全 文 ：·1514· 中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月
表达来上调Glut4的表达，完全不同于罗格列酮在
胰岛素的参与下上调CAP的表达从而促进Glut4
表达的作用机制。另外，还发现小檗碱能增加IR
3T3一L1脂肪细胞的葡萄糖消耗量，但对Glut4蛋
白的表达无影响，提示其改善IR的机制不同于梓
醇及罗格列酮通过上调Glut4蛋白的表达从而增加
细胞的葡萄糖消耗量。
本研究虽初步揭示了小檗碱、梓醇及其配伍改
善IR的部分机制，但值得提出的是，小檗碱不通过
上调Glut4的表达改善IR，梓醇通过何种途径上调
Glut4[9]，尤其是在没有胰岛素的情况下依然能上调
Glut4蛋白的表达该如何解释，均有待于做进一步
探讨。
参考文献：
Ell刘芳芳．杨明炜，王晓强，等．梓醇与小檗碱及其配伍对胰
岛素抵抗3T3一L1脂肪细胞的影响EJ3．中草药，2007，38
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E23AnilKumarKL．MaritaAR．Troglitazonepreventsand
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[D]．Taiwan：ChenggongUniversity。2003．
补阳还五汤有效组分对血管内皮细胞抗血栓功能及蛋白激酶C的影响
欧明娥，唐利文，邓常清。
(湖南中医药大学中西医结合学院，湖南长沙410007)
擅要：目的探讨补阳还五汤及其有效组分生物碱、苷对凝血酶诱导的血管内皮细胞抗血栓功能改变及蛋白激
酶C(PKC)活化的影响。方法以凝血酶(10U／mL)作用于培养的人脐静脉内皮细胞(ECV304)，同时加入药
物，24h后测定上清液中组织型纤溶酶原激活物(tPA)和纤溶酶原激活物抑制物一1(PAI一1)水平、细胞组织因子
(TF)、组织因子途径抑制物(TFPI)．、凝血酶调节蛋白(TM)mRNA表达及PKC。蛋白表达。结果凝血酶作用内
皮细胞后，tPA释放增加(尸<0．01)。，TF、TFPImRNA表达增强(P<0．05)，而PAl一1释放及TMtuRNA表达无
显著性变化(P>O．05)；PKC。表达增强(尸<0．05)。补阳还五汤可抑制凝血酶诱导的tPA释放增加(P生物碱对tPA释放增加无显著影响(P>0．05)l苷(1．25mg／mL)可使凝血酶诱导的tPA分泌增加(尸原方、生物碱(2mg／mL)和苷(5mg／mL)均可抑制内皮细胞分泌PAI一1(PmL)和苷均可抑制凝血酶诱导的TFmRNA表达增强；生物碱(O．5和1mg／mL)可抑制TFPImRNA表达
(尸增强(P<0．01)。PKC激活剂佛波酯(PMA)刺激内皮细胞后，PKC。被激活(P<0．01)lPKC抑制剂H，作用于
PMA刺激的内皮细胞后，PKC。表达增强不明显，PAR一1受体抑制剂CATG作用于凝血酶刺激的ECV304细胞
后，PKC。表达显著抑制(P<0．05)。结论凝血酶可诱导内皮细胞抗血栓性发生变化。补阳还五汤原方、生物碱和
苷对凝血酶诱导的血管内皮细胞抗凝、纤溶功能的改变具有调节作用，使血管内皮细胞的抗凝、纤溶作用趋于正
常，其作用可能主要是通过抑制凝血酶诱导的PKC。的激活而介导的。生物碱和苷类有效组分可能为该方抗血栓作
用的药效物质基础。
关键词：补阳还五汤l血管内皮细胞；组织型纤溶酶原激活物；纤溶酶原激活物抑制物一1；蛋白激酶C
中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)10—1514—07
收稿日期：2007—12-10
基金项目：国家自然科学基金项目(30572301)l教育部科学研究重点项目(204100)；湖南省教育厅重点资助项目(03A033)
作者简介：欧明娥(1982一)．女．湖南常德人，助教，医学硕士．主要从事心脑血管病临床基础研究．现在广东肇庆医学高等专科学校
工作。Tel：13527071045E—mail：ome202@126．corn
-通讯作者邓常清E—mail：dchangq@sohu．corn

万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月·1515·
