全 文 ：膏制备工艺得到醇提浸膏干燥粉末 6批，分别精密称取醇提浸膏干
燥粉末约 10． 00 mg，按“2． 1”项下的制备方法，再按“2． 3”项下方法测
定吸光度，从线性回归方程中计算出供试品总黄酮含量(以芦丁计)，
结果芦丁平均含量为 31． 54%，RSD为 1． 27%(n =6)。
3 讨论
紫外 －可见分光光度法是鉴定黄酮类化合物的一种重要技
术［4］，芦丁与其它黄酮类化合物一样，在碱性条件下可与多种金
属盐类试剂如与 Al3 +络合，并在波长 510 nm 有最大吸收［5，6］，因
此，芦丁可作为标准样品代表黄酮定量。本实验以亚硝酸钠 －硝
酸铝 －氢氧化钠为显色体系，采用紫外 －可见分光光度法测定莲
威阿那奇处方醇提浸膏中总黄酮的含量，操作简便，线性关系良
好，测定范围宽，其准确度与精密度均能满足需要，可用于莲威阿
那奇颗粒剂生产过程中的质量控制。
参考文献:
［1］ 袁晓凡，赵 兵，王玉春． 雪莲的研究进展［J］． 中草药，2004，35
(12) :1424．
［2］ 翟科峰，段 红，邢建国，等．天山雪莲提取物纯化前后各部位抗炎
镇痛作用［J］．中国医院药学杂志，2010，30(5) :374．
［3］ 左爱华，韦群辉，曾元儿，等．紫外可见分光光度法测定青刺尖总黄
酮含量［J］．云南中医中药杂志，2008，29(6) :43．
［4］ 马陶陶，张群林，李 俊．中药总黄酮的含量测定方法［J］． 安徽医
药，2007，11(11) :1030．
［5］ 陶剑美，范晓萍，钱亚芳，等．分光光度法测定醒脾养儿颗粒中总黄
酮的含量［J］．中国医院药学杂志，2007，27(6) :845．
［6］ 陈 晶，杨丽琴，马全武．降脂颗粒的制备及质量控制［J］． 海峡药
学，2006，18(4) :41．
收稿日期:2012-05-06; 修订日期:2012-07-29
基金项目:广西壮族自治区科学研究与技术开发计划项目
(No． 0719006 － 2 － 27;No． 0992025 － 22) ;
广西壮族自治区自然科学基金 (No． 0991137)
作者简介:蒋 皓(1990-) ，男(汉族) ，广西南宁人，现为清华大学化学工
程与生物工程系学在读本科生．
* 通讯作者简介:庞 辉(1962-) ，女(汉族) ，广西博白人，现任广西医科
大学基础医学院教授，硕士研究生导师，硕士学位，主要从事海洋药物与
中草药研究工作．
螺旋藻激酶的酶学性质研究
蒋 皓1，陈高斯2，庞 辉2* ，肖云晓2
(1．清华大学，北京 100084; 2．广西医科大学，广西 南宁 530021)
摘要:目的 研究螺旋藻激酶的酶学性质。方法 螺旋藻激酶通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G － 75 凝胶过滤层析、冷冻
干燥法从螺旋藻激酶发酵粗提物中纯化而来，用纤维蛋白平板法测定其纤溶活性，研究螺旋藻激酶的作用方式及温度、
pH和抑制剂对其纤溶活性的影响。结果 螺旋藻激酶能直接溶解纤维蛋白;它在 45℃时活性最高，最适反应温度范围为
45 ～ 55℃;最适反应 pH为 8，pH6 ～ 10 内稳定性较强;EDTA和 DTT对螺旋藻激酶活力无明显影响，而 PMSF 能完全抑制
其活性。结论 螺旋藻激酶热稳定性强，适宜碱性的环境。螺旋藻激酶是一种丝氨酸蛋白酶，结构中不含二硫键。
关键词:螺旋藻激酶; 酶学性质
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 10． 055
中图分类号:R962 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2012)10-2512-02
近年来，随着人们生活水平的提高，血栓病发病率逐年提高，
已经成为我国人口死亡的首位原因。当前，治疗血栓病的主要方
法是溶栓疗法，即注射溶栓剂或口服溶栓药物使血管再通。但是
临床上使用的溶栓药物主要是尿激酶(UK)、链激酶(SK)、重组
组织型纤溶酶原激活剂等［1］，它们大多为注射用药，作用时间
短，使用不便，且特异性差、副作用大、半衰期短。所以开发新型
的高效，低毒，经济的溶栓药物迫在眉睫。螺旋藻(spirulina)属
于原核生物，在广西北海广泛养殖，它具有增强免疫力、抗辐射、
抗疲劳等药理作用，现在已经开发出具有多种功效的天然绿色保
