全 文 ：第 28卷第 2期　 　　　　　　　　　　　　　　　　中南民族大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol. 28 No. 2
2009年 6月　　　　　　　　　　 Journal of Sou th-Cen tral Universi ty fo r Nationali ties( Nat. Sci. Edi tion )　　　　　　　　　　 Jun. 2009
　　收稿日期　 2009-02-27
　　作者简介　刘　钊 ( 1978-) ,女 ,讲师 ,研究方向: 中药抗病毒 , E-mail: fanfang fei@ yahoo. com. cn
　　基金项目　中南民族大学自然科学基金资助项目 ( YZQ05011)
中药大青叶有效单体抗柯萨奇病毒作用
刘　钊 1 ,杨占秋 2 ,肖　红 2
( 1中南民族大学 药学院 ,武汉 430074; 2武汉大学 医学院病毒学研究所 ,武汉 430071)
摘　要　采用中药大青叶有效单体进行体外抗柯萨奇病毒 B3( CVB3 )的研究 ,通过观察病毒引起的细胞病变效应
( CPE)、 M TT法检测细胞活性 ,作为考核药物抗病毒作用 .结果表明:大青叶有效单体 1# , 2# , 3# , 4# 对 CVB3无直
接灭活作用 ,也不能阻止 CV B3的吸附 ,而能抑制 CVB3在 Hep-2细胞内的的生物合成 .其半数抑制浓度 ( IC50 )分别
为 30. 75, 28. 54, 35. 31, 26. 15 mg /L ,治疗指数 ( TI )分别为 6. 51, 9. 71, 8. 24, 14. 96. 其抗 CVB3效果优于病毒唑
( IC50= 103. 13 mg /L , TI= 5. 22) ,和抗病毒口服液 ( IC50= 105. 44 mg /L , TI= 5. 02) , P> 0. 01.在 2～ 128 mg / L范
围内大青叶 1# , 2# , 3# , 4# 单体与 CV B3抑制率呈明显的量效关系 (P < 0. 01) ,在 128 mg / L时能抑制 CV B3在 Hep-2
细胞内的增殖达 90%左右 .大青叶有效单体 1# , 2# , 3# , 4# 能安全高效地抑制 CVB3在 Hep-2细胞中的增殖 .
关键词　大青叶 ;单体 ;柯萨奇病毒 ;抗病毒作用
中图分类号　 Q523+ . 3　文献标识码　 A　文章编号　 1672-4321( 2009) 02-0041-05
Antiviral Activity of the Effective Monomers from Folium
Isatidis against Coxackievirus B3 Virus in Vitro
Liu Zhao
1 , Yang Zhanqiu
2 ,X iao Hong
2
( 1 Co lleg e of Phamacy, South-Centra l Univ ersity fo r Nationalities, Wuhan 430074, China;
Medica l V irolog y Institute, Wuhan Univ er sity , Wuhan 430071, China)
Abstract　 The antiv iral activity of the 4 effectiv e monome rs from Chinese medicinal he rb Fo lium Isatidis ( FI )
No. 1, 2, 3 and 4 against Coxackievirus B3 virus w as obtained by cell cultur e technigue and M T T colo rime tric assa y
to observ e cy topathic effec t( CPE) and to get vir us inhibito ry r ate. The results show ed that the four monomers
may inhibit CVB3 biological synthesis o ther than directly inactiv ate this vir us o r block its adsorption to susceptible
cells. The inhibito r y concentr ation ( IC50 ) o f the four monomers we re 30. 75, 28. 54, 35. 31, 26. 15 mg /L ,
r espectiv ely. And the tr eatment index ( TI ) we re 6. 51, 9. 71, 8. 24 and 14. 96 r espectiv ely. Their antivir al activ ity
w ere mo re o ffectiv e than ribavirin ( IC50= 103. 13 mg /L , TI= 5. 22) and antivira l liquor ( IC50= 105. 44 mg / L, TI
= 5. 02) a t the same dosage lev el (P < 0. 01) . Moreover, the re a re obvious dosage-effect relationship betw een the 2
～ 128 mg /L dose o f the 4 monomer s and the anti-CVB3 inhibito r y ra te in vitro (P < 0. 01) . A concentra tion o f 128
mg / L o f the monomers can nea rly inhibit 90 percents o f the pro liferation o f CVB3 in Hep-2 cells. We conclude
that the 4 monomer s f rom Folium Isa tidis can inhibit the pro fica tion o f the CVB3 in Hep-2 cell effectiv ely and
safely .