EffectofBuyangHuanwuDecoctionanditsactivefractionona tithrombosis
inculturedvascularendothelialcellsandproteink aseC
0UMing—e，TANGLi—wen，DENGChang—qing
(CollegeofIntegrativeCh neseandWesternMedicine，HunanUnivesityofTraditional
ChineseMedicine，Changsha410007，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatethentithrombosiseffectofBuyangHuanwuDecoction(BHD)
anditsactivefractionsonculturedvascularendothelialcel s(VEC)followingthestimulationofthrombin
andtheirmechanism．MethodsThehumanumbilicusveinendotheliaIcells(ECV304)wereculturedin
mediacontaining10U／mLthrombinandifferentdoseseofdrugs．Thelev lsoftPAandPAI一1were
detectedbyELISA，theexpressionofTF，TFPI，andTMmRNAwasmeasuredbyRT—PCR，andthe
expressionofPKC。wasexaminedbyimmunohistochemicalstaining24hl ter．ResultsComparedtothe
controlwithoutanyreatment，thereleaseoftPAwasincreasedevidently(PofE—selectin，CD31andTF，TFPImRNAwasupregulated(PbeenfoundinthereleaseofPAI一1andthexpressionofTMmRNA(P>O．05)．Comparedtothedata
afterthemerestimulusofthrombin，eachdoseofBHDincreasedthreleaseoftPA(PthedosesofalkaloidhasignificanteffectonthereleaseoftPA(P>O．05)；Andglycoside(1．25mg／
mL)increasedthereleaseoftPA(PofBHDreducedthereleaseofPAI一1ofVEC(尸expressionofTFmRNAwasreducedbythetreatmentofalkaloid(1and2mg／mL)，alldosesofBHD。
andglycoside；AIkaloid(O．5，and1 mg／mL)downregulatedthexpressionofTFPImRNA(P<0．05)；
WhilenosignificantchangehadbeenfoundinthexpressionofTMmRNAafti!rthetreatmentofalldoses
ofdrugs．TheexpressionofPKCineachdrugtreatmentgroupwasgreatlydecreasedwhencomparedto
thatinthemerestimulusofthrombin(Pexpression(P<0．01)，H7(PKCinhibitor)couldinhibitPKC。activationsi mulatedbyPMA．The
expressionofPKC。stimulatedbythrombinwasi hibitedobviouslyafteraddingCATG(PAR一1inhibitor)
(P<0．05)．ConclusionThrombincouldinducethrombotic’changesinculturedVEC，including
anticoagulationandfibrinolyticfunctions．Thosechangescanbeadjustedothecontrollevelbythe
