停止消化, 收集 EC, 计
数, 调整细胞浓度至 5×104ömL , 接种于 96 孔培养
板, 每孔 200 ΛL , 在 37 ℃、5% CO 2培养箱中静置培
养, 24 h 后进行第1 次换液, 加入 37 ℃ 预热的新鲜
培养液, 以后每隔 48 h 换液 1 次, 接种 3～ 4 d 后
EC 单层融合, 经相差倒置显微镜形态观察, 荧光显
微镜下进行人的Ð 因子免疫荧光抗体检查及生长曲
线均证明具有典型的 EC 特征。
212　人脐静脉原代 EC 缺氧损伤模型制备: 人脐静
脉原代 EC 培养达融合状态后, 更换无小牛血清的
培养液 (每孔 2 mL ) , 放入含 95% N 2、5% CO 2混合
气体的培养缸内 (缺氧环境) 培养 24 h。全量收集
该 EC 上清液, 离心 (1 000 rö10 m in) 除去培养液
中的细胞碎片, 置 - 20 ℃ 冰箱备用。血气分析表明
常氧和缺氧培养液上清液中氧分压分别为: 1617
kPa (125 mmH g) 和 218 kPa (21 mmH g)。正常组:
人脐静脉原代 EC 培养达融合状态后, 更换无小牛
血清的培养液 (2 mL ) , 继续在常氧环境中培养 24
h, 按上述方法, 收集培养液。
213　分组: EC 分为模型组、对照组、川芎嗪治疗
组。川芎嗪治疗组在 EC 培养达融合状态后, 在放入
含 95% N 2、5% CO 2混合气体的培养缸内 (缺氧环
境) 的 0 时, 更换含川芎嗪培养液, 其余操作同模型
组, 每孔 2 mL , 培养 24 h, 设8 个复孔。对照组正常
培养, 无缺氧, 其余同模型组。
214　检测指标及方法: 观察细胞形态及培养上清液
中的漂浮细胞情况。取各组培养液, 采用放免法测定
前列环素 (62keto2PGF 1Α) ; 采用发色底物法测定组
织型纤溶酶原激活物 ( t2PA ) 及其抑制物 (PA I) 活
性 (试剂盒购自福建太阳生物技术公司) ; 采用非平
衡放射免疫法测定内皮素 (ET ) 水平 (放免试剂盒
购自解放军总医院东亚免疫技术研究所) ; 采用酶法
测 NO 水平 (试剂盒购自南京建成生物工程研究
所) , 具体检测方法主要参照试剂盒说明进行。
3　结果
311　各组细胞培养上清液中漂浮细胞和 62keto2
PGF 1Α水平的变化: 表 1 显示, 模型组在缺氧 24 h
后, 漂浮细胞数显著高于对照组, 表明缺氧后 EC 受
损。与模型组相比, 川芎嗪组可显著降低漂浮细胞
数, 表明其对细胞在缺氧环境下的生长具有保护作
用, 保护 EC 在缺氧状况下的分泌功能。模型组在缺
氧 24 h 时, 62keto2PGF 1Α的量显著低于正常组, 表
明模型组缺氧后 EC 受损, 分泌功能下降。与模型组
相比, 川芎嗪组可显著提高 62keto2PGF 1Α的量, 对细
胞在缺氧环境下的生长具有保护作用。
表 1　各组细胞上清液中漂浮细胞数及 6-keto-PGF1Α
水平 (x±s, n= 8)
Table 1　Number of f loating cells and level of 6-keto-
PGF1Α in supernatan t of HUVECs in each
group (x±s, n= 8)
组　别 漂浮细胞 (细胞总个数×105·mL - 1) 62keto2PGF1Αö(pg·mL - 1)
对照 01062±01021 42316±65133
模型 01432±010723 3 21716±43133 3
川芎嗪 01142±01031△△ 36319±5512△
　　与对照组比较: 3 3 P < 0101
　　与模型组比较: △P < 0105　△△P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs con tro l group
　　△P < 0105　△△P < 0101 vs model group
312　川芎嗪对培养人脐静脉 EC PA I 和 t2PA 活
性及 ET 和NO 水平的影响: 表2 显示, 模型组在缺
·27· 中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月
氧 24 h 时, PA I 活性显著高于对照组, 而 t2PA 活
性显著低于对照组。与对照组相比, 模型组 PA Iöt2
PA 的值增高, 川芎嗪组 PA Iöt2PA 的值下降。提示
模型组缺氧后 EC 受损, 分泌功能失调, 纤溶功能减
弱。与模型组相比, 川芎嗪组可调节 PA I 与 t2PA 活
性, 对细胞在缺氧环境下的生长具有保护作用, 调节
EC 分泌功能。模型组在缺氧 24 h 时, ET 水平显著
高于对照组, 而 NO 的量显著低于对照组。提示模
型组缺氧后 EC 受损, 血管舒缩功能失调。川芎嗪组
可抑制缺氧后 EC 受损, 调节血管舒缩功能。
表 2　各组培养人脐静脉 EC 上清液中 PA I、t-PA 活性和
ET、NO 水平 (x±s, n= 8)
Table 2　Activ ity of PA I and t-PA , levels of ET and NO
in supernatan t of HUVECs in each group
(x±s, n= 8)
组　别
PA I 活性ö
(U ·mL - 1)
t2PA 活性ö
(U ·mL - 1)
PA Iö
t2PA ETö(pg·mL - 1) NO ö(Λmo l·mL - 1)
对照 01653±01056 01956±01081 01683 56171± 6120 35123±4185