Keywords　 Folium Isatidis; monomers ; CVB3; antiv iral a ctivity
　　 柯萨奇病毒 ( Coxsakievi rus)属小核糖核酸科
( Pico rnavi ridas)肠道病毒属 ( Enterovi rus) [1 ] ,是一
类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒 ,感染
后人会出现发热、打喷嚏、咳嗽等感冒症状 .该病毒
体积较小 ,电镜下直径为 18～ 25 nm ,常态下较稳
定 ,对紫外线、高温较敏感 .它分为 A、 B两组 ,已知
柯萨奇病毒 B组 ( CVB)可引起呼吸道感染、腹泻、
脑膜炎、心肌炎、新生儿严重感染等 .柯萨奇病毒 B3
( CV B3 )和柯萨奇病毒 B组的其他 5个血清都属于肠
道病毒 ,其中 ,柯萨奇病毒 B3 ( CV B3 )引起广泛的急
性和慢性人类疾病包括呼吸道感染 ,脑膜炎 ,脑炎 ,
胰腺炎和心肌炎 [2-5 ] .虽然大多数 CV B3病毒造成的
疾病轻微 ,但有些急性感染严重甚至致命 .感染
CV B3可能会导致心律失常和心衰 [ 6] ,而在某些情况
下 ,心肌炎症可能长期慢性存在并导致扩张型心肌
病 [7 ] ,需要心脏移植 ,甚至导致死亡 .而且 CV B3在患
者的大便、呼吸道分泌物排出的时间很长 , 传染性
强 , 易造成疾病的流行 ,对人类危害极大 .
但目前在临床上还缺乏有效的抗 CV B3特异性
的预防和治疗药物和方法 ,对病毒性心肌炎的治疗
仍以支持治疗和对症治疗为主 ,如卧床 ,补充
Vitamin C和辅酶 Q10和静脉滴注抗炎抗病毒药物
等 .而且西药普遍存在价格昂贵、副作用大、疗效质
疑等缺点 .即使目前国外临床试验最好的衣壳功能
抑制剂普来可拉定 ( pleconari l) ,其口服剂也未被美
国 FDA批准用于治疗成年人的普通感冒 ,其原因主
要基于由细胞色素 P-450 3A酶活化引起的药物相
互作用和治疗边缘效益 [8-10 ] . 而我国传统中药大青
叶 ( Folium Isa tidis, FI)为十字花科植物菘蓝的干燥
叶 ,味甘 ,气寒 ,无毒 ,入肝、心、胃经 ,以清热解毒、凉
血化斑为主要功效 ,主治呼吸系统感染 .其主要成分
为靛玉烷、靛蓝、靛玉红、色氨酸、色氨酮等 ,药理作
用主要集中在抗病原微生物、抗内毒素、抗炎、增强
免疫功能、解热等 .现我们从大青叶中提取有效单
体 ,观察其在体外抗 CV B3活性及其可能机制 .