treatmentofBHD，alkaloid，andglycoside．BHDmayamelioratethe hromboticchangescausedby
thrombinthroughin ibitingheactivationofPKC．Thesimilareffectsofalkaloidanglycosideagainst
thrombosisind catethathesetwoconstituentsaretwoeffectivepharmacologicalc mponentsthrough
whichBHDplaysitsroleofantithrombosis．
Keywords：BuyangHuanwuDecoction(BHD)；vascularendothelialcell(VEC)；tissuepla minogen
activator(tPA)；plasminogenactivitornhibitor一1(PAI一1)Iproteink aseC(PKC)
血管内皮细胞(VEC)是位于血液与血管壁内
皮下组织之间的单层细胞，目前认为，VEC形态和
功能异常为动脉血栓形成的始动原因。研究显示凝
血酶除了参与凝血过程外，还对血管壁的生物学功
能产生许多影响，包括调节血管紧张度、血管平滑肌
细胞增殖、迁移和血管生长等[1]。已有研究表明，补
阳还五汤能提高正常或自由基损伤的VEC增殖能
力，减少脂质过氧化物的产生，使细胞分泌前列环
素、内皮素1功能趋于正常[2]。近期研究表明该方及
主要有效组分生物碱和苷可抑制FeCI。诱导的动脉
血栓形成，其作用与抗血小板活化、提高血中抗凝蛋
白活性、促进纤溶活性有关[3]，因而提示生物碱和苷
可能为其抗动脉血栓的有效物质基础之一。本研究
进一步以凝血酶一血管内皮细胞反应模型为对象，研
究补阳还五汤有效组分生物碱、苷对凝血酶诱导的
ECV304细胞抗血栓功能及蛋白激酶C(PKC)信
号途径的影响。
1材料
1．1人脐静脉内皮细胞(ECV304)：由武汉大学典
型物种保存中心提供。
1．2试验药物
1．2．1补阳还五汤的药物组成：补阳还五汤原方由
黄芪60g、赤芍9g、川芎6g、当归9g、地龙9g、红
花9g，桃仁9g组成。黄芪为豆科植物膜荚黄芪
Astragalusmembranaceus(Fisch．)Bunge的干燥
根，当归为伞形科植物当归Angelicasinensis

万方数据
·1516· 中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10,El
(Oliv．)Diels的干燥根，川I芎为伞形科植物川I芎
LigusticumchuanxiongHort．的干燥根茎，赤芍为
毛茛科植物芍药PaeonialactifloraPall．的干燥
根，桃仁为蔷薇科植物桃Prunuspersica(Linn．)
Batsch的干燥成熟种子，红花为菊科植物红花
CarthamustinctoriumsL．的干燥花，地龙为环节动
物门铂蚓科动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum
(Perrier)的干燥体。以上药材均由湖南中医药大学
药学院贺福元教授鉴定并提取。
1．2．2补阳还五汤的提取：按原方比例取药材，加
水浸泡，回流加热提取两次，提取时间分别为60和
40min，滤过，合并滤液浓缩至1g／mL(按生药
计)，加95％乙醇使醇量分别达80％和85％，搅
拌，摇匀，滤过，回收乙醇，加蒸馏水稀释，得原方水
提取液，相当于生药1g／mL。全方含黄芪甲苷
(0．378士0．0078)mg／g、芍药苷(1．1623±0．089
8)mg／g、苦杏仁苷(O．8973土0．0124)mg／g、川I
芎嗪(O．0106士0．0006)mg／g。
1．2．3各有效组分的提取分离：原方提取液采用酸
碱沉淀、离子交换树脂色谱等方法提取生物碱及苷
部分，两类有效部位分离完全，相互之间无混杂。经
HPLC测定苷类组分含黄芪甲苷(2．3943土0．158
7)mg／g、芍药苷(19．1132土0．2512)mg／g、苦杏
仁苷(17．9213土0．5638)mg／g；生物碱类组分含
川芎嗪(9．7601士0．0321)mg／g。上述药物使用时
以无血清RPMI一1640培养基配制。
1．3 主要试剂：PKC激动剂佛波脂(PMA)、PKC
抑制剂H，、蛋白酶活化受体一1(PAR一1)抑制剂组