模型 01939±010773 3 01614±010593 3 11529 93131±101233 3 20117±31783 3
川芎嗪 01857±01082 01876±01049△ 01978 70144±10198△△ 22136±3195
　　与对照组比较: 3 3 P < 0101
　　与模型组比较: △P < 0105　△△P < 0101
　　3 3 P < 0101 vs con tro l group
　　△P < 0105　△△P < 0101 vs model group
4　讨论
　　机体缺氧可使血管 EC 直接受损伤。如高原缺
氧病理检查时可见毛细血管平滑肌肥大; 毛细血管
EC 成阶段性肿胀, 胞核突向管腔内, 有空泡形成
(缺氧细胞损伤的标志) 和退变萎缩, 管腔受压而变
窄, 因此高原居民的血管 EC 易衰老和脱落[2 ]。在缺
氧条件下, EC 内 NO 和 Ca2+ 超载是其损伤的分子
机制之一。近年研究发现, 血管 EC 的缺氧性凋亡中
有NO 的参与[3 ]。缺氧是许多血管性疾病中常见的
病理现象, 缺氧可在以下几个主要方面造成对血管
EC 的损伤: 缺氧可使血管 EC 形态学发生改变, 主
要表现为线粒体肿胀、空化、嵴结构不清; 另一方面
缺氧可促使血管 EC 产生自由基, 通过对生物膜中
多价不饱和脂肪酸的氧化作用而引起细胞损伤; 缺
氧还对血管 EC 合成、释放 ET 和 NO 的功能也有
损伤作用; 血管 EC 在缺氧后可增加与血小板、血细
胞的黏附性, 增高血液凝固性[4 ]。对于心脑血管等疾
病, 保护血管 EC 免受缺氧性损伤具有十分重要的
意义。
ET 和NO 是最近几年才发现的器官局部血液
调节因子。目前认为,NO 和 ET 之间的平衡是体循
环调节和局部血流灌注的主要决定因素[5 ]。
EC 不仅具有屏障及物质转运功能, 而且还可
产生释放 t2PA、PA I、前列腺素 I2 (PG I2) 等生物活
性物质, 参与调控机体的凝血及纤溶平衡。PG I2是
EC 产生的前列腺素家族中的主要一员, 是迄今所
知最强烈抑制血小板聚集的生物活性物质, 主要基
于其激活腺苷酸环化酶, 升高细胞 cAM P, 而抑制
血小板聚集, 从而达到抗血栓作用。测定 PG I2体内
稳定代谢产物 62keto2PGF 1Α的量不仅可以反映抑制
血小板聚集性情况, 更可反映血管 EC 的损伤程度。
体外培养血管 EC 有贴壁生长的特性, 而一旦
EC 受到缺氧等损害, 就会影响它的部分功能, 最终
使其坏死漂浮[6 ]。本实验研究结果表明: 人脐静脉原
代 EC 缺氧损伤模型与对照组相比, 模型组培养液
中的漂浮细胞数显著增高, 62keto2PGF 1Α的量显著
下降; PA I 活性显著增高, t2PA 活性显著降低; ET
的量显著增高; NO 的量显著降低; 这表明本实验制
备的人脐静脉原代 EC 缺氧损伤模型存在着内皮细
胞受损, 分泌功能下降, 血管舒缩功能失调。本模型
可做为 EC 受损, 为进行抗凝和纤溶的基础研究和
药物筛选评价提供方法。
川芎嗪具有抑制缺血区血管 EC 黏附分子的表
达, 抗血栓形成、改善微循环的作用[7 ]; 通过增加
NO 释放保护内皮细胞损伤。川芎嗪可显著改善脑
缺血2再灌注损伤大鼠 ET、M DA 及脑超微结构的
异常变化。本实验研究也表明: 川芎嗪可显著降低漂
浮细胞数, 显著提高 62keto2PGF 1Α的量, 调节 PA I
与 t2PA 活性, 调节 ET、NO 的量。提示川芎嗪对
EC 在缺氧环境下的生长具有保护作用, 调节 EC 分
泌功能失调, 调节血管舒缩功能。
参考文献:
[ 1 ]　Jaffe E A 1 Synthesis an tihemophu ie facto r an tigen by cu l2
tu red hum an endo thelial cells [J ]1 J C lin Invest, 1973, 52:
2757227601
[ 2 ]　刘　郁, 张海鹏1 缺血缺氧性脑损伤病理机制 [J ]1 中华急诊
医学杂志, 2003, 12 (7) : 49624971
[ 3 ]　Endoh M , M aiese K, W anger J1 Exp ression of the in2ducib le
from of n itricox ide syn thase by reactive astrocytes after tran2
sien t globail ischem ia [J ]1 B ra in R es, 1994, 65 (1) : 221001
[ 4 ]　陈小容, 邹霞英, 辛达临1 缺氧性肺动脉高压大鼠肺血管内
皮细胞的变化 [J ]1 中国病理生理杂志, 1996, 12 (6) : 6082
6101
[ 5 ]　L erm an A , Burnett J C1 In ten t and altered endo thelium in
regu lation of vasomo tion [J ]1 C ircu la tion , 1992, 86 (6) : Ë 2
122191
[ 6 ]　胡大林, 廖建坤, 吴校连, 等 1 自由基与DNA 的氧化损伤
[J ]1 国外医学: 卫生学分册, 2002, 29 (5) : 2611
[ 7 ]　刘　勇, 许彦钢, 林　奇1 川芎嗪对脑血管内皮细胞 ICAM 2
1 表达的影响 [J ]1 西安医科大学学报, 1998, 19 (2) : 141
·37·中草药　Ch inese Traditiona l and Herbal D rugs　第 39 卷第 1 期 2008 年 1 月