1　实验
1. 1　原料与试剂
1. 1. 1　 药物
中药大青叶有效单体 1# , 2# , 3# , 4# (褐色颗粒 ,
溶于水 )由华中科技大学同济医学院同济医院药剂
科方建国教授提供 .将 1# , 2# , 3# , 4#药分别配成 0. 1
g /mL水剂 ,经 8磅 15 min消毒灭菌 , 分装备用 .阳
性对照药病毒唑 (注射液 , 1g /支 ) ,中药对照药抗病
毒口服液 ( 10 mL /支 ) ,南京第三制药厂生产 ,批号
080302,用时以生理盐水配成 0. 1 g /mL.
1. 1. 2　细胞
Hep-2(鼻咽癌 )细胞为武汉大学典型培养物保
藏中心提供 .细胞生长液为含 10%新生牛血清的
RPM I-1640,细胞维持液为含 2%新生牛血清的
RPM I-1640,常规加入青霉素 100 U /mL、 链霉素
100 U /mL.
1. 1. 3　病毒
CV B3Nancy株为标准株 , -80℃武汉大学医学
病毒学研究所保存 ,实验前复苏 .病毒在 Hep-2细胞
中活化增殖后 , 采用 Reed-M uench微量法滴定 ,其
滴度为 10- 7 TCID50 /mL,实验用 100 TCID50 /mL.
1. 1. 4　试剂
RPM I-1640和 M TT ( 3-( 4, 5-二甲基噻唑 -2)-
2, 5-二苯基四氮唑溴盐 )为 Hyclone公司产品 . M T T
以不含血清的 M EM培养基配制成 5 g /L溶液 ,过滤
除菌后置 4℃冰箱保存备用 .二甲基亚砜 ( DM SO )
由上海菲达有限公司提供 .新生小牛血清购自三利
公司 .
1. 1. 5　主要仪器
Fo rma Scienti fic超净工作台 ,美国制造 . TGL-
16C型高速台式离心机 ,上海安亨科学仪器厂生产 .
OLYMPU S IM T-413型倒置显微镜 ,日本制造 .
DG3022-A型酶联免疫检测仪 ,第四军医大学、国营
华东电子管厂联合研制 .
1. 2　实验方法
1. 2. 1　药物对细胞的毒性的测定
用乙酶将生长良好的 Hep-2细胞分散成单个细
胞悬液 ,按 1× 105个 /mL浓度分种于 40孔板 ,每孔
0. 1 mL.置 37℃ , 5% CO2培养箱中培养 . 24 h后
弃培养液上清 ,换含不同浓度的含药维持液 ,每孔
200μL.药物的终浓度分别为 10, 20, 40, 80, 160,
320, 640, 800, 1 600 g /L.每种浓度重复 4孔 ,实验同
时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和抗
病毒口服液对照 .继续培养 48 h后 ,以 M TT法 (如
1. 2. 2)检测细胞存活率 .并根据细胞存活率 ,找出药
物对细胞的最大无毒浓度范围 .
1. 2. 2　细胞活性测定 ( M TT染色法 )
根据 Mosmann建立的四甲基偶氮唑盐 ( M T T)
法测定细胞活性 .弃培养上清液 ,每孔加 5 g /L
M TT的不含血清的 M EM 50μL, 37℃ , 5% CO2
孵育 4～ 6 h , 黄色的 M TT被活细胞的线粒体脱氢
酶还原成蓝色的甲簪结晶 ,小心吸出 M TT, PBS洗
3次 ,每孔加 50μL DMSO终止反应 ,振荡混匀 , 在
15 min后甲簪结晶被溶解 ,在波长 570 nm下测定吸
光度 OD值 . OD值与活细胞的数量呈正相关 .
1. 2. 3　药物对 CV B3生物合成的抑制作用的测定
于已长成单层的 Hep-2细胞 40孔板上 ,每孔接
种 100μL的 100 TCID50的 CVB3病毒液 ,于 37℃吸
附 90 min,弃病毒上清 .根据细胞毒性实验结果 ,在
42　　　　　　　　　　　　　　　　　　中南民族大学学报 (自然科学版 ) 第 28卷
药物无毒浓度范围内 ,加入不同浓度的含药维持液
每孔 0. 2 mL,药物浓度分别为 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128
mg /L;每日观察 CPE,隔天换新鲜含药维持液 .实验
同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和
抗病毒口服液对照 .约在病毒对照 CPE为 + + + ～
+ + + + 时弃培养液上清 ,用 M TT法检测病毒抑
制率 ,并计算药物对 CV B3的病毒抑制率 .