织蛋白酶G(CATG)、凝血酶购自Sigma公司；
RPMI一1640培养基购自美国Hyclone公司；小牛血
清(FCS)购自杭州四季青公司；胰蛋白酶购自
Amresco公司。乳酸脱氢酶(LDH)活性试剂盒购
自南京建成生物工程研究所，组织型纤溶酶原激活
物(tPA)、纤溶酶原激活物抑制物(PAI一1)酶联免
疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海太阳生物技
术有限公司，Trizol核酸提取液购自GibcoBRL公
司；逆转录一聚合酶链式反应(RT—PCR)试剂盒为
TakaRaRNAPCRKit(Arnv)Ver3．0，购自大连
宝生物有限公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公
司合成。多聚赖氨酸、即用型SABC免疫细胞化学
试剂盒、DAB显色剂、兔抗人PKC。多克隆抗体均购
自武汉博士德生物工程有限公司。
2方法
2．1 细胞培养：将ECV304细胞株以0．125％胰
蛋白酶一0．02％EDTA消化，用RPMI一1640培养液
(含10％FCS、1×105U／L青霉素、1×105U／L链霉
素，pH7．2)制成1×105／mL细胞悬液，置于
37℃、5％CO：培养箱中培养，待细胞生长融合后，
用于以下实验。
2．2 不同浓度凝血酶对ECV304的刺激作用：以
不同浓度(1．25～20U／mL)凝血酶与ECV304细
胞共同孵育，以无血清RPMI一1640调总反应体积
为200pL，18h后，调零孔加Hank
7
s液，其余各孔
加20弘LMTT(5g／L)，37℃、5％C02中培养4h，
弃孵育液，每孔加二甲基亚砜150pL，室温振摇10
min后测定492nm处的吸光度(A)值，以A值反
映细胞的活力。同时取培养上清液按试剂盒说明测
定LDH活性。
2．3 药物的细胞毒作用：根据MTT法细胞毒实
验，以细胞毒活性值(抑制率)大于20％作为有显
著意义的细胞毒作用。补阳还五汤原方、生物碱和苷
均设立不同质量浓度，药物与ECV304在37℃、
5％C0。培养箱中共同孵育24h后，按上述MTT
法测定。每个药物质量浓度做5次实验，取平均值，
按抑制率=(1一试验组A值／对照组A值)X100％。
根据细胞毒实验确定后边实验所用药物的质量浓度。
2．4 对ECV304细胞分泌tPA、PAI一1的影响：培
养的ECV304融合后，随机分为对照组、凝血酶组、
生物碱(O．5、l、2mg／mL)组、苷(1．25、2．5、5mg／
mL)组和补阳还五汤原方(生药25、50、100mg／
mL)组。除对照组外，各组加入不同质量浓度药物
和凝血酶(10U／mI。)，置37℃、5％C0：中培养
24h。对照组加入等量培养基。取培养上清液，3000
r／min4℃离心10min后，以ELISA法测定tPA、
PAI一1的量。
2．5 组织因子(TF)、组织因子途径抑制物
(TFPI)、凝血酶调节蛋白(TM)mRNA表达的测定
2．5．1总RNA提取：细胞处理同2．4项方法，在6
孔培养板中加入0．8mLTrizol核酸裂解液，按一
步法提取细胞总RNA。用紫外分光法测A值进行
定量，并计算A：。。／A。。。值，提取的总RNA比值在
1．7-2．0，表明所得总RNA完整。
2．5．2RT—PCR：按RT—PCR试剂盒说明书进行。
①逆转录(RT)：分别加入总RNA、AMV逆转录酶
和逆转录反应体系进行RT反应。②聚合酶链式反
应(PCR)：加入PCR反应体系、上下游引物、超净
水进行PCR反应。TF上游引物为57一
AACACTTTCCTAAGCCTCC一3’，下游引物为57—

万方数据
中革葛ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月· 517·
ACTCATTTGCGTTTCCAT一37，扩增片段长度为
471bp；TFPI上游引物为51-CAGGAGCCAAC—
AGGAAAT一3’，下游引物为5’一CCACAGCCA—
GTATAGGTGA一37，扩增片段长度为500bp；TM
上游引物为5t-CATGTGCGAGACCGGCTAC—
CGGCTGGCGG一3’，下游引物为5’一AGGGGCT—
GGCACTGGTACTCGCAGTTGGC一37，扩增片段
长度为218bp；13-actin上游引物为5’一