健品［2］。我们经筛选特殊菌种，发酵酶化产生了含蛋白激酶的
特殊螺旋藻粉，并分离纯化了其中的蛋白激酶(称为螺旋藻激
酶，spirulina kinase SPK)。经初步实验，SPK 具有良好的溶栓作
用［3，4］。本实验以分离纯化得到的螺旋藻激酶为材料，通过温度
的变化、pH的变化、抑制剂等的影响，研究螺旋藻激酶在不同的
环境中的理化性状及酶学性质。
1 材料与仪器
1． 1 原料与试剂 螺旋藻激酶发酵提取物粉剂，由广西北海市康
福保健食品有限公司提供;苯甲基磺酰氟(PMSF)分析纯，上海生
工生物工程有限公司产品;乙二胺四乙酸(EDTA)分析纯，中国
上海惠兴生化试剂公司产品;二硫苏糖醇(DTT)分析纯 ，德国
Merck公司产品。
1． 2 仪器 3K15 型高速冷冻离心机，SIGMA 公司产品;FD － 1D
－50 型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司产品;pH S －
25 数显 pH 计(上海精密仪器有限公司产品;GradiFrac P － 50 型
蛋白质层析系统，Pharmacia Biotech 公司产品;UV － 1700 型岛津
紫外可见光分光光度计，日本岛津公司产品。
2 方法
2． 1 螺旋藻激酶的分离纯化 将螺旋藻激酶发酵液 4℃下离心，
上清液饱和硫酸铵分级盐析，沉淀物经脱盐透析和 SephadexG －
75 凝胶层析并冷冻干燥等步骤进行分离纯化［5］。依照 Astup 文
献［6］报道的纤维蛋白平板法测定酶的纤溶活性。
2． 2 螺旋藻激酶的最适温度 用纤维蛋白平板法测定 SPK 酶液
在 25，37，45，50，60，70 ℃条件下的相对酶活［5 ～ 9］。
2． 3 螺旋藻激酶的温度稳定性 将 SPK溶液置于不同的温度下
(25 ～ 70℃)保温后测酶活［5 ～ 9］。
2． 4 螺旋藻激酶的最适 pH 配制不同 pH的缓冲液(pH4． 0 ～7． 0
的柠檬酸 －柠檬酸钠缓冲液;pH7． 0 ～ 9． 0 的 Tris －盐酸缓冲液;
pH9． 0 ～10． 6的甘氨酸 －氢氧化钠缓冲液;pH10． 6 ～ 12． 0 磷酸氢
二钠 －氢氧化钠缓冲液)。将纤维蛋白平板切割成小块浸泡其中，
然后测定 SPK的相对酶活［5 ～9］。
2． 5 螺旋藻激酶的 pH 稳定性 配制上述不同 pH 的缓冲液，与
SPK酶液混合，37℃水浴 40 min后测定酶活［5 ～ 9］。
2． 6 螺旋藻激酶的作用方式 取纤维蛋白平板切成两半，在两块
·2152·
时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 10
平板上皆点样螺旋藻激酶和尿激酶，同时放入 37℃培养箱中保
温，观察效果［5 ～ 9］。
2． 7 抑制剂和变性剂对酶活的影响 将 SPK 液分别加入 PMSF
中 配成 10 mmol /L和 1 mmol /L的 PMSF的酶液。用同样的方法
分别配制含 10 mmol、1 mmol EDTA和 10 mmol、1 mmol DTT的酶
液，然后吸取各抑制剂加入纤维蛋白平板，以不含抑制剂的 SPK
液作为对照，37℃保温 1 h后测活力［5 ～ 9］。
3 结果
3． 1 最适温度 如图 1 所示，SPK 最适温度为 45℃;是其最适反
应温度范围为 45 ～ 55℃。
图 1 温度对螺旋藻激酶活力的影响
3． 2 温度对稳定性的影响 如图 2 所示:在 25 ℃和 37 ℃下酶失
活并不明显，超过 50 ℃酶活损失很快，70 ℃下活力完全丧失。
图 2 螺旋藻激酶在不同温度下的稳定性
3． 3 最适 pH 如图 3 所示，随着 pH值的升高，螺旋藻激酶的相
对活性逐渐增高，在 pH 值为 8 的时候达到最高值，因此螺旋藻
激酶最适反应 pH为 8，最适 pH值范围为 pH 8 ～ 9。
图 3 pH对螺旋藻激酶活力的影响
3． 4 pH对稳定性的影响 如图 4 所示，螺旋藻激酶在 pH 6 ～ pH
10的范围内稳定性较强，pH 9 的时候酶活最高，低于 pH 6 或超
过 pH 10，稳定性较差。
图 4 螺旋藻激酶在不同 pH下的稳定性
3． 5 螺旋藻激酶的作用方式 由图 5 可见，尿激酶在平板上没有
形成透明溶圈，而螺旋藻激酶形成了两个溶圈［7］。
图 5 螺旋藻激酶和尿激酶对纤维蛋白平板和加热平板的溶解作用
3． 6 抑制剂和变性剂对酶活的影响 由表 1 可见，1 mmol /L