1. 2. 4　药物直接灭活病毒实验
将 100 TCID50 /mL滴度的 CV B3与不同浓度的
大青叶单体 1# ～ 4# 作用 4 h.反应体系为 0. 2 mL.含
50μL的 100 TCID50 /mL滴度的 CV B3和 150μL的
药物 ,并保证药物的终浓度与药效学实验相同 .然后
将混合液接种于单层 Hep-2细胞中 ,孵育 1. 5 h后 ,
换用 2% M EM培养液维持细胞生长 , 37℃ , 5%
CO2培养 ,逐日观察 CPE. 实验同时设正常细胞对
照、病毒对照、阳性药物病毒唑和抗病毒口服液
对照 .
1. 2. 5　药物抗病毒吸附实验
分别将不同浓度的大青叶单体 1# ～ 4# 加到
Hep-2单层细胞孔中 , 37℃吸附 90 min,弃上清 ,再
加 100 TCID50 /mL滴度的 CV B3 100μL /孔 , 37℃吸
附 90 min后 ,弃上清 ,加细胞维持液 , 37℃、 5%
CO2培养 ,逐日观察细胞病变 . 实验同时设正常细
胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和抗病毒口服液
对照 .
1. 2. 6　计算公式和分析方法
CPE记录方法为: “ - ”为无 CPE;“+ ”为 25%
细胞出现 CPE;“+ + ”为 50% 细胞出现 CPE;“+ +
+ ”为 75% 细胞出现 CPE;“+ + + + ”为 100% 细
胞出现 CPE.
细胞存活率 (% )= (药物组平均 OD570 /细胞对
照组平均 OD570 )× 100% ,
病毒抑制率=
药物处理组 OD570-病毒对照组 OD570
细胞对照组 OD570-病毒对照组 OD570× 100% .
( 1)结合细胞毒性实验和药物抗病毒实验的结
果 ,用统计软件 SPSS11. 5的 Probi t回归法计算药物
半数毒性浓度 TC50和半数有效浓度 TC50 ,得到药物
治疗指数 ( T reatment Index , T I= TC50 /TC50 ) .采用
治疗指数作为评价指标来衡量各药物对病毒抑制的
效力 .
( 2)采用直线相关分析 ,观察中药大青叶有效
单体 1# , 2# , 3# , 4#不同剂量与细胞存活率、病毒抑
制率等之间是否存在直线关系 ,并求出直线回归方
程和相关系数 .
2　结果与讨论
2. 1　药物毒性的效果
将中药大青叶有效单体 1# , 2# , 3# , 4#和病毒唑
及抗病毒口服液的不同浓度对细胞的毒性 ,结果见
表 1.通过光镜观察 , 大青叶有效单体 1# , 2# , 3# , 4#
对 Hep-2细胞毒性作用表现为:细胞粘连 ,变圆 ,壁
厚 ,破碎 ,脱落 ,胞浆内颗粒增加 ,折光性增强 .并且
吸光值明显下降 ,吸光度 OD值在 0. 10以下 .