GTGGACATCCGCAAAGAC一37，下游引物为57一
AAAGGGTGTAACGCAACTAA一37，扩增片段长
度为302bp。TF反应条件：94℃、5min，94℃、30
s，55℃、30s，72℃、45s，30个循环，72℃延伸10
min。TFPI、肛actin反应条件：94℃、5rain，94℃、30
s，51℃、30s，72℃、45s，30个循环，72℃延伸10
min。TM反应条件：94℃、5rain，94℃、40s，61℃、
45s，72℃、40s，30个循环，72℃延伸5min。③电
泳及分析：PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，用
DU640光密度扫描仪(美国BeckmanCoulter产)、
LabWorks3．0凝胶图像分析软件(美国UVP公司
产)检测出阳性表达产物和13-actin的表达强度，按
如下公式计算相对强度：相对强度一标志物表达强
度／p-actin表达强度，相对强度越大，表达强度越高。
2．6 对ECV304细胞PKC。表达的影响：分组同
2．4项，细胞接种时，于24孔培养板中加入1cm×
1 cm经多聚赖氨酸处理的玻片，待细胞亚融合后，
加入各组药物和凝血酶，37℃、5％C0：中培养24
h，弃上清液，PBS清洗，4％多聚甲醛磷酸缓冲液
(pH7．4)固定，晾干后以免疫细胞化学法测定
PKC。表达，并进行图像分析，结果以灰度值表示，灰
度值越低，表示细胞PKC。表达越强。
此外，为分析补阳还五汤有效组分对PKC。表
达作用的特点，比较了有效组分与不同抑制物对
PKC。表达的影响。细胞分为对照组、凝血酶(10U／
mL)组、PMA(100nmol／L)组、凝血酶+H7(100
pmol／L)组、PMA+H，组、凝血酶+CATG(40
ITIU／mL)组、凝血酶+原方(50mg／mL)组、凝血
酶+生物碱(2mg／mL)组、凝血酶+苷(5rag／
mL)组。培养24h后同前测定PKC。表达强度。
2．7 统计分析：数据均用；士s表示，采用
SPSSl2．0软件进行分析。多组间比较用单因素方
差分析，组问两两比较方差齐时用LSD检验，方差
不齐时用秩和检验。
3结果
3．1 不同浓度凝血酶对ECV304的影响：正常
ECV304细胞呈菱形或多边形，直径约为30～60
弘m，单层铺路石样排列；凝血酶浓度为10U／mL
时，细胞收缩变圆，细胞间隙增大；凝血酶浓度为20
U／mL时，除细胞收缩变圆和间隙增大外，可见部
分细胞核固缩、死亡。凝血酶为1．25～15U／mL
时，可使M T的A值降低，LDH活性升高；在凝
血酶为10～15U／mL时，MTT的A值降低、LDH
活性升高明显(图1)。故本实验选定凝血酶终浓度
为10U／mL。
O．9
O．6
O．3
O
图l凝血醇对ECV304细胞活力和LDH活性的影响
(；士s。n=8)
Fig．1Effectof hrombinonvitalityandLDHactivity
ofECV304cells(；士$。厅=8)
3．2药物的细胞毒作用：生物碱2。0mg／mL时细
胞毒活性小于20％，故实验时生物碱终质量浓度最
大为2mg／mL；苷5．0mg／mL时细胞毒活性值小
于20％，拟定实验时苷终质量浓度最大为5rag／
mL；原方基本上无细胞毒性，拟定原方终质量浓度
最大为100mg／mL。
3．3 对凝血酶诱导的ECV304细胞分泌tPA和
PAI一1的影响：凝血酶刺激细胞24h后，培养液中
tPA水平升高(P变化(P>0．05)。生物碱3个剂量对凝血酶诱导的
tPA分泌增加无显著影响(P>0．05)；苷5、2．5
mg／mL剂量对tPA分泌增加也无显著影响(P>
0．05)，苷1．25％mg／mL组其tPA水平显著高于
对照组(P0．05)。原方3个剂量对tPA分泌增加呈显著抑制
作用(P著低于对照组(尸组PAI一1水平也显著低于凝血酶组(P<0．01)‘苷
2．5、5mg／mL组PAI一1水平均低于对照组(P<
0．05、0．01)，苷5mg／mL组PAl一1水平也低于凝
血酶组(P降低，显著低于对照组(P<0．01)和凝血酶组
抛
咖
咖
鲫
枷
抛
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一I．1-n)＼掣烬士凸rI

万方数据