PMSF即可完全抑制螺旋藻激酶活性。而 EDTA 和 DTT 也不能
改变螺旋藻激酶活性［5，8，9］。
表 1 抑制剂和变性剂对螺旋藻激酶活性的影响
抑制剂和变性剂 浓度 /mmol·L －1 相对酶活(%)
PMSF 1 0
PMSF 10 0
EDTA 1 100
EDTA 10 100
DTT 1 100
DTT 10 100
4 讨论
本文探讨了螺旋藻激酶的部分酶学性质，结果表明螺旋藻激
酶的热稳定性高，其最适温度为 45℃，低于 50℃时有较好稳定
性。它的最适反应 pH为 8，pH 6 ～ 10 的范围内稳定性较强，应在
偏碱环境下保存，但其在酸性条件下，酶活性也不完全被抑制。
与尿激酶相比，螺旋藻激酶能形成的两个溶圈，说明它溶解纤维
蛋白的作用方式与尿激酶不同，具有直接降解纤维蛋白的作用。
PMSF是一种典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，它可完全抑制螺旋藻
激酶活性，表明螺旋藻激酶是一种丝氨酸蛋白酶。EDTA 对酶的
活性都无影响，证明螺旋藻激酶不是金属蛋白酶。DTT不能改变
螺旋藻激酶活性，证明螺旋藻激酶结构中不含二硫键。因此，螺
旋藻激酶具有开发成新一代口服溶栓药物的市场潜力。
参考文献:
［1］ Nordt TK，Bode C． Thrombolysis:newer thrombolytic agents and their
role in clinical medicine［J］． Heart，2003，89(11) :1358．
［2］ 田永云．螺旋藻的药理研究进展［J］．实用医技杂志，2007，14(20) :
2830．
［3］ 陈高斯，李小花，庞 辉，等．螺旋藻激酶提取物对血栓形成的影响
［J］．中国老年学杂志，2009，29(12) :1462．
［4］ 李小花，陈高斯，庞 辉，等．螺旋藻蛋白激酶提取物对血栓形成的
抑制作用［J］．中国公共卫生，2009，25(3) :337．
［5］ 范 强，姚文兵，高向东，等．纳豆激酶分离纯化及其性质研究［J］．
中国天然药物，2005，3(2) :124．
［6］ Astup T，Mullertz S． The fibrin plate method for estimating fibrinolytic
activity［J］． Biochem Biophys，1952，40:346．
［7］ Yong Peng，Qing Huang，Ren － huai Zhang，et al． Purification and char-
acterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amyloliquefa-
ciens DC － 4 screened from douchi，a traditional Chinese soybean food
［J］． Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry
and Molecular Biology，2003，134(1) :45．
［8］ Min － Ma A，Jun － Shan L． Partial characterization of a hydrophytic pro-
tein Po． HYD1 purified from the oyster mushroom Pleurotus ostreatus
［J］． World J Microbiol Biotechnol，2008，24(10) :501．
［9］ PARK SE，LI MH，Kim JS，et al． Purification and characterization of a
fibrinolytic Protease from a culture Supernatant of Flammulina velutipes
Mycelia［J］． Biosci． Biotechnol． Biochem，2007，71(9) :2214．
·3152·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 10 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 10 期