表 1　大青叶单体 1、 2、 3、 4# 对 Hep-2细胞的毒性作用
Tab. 1　 Cytotoxi ty of the effective monomers No. 1、 2、 3、 4 f rom Folium Isatidi s to Hep-2 cell s
药物
药物浓度不同时细胞存活率 /%
10
mg /L
20
mg /L
40
mg /L
80
mg /L
160
mg /L
320
mg /L
640
mg /L
800
mg /L
1 600
mg /L
50%毒性
浓度 TC50
FI 1# 85. 8 70. 2 64. 7 46. 9 40. 3 28. 6 21. 5 10. 6 7. 4 200. 33
FI 2# 86. 5 78. 9 72. 5 54. 6 41. 2 30. 1 23. 6 14. 9 8. 2 277. 00
FI 3# 88. 5 76. 1 70. 8 56. 7 44. 0 32. 6 22. 4 15. 9 9. 5 290. 98
FI 4# 90. 1 83. 7 76. 3 60. 8 48. 5 34. 6 30. 5 23. 4 11. 2 391. 31
病毒唑 96. 2 90. 1 83. 6 72. 8 54. 6 46. 2 35. 6 23. 7 16. 8 537. 83
抗病毒口服液 95. 0 84. 1 75. 6 66. 8 55. 6 48. 4 39. 6 26. 5 17. 1 528. 96
　　从表 1可知 ,大青叶有效单体 1# , 2# , 3# , 4#
TC50 > 200 mg / L,说明其安全系数大 .药物在 160
mg / L范围内均未见明显的细胞毒性 ,从而确定该
药物浓度为对 Hep-2细胞敏感病毒的抗病毒实验的
最高允许浓度 ;但细胞经较高浓度的药物作用后 ,死
亡细胞数增加 ,细胞存活率降低 (见图 1) .经直线回
归分析 ,药物浓度与细胞存活率之间存在直线关系 ,
P < 0. 01.其直线方程和相关系数分别为: y1# =
43第 2期　　　　　　　　　　　　刘　钊 ,等: 中药大青叶有效单体抗柯萨奇病毒作用　　　　　　　　　　　　　　　　
59. 006- 0. 042x , r 1# = - 0. 815; y2# = 63. 976-
0. 045 x , r 2# = - 0. 827; y3# = 64. 466- 0. 045 x ,
r3# = - 0. 835; y4# = 69. 451 - 0. 045 x , r4# =
- 0. 849.经计算 , 1# , 2# , 3# , 4# 单体对 Hep-2细胞
的 TC50分别为 200. 33, 277. 00, 290. 98, 391. 31 mg /
L,经 t检验 ,大青叶的 4种单体对 Hep-2细胞不同药
物浓度下细胞存活率都小于阳性对照药 ( P <
0. 01) ,说明其毒性比病毒唑大和抗病毒口服液大 .
它们之间两两进行比较 , 4# 单体的药毒性最小 ( P <
0. 01) , 2# 和 3#单体毒性相当 ( P> 0. 05) ,毒性大于
4# 单体 ; 1# 单体的毒性最大 (P < 0. 01)
Drug concen t rations( mg /L)
图 1　不同浓度大青叶单体 1# 和单体 4# 对
Hep-2细胞的细胞存活率的比较
Fig. 1　 Dif ferent survival rate of Hep-2 cel ls (% ) at various
concen trations ( mg / L ) betw een FI No . 1 and No . 4
2. 2　药物抗病毒生物合成的效果
CV B3对 Hep-2细胞 CPE表现为细胞皱缩、变
圆、脱落、碎裂 ,胞浆内颗粒增多 ,折光性增强 . 48～
72 h后 ,用 M TT法按公式计算大青叶有效单体 1# ,
2# , 3# , 4#对 CV B3的抑制率 ,结果见表 2.