·1518· 中草喃 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年lo月
(P3．4 对凝血酶诱导的ECV304细胞TF、TFPI、
TMmRNA表达的影响：各目的基因电泳图谱见图
2。凝血酶刺激ECV304细胞24h后，细胞TF、
TFPI表达均增强(P<0．05)，TM表达无显著性
变化(P>o．05)。生物碱终质量浓度1、2mg／mL
时可抑制凝血酶诱导的TFmRNA表达(P<
0．05)；苷3个剂量组和原方3个剂量组均可抑制
TFmRNA表达，生物碱1、2mg／mL可抑制凝血
酶诱导的TFPImRNA表达(P<0．05)；而苷和原
方对TFPImRNA表达无显著影响(P>O．05)。各
药对TMmRNA表达均无显著性影响。半定量结
果见表2。
3．5 对凝血酶诱导的ECV304细胞PKC。表达的
影响：凝血酶刺激细胞24h后，PKC。灰度值显著低
于对照组(-P<0．01)，而其他各药物组与对照组比
裹l 补阳还五汤及其有效部位对凝血酶刺激ECV304
细胞tPA和PAl—l水平的影响(工士s，詹=6)
TableEffectsofBHDanditsactivefraction
onlevelsoftPAandPAI—linECV304
cellsstimulatedby hrombin(；士s，一=6)
与对照组比较：。P<0．05一P<0．01
与凝血酶组比较：Ap<0．05AAp<0．01
。P<0·05。P<0·01wcontrolgroup
△P<0．05△△P<0．01口5thrombingroup
A一各自的基因表达图谱融各组各自的基因表达图谱M—Marker1一对照组 2一凝血酶组 3～5一生物碱组(2．1，0．5mg·lIlL一1)
6～8一苷组(5、2．5、1．25nag·mL-1)9～1卜原方组(100、50、25mg·mL一1)
A—GramofeverytargetedgeneB-GramoftargetedgeneineverygroupM—Marker1一controlgroup2-thrombingroup
3—5一alhloidsgroup(2，l，and0．5mg·mL一1)6—8一glycosidesgroup(5．2．5，and1．25mg·mL一1)
9—11一BHDgroup(100，50·and25mg·mL一1)
圈2各目的基因RT—PCR电泳图谱
Fig．2RT-PCRElectrophoregramofeverygenetargetedingroups
寰2补阳还五汤及其有效部位对凝血酶刺激ECV304细胞TF、TFPI、TMmRNA表达及PKC。寰达的影响(；士S，万=5)
Table2 EffecXsofBHDanditsactivefractiononexpressionofTF，TFPI．TMmRNA，andPKC。
InECV304cellsstimulatedby hrombin(工±I，矗一5)
组 别 药物剂量p／(mg·mL．1)TF／B-actinTFPl／13-actinTM／争actin PKC。灰度值
对照 一0．69土0．100．88士0．15 0．43士0．12 128．40士13．77
凝血酶 一0．89士0．06。1．06士0．18。0．48±0．1791．68士13．77·-
生物碱0．5 0．71士0．05 0．93士0．08／1 0．43士0．12 107．72士29．04
1 ’0．58士0．12’△0．93士0．10A0．36士0．13 107．96±15．98
2 0．64士0．11A 1．00±0．27 0．42士0·16 115．22土10．66A
苷 1．25 0．67士0．24A 1．11土0．24。0．37士0．1216．18士27．55A
2．5 0．69士0．12△0．99士0．180．35土0．11 121．20士15．91A
5 0．69±0．07△A 0．98士0．07 0．30士0．07 129．84土13．77AA
原方 25 0．52士0．12。。△△ 1．01士0．24 0．41士0．18 111．72±13．72
50 0．59士0．17△△ 1．12士0．15。0．46士0．1819．28士17．274
111 1：i!圭!：!i：竺 !：!!圭!：!! !：i!圭!：!! !!!：j!圭!!：!!全
与对照组比较：‘P<0．05一P<0．01l与凝血酶组比较：zxp<0．05Ap<0．01
。P
万方数据
中草焉 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月·1519·
较差异无显著性意义(P>O．05)；生物碱2mg／mL
组，苷3个剂量组，原方50、100mg／mL组PKC。灰
度值均显著高于凝血酶组(P表2。
凝血酶刺激细胞24h后，PKC。灰度值显著低
于对照组(P<0．01)；PKC激活剂PMA刺激
ECV304后，PKC。灰度值显著低于对照组(P<
0．01)；PKC抑制剂H，作用于PMA刺激的
ECV304后，PKC。灰度值显著高于PMA组和凝血
酶组(P细胞后，PKC。灰度值仍显著低于对照组(尸<
0．05)fCATG作用于凝血酶刺激的ECV304细胞
后，PKC。灰度值显著高于凝血酶组(P<0．05)；原
方、生物碱和苷组与凝血酶组比较，PKC。灰度值均
显著升高(P性意义(P>0．05)。见表3。
衷3补阳还五汤及其有效组分与各工具药比较对
ECV304细胞PKC。表达的影响(；士$。n=5)
Table3 EffectofBHDanditsactivefractiononexpression
ofPKC。ofECV304cellscomparedwitheverytool
medIcine(；士s，疗=5)
组别 剂量PKC。灰度值
对照
凝血蠢
PMA
凝血酶+H7
PMA+H，
凝血酶+CATG
凝血酶+原方
凝血酶+生物碱
凝血酶+苷
一 146．51士Z8．06
10U·mL一1 111．82士23．48。’
100rlmo卜口lL—l 119．35士23．44。。
10U·mL一1+100”∞I·L一1127．21士32．65‘
100mOl·L一1+100岫ol·L一1133．32士29．08△
10U·mL一1+40mU·mL一1132．44士22．04△
10U·mL一1+50lIIg·mL～138．71士29．09△△
10U·mL一1+2rag·mL一142．58士16．67△△
10U·mL一1+5rag·mL一152．17士18．46t,t,
与对照组比较：。P与凝血酶组比较l△尸<0．05AAp。P<0．05。P<0．01TJ$controlg up
Ap<0．05LAp<0．01TJ$tMombingroup
4讨论
在动脉栓塞性疾病中，血栓形成大多是在VEC
受损的基础上发生的。VEC在阻止非适应性凝血发
生、维持血管壁的完整性、调节内皮下血管平滑肌细
胞的收缩及控制大分子和炎症细胞透过血管壁等方
面起重要作用[‘’5]。VEC可合成分泌前列环素
(PGI。)、tPA、TM等抗凝抗栓物质，对抗血栓形成；
又可合成分泌yonWkllebrand因子(vWF)、表达
TF等，参与凝血和血栓形成[6]。生理状态下，VEC
以抗栓功能为主，当血管受损或VEC损伤时，VEC
转变为以促栓功能为主。因而，保护VEC功能、促
进其抗栓功能为血栓性疾病防治的重要措施。
凝血酶为凝血级联反应过程中的关键酶，研究
表明，凝血酶除可使纤维蛋白原转变为纤维蛋白外，
还具有多种生物学功能，可促进内皮细胞活化和分
泌促血栓物质[7]。有研究表明，凝血酶能增强VEC
的通透性，且这种反应与内皮细胞收缩反应一致[8]。
tP 主要由VEC合成释放，它通过与结合于血栓
中的纤溶酶原结合，起纤维激活作用．从而使血栓局
部的纤维蛋白溶解，而不引起全身的纤溶酶原激活。
PAI一1是tPA的快速抑制剂，可由VEC合成和分
泌。两者能够在血液中以1。1的比例形成稳定的
复合物，从而维持纤溶平衡[9]。本实验结果表明凝血
酶可使ECV304释放tPA增加，对PAI一1的释放
无影响。已知凝血酶作用于VEC后，VEC产生反应
性变化，分泌释放tPA增加。补阳还五汤原方可抑
制凝血酶诱导的tPA释放，提示原方对凝血酶诱导
的tPA释放有抑制作用。而生物碱和苷对tPA的
释放无显著影响，并且苷(1．25mg／mL)可促进
tPA释放，表明苷和生物碱对tPA的释放无抑制作
用，这可能有利于在局部促进血栓溶解。生物碱、苷
和原方均可抑制VEC的PAl一1释放，提示该方及
有效组分生物碱和苷可降低VEC的纤溶抑制活
性，从而使其纤溶活性提高，对促进局部血栓溶解有
重要意义。
TF在凝血过程中的作用是作为因子Vl(Vla)
的辅因子而启动外源性凝血过程。TFPI通过依赖
于因子xa的方式抑制TF—FvIa复合物活性，阻止