由表 2可知随药物浓度增加 ,其抗病毒活性增
强 ,病毒抑制率升高 (见图 2) .经直线回归分析 ,药物
浓度与病毒抑制率间有直线关系 , P < 0. 01.其直线
方程和相关系数分别为: y1# = 32. 252+ 0. 525 x ,
r1# = 0. 878; y2# = 33. 287+ 0. 529 x , r 2# = 0. 795;
y3# = 27. 503+ 0. 569 x , r 3# = 0. 922; y4# = 35. 326
+ 0. 508 x , r4# = 0. 896.药物浓度在 16 mg / L以上
时 ,对 CV B3细胞病变抑制程度可达 50%以上 . 在
128 mg /L时 ,对 CV B3抑制程度达 90%或以上 ,表
现较强的抗病毒活性 .在 2～ 128 mg /L浓度范围内 ,
4种单体的病毒抑制率大于阳性对照药 ,经 t检验 ,
P < 0. 01,说明大青叶单体的抗 CV B3活性优于病毒
唑和抗病毒口服液 .将 4种单体两两进行比较 , P>
0. 05,无显著性差异 ,说明 4种单体的体外抗 CV B3
效果相同 .
2. 3　药物直接灭活病毒的效果
按实验方法将药物与病毒混合后再作用与细
胞 ,逐日观察细胞病变 .发现各单体不同浓度组均出
现典型 CV B3感染所致的 CPE,且与病毒对照孔无显
著区别 ,说明各单体均不能直接杀灭 CV B3 .
表 2　大青叶单体 1# , 2# , 3# , 4# 的抗 CVB3作用
Tab. 2　 An tivi ral activi ty of th e ef fective monom ers No. 1、 2、 3、 4 f rom Folium Isatidi s to CVB3 in vi t ro
药物
药物浓度不同时病毒抑制率 /%
2
mg /L
4
mg /L
8
mg /L
16
mg /L
32
mg /L
64
mg /L
128
mg /L
50%有效
浓度 IC50
治疗指数
TI
FI 1# 15. 3 24. 9 35. 8 52. 5 63. 6 78. 2 88. 7 30. 75 6. 51
FI 2# 8. 5 18. 7 40. 5 66. 4 67. 8 75. 3 90. 2 28. 54 9. 71
FI 3# 13. 6 20. 5 32. 9 47. 1 59. 8 70. 4 92. 7 35. 31 8. 24
FI 4# 20. 3 34. 5 38. 9 45. 6 63. 7 84. 0 89. 4 26. 15 14. 96
病毒唑 6. 4 6. 9 10. 4 21. 5 27. 7 37. 7 56. 3 103. 13 5. 22
抗病毒口服液 5. 6 6. 2 10. 2 20. 0 26. 3 35. 8 55. 8 105. 44 5. 02
2. 4　药物抗病毒吸附的效果
按实验方法将药物与细胞作用后再感染病毒 ,
逐日观察细胞病变 .发现各单体不同浓度组均出现
典型 CV B3感染所致的 CPE,与病毒对照孔无显著区
别 ,说明各单体无阻断吸附作用 .
3　结语
( 1)中药大青叶单体 1# , 2# , 3# , 4# 具有体外抗
CV B3的作用 ,其相应的提取工艺为有效工艺 .
( 2)大青叶单体 1# , 2# , 3# , 4# 体外抗 CVB3的作
用是通过抑制 CV B3在 Hep-2细胞内生物合成而发
挥 ,其对 CV B3无直接灭活作用 ,也不能阻止 CV B3
的吸附作用 .
( 3)大青叶单体 1# , 2# , 3# , 4# 毒性较病毒唑和
抗病毒口服液大 (P < 0. 01) ,但抗 CV B3效果优于病
毒唑和抗病毒口服液 (P < 0. 01) ,故仍需要进一步
改进提取工艺 ,降低毒性 ,并通过化学分析进一步明
确其分子结构 ,从动物体内进一步证实其抗 CV B3
44　　　　　　　　　　　　　　　　　　中南民族大学学报 (自然科学版 ) 第 28卷
的作用 .
图 2　不同浓度大青叶单体 4和病毒唑
对 CVB3的病毒抑制率的比较
Fig. 2　 Dif ferent inh ibitory rate to CV B3 of (% ) betw een
FI No. 4 and ribavirin at various concen trations ( mg /L)
参　考　文　献
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