xa和IXa因子的产生而发挥抗凝作用，它是一种
Kunitz丝氨酸蛋白水解酶抑制剂，通过结合并灭活
Xa因子，及与TF—FⅦa复合物结合xa因子形成
TF—FⅥa—Fxa—TFPI复合物来抑制凝血酶和纤维
蛋白的产生口0。。本实验结果表明，凝血酶刺激后，
TF、TFPImRNA表达均增强，提示凝血酶刺激
VEC后，可使VEC产生反应性变化，表达TF和
TFPI增强。生物碱(1、2mg／mL)、苷3个剂量、原
方3个剂量TF表达均低于凝血酶组，表明补阳还
五汤及生物碱、苷对凝血酶诱导的TF表达具有抑
制作用，可在转录水平抑制TF表达，从而抑制凝血
酶导致的VEC促凝活性增强。而各药物中仅生物
碱(0．5、1mg／mL)可部分抑制凝血酶诱导的
TFPImRNA表达。表明补阳还五汤及生物碱、苷对
凝血酶诱导的TFPImRNA表达无明显抑制作用，
这对于对抗VEC的促凝作用，抑制血栓形成具有
重要的意义。TM作为内皮细胞表面一种具有很强
抗凝活性的糖蛋白，其能结合凝血酶，使之不能水解

万方数据
·1520· 中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第10期2008年10月
纤维蛋白原，同时TM结合凝血酶后可进一步活化
蛋白C系统发挥抗凝作用[1¨。本实验结果表明，补
阳还五汤原方、生物碱、苷对TMmRNA表达无显
著影响，表明该方及有效组分的抗血栓作用不是通
过TM介导的。
凝血酶不仅在凝血过程中起主导作用，还可以
通过细胞表面的凝血酶受体一蛋白酶活化受体
(PAR)介导分子和细胞间相互作用，引起广泛的生
物学效应，凝血酶受体启动细胞内信号经典的途径
是通过偶联Gq蛋白激活磷脂酶C一8(PLC一8)，裂
解磷酯酰肌醇生成三磷酸肌醇(IP。)和二酰甘油
(DAG)，前者引发Ca2+动员，后者激活PKC和其
他Ca2+敏感蛋白。PKC为凝血酶诱导VEC活化的
重要途径。有研究发现，PKC的激活可促进VEC的
TF和TFPI释放，它可能通过258位点的丝氨酸
磷酸化参与信号传递途径[121。本研究结果表明，凝
血酶刺激ECV304后，PKC。表达增强，表明VEC
在受到凝血酶刺激时PKC。被激活；生物碱2mg／
mL组、苷3个剂量组、原方50、100mg／mL组
PKC。表达减弱，提示补阳还五汤及其有效组分生
物碱、苷对凝血酶诱导的ECV304细胞PKC。激活
具有抑制作用，该方及有效组分生物碱和苷可能通
过抑制PKC。活化而达到对抗凝血酶诱导的VEC
抗血栓特性异常的作用。进一步研究表明，PKC激
活剂PMA刺激ECV304细胞后，PKC。也被激活；
PMA抑制剂H，作用于PMA刺激的ECV304细胞
后，PKC。表达增强不明显，说明H，对于PMA刺激
的PKC。表达增强有明显抑制作用。但实验同时表
明H，对于凝血酶刺激的PKC。表达增强并无明显
抑制作用，这提示凝血酶诱导的PKC。激活可能与
PMA不同，可能有其他信号传导途径参与。PAR一1
抑制剂CATG作用于凝血酶刺激的ECV304细胞
后，PKC。表达显著抑制，表明CATG对于凝血酶刺
激的PKC。表达增强有明显抑制作用，CATG通过
在受体环节阻断了凝血酶与PAR一1结合，从而阻
断了其下游信号的传递。原方、生物碱和苷均可抑制
保
凝血酶诱导的ECV304细胞PKC。表达的增强，进
一步证实了原方可通过抑制PKC。途径的激活而发
挥抗血栓作用，生物碱和苷可能是其发挥作用的有
效物质基础，对PKC信号途径的抑制作用可能是
该方及其有效组分作用的主要环节。而补阳还五汤
及其有效组分究竟是通过何种机制抑制凝血酶诱导
的PKC激活的，还有待于今后进一步阐明。
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护 环 境 保 护 被

万方数据
补阳还五汤有效组分对血管内皮细胞抗血栓功能及蛋白激酶
C的影响
作者： 欧明娥， 唐利文， 邓常清， OU Min-ge， TANG Li-wen， DENG Chang-qing
作者单位： 湖南中医药大学,中西医结合学院,湖南,长沙,410007
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(10)
被引用次数： 5次

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