全 文 ：2011 第十三卷 第二期 ★Vol． 13 No． 2
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大青叶及其混淆品的 ITS2 序列鉴定研究＊
□孙稚颖 (
中国医学科学院
北京协和医学院
药用植物研究所 北京 100193)
(山东中医药大学药学院 济南 250355)
罗红梅＊＊ 陈士林＊＊ (中国医学科学院
北京协和医学院
药用植物研究所 北京 100193)
收稿日期:2011－03－04
修回日期:2011－04－03
＊ 卫生部卫生行业科研专项(200802043) :药用植物 DNA barcoding(条形码)鉴定研究，负责人:陈士林。
＊＊ 通讯作者:罗红梅，博士，主要研究方向:药用植物分子生物学，E-mail:hmluo @implad． ac． cn;陈士林，本刊学术副主编和编委，教授，博
士，中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所所长，主要研究方向:中药资源学，E-mail:slchen@implad． ac． cn。
摘 要:目的:对中药材大青叶及其混淆品进行分子鉴定，以确保该药材的质量以及临床疗效。
方法:采用 PCR 直接测序法，测定核基因 ITS2 区，所得序列经 CodonCode Aligner 拼接后，用软件
MEGA4． 0 进行相关数据分析，构建 NJ(邻接)树，并利用 Koetschan 等建立的 ITS2 数据库及其网站预
测 ITS2 二级结构。结果:大青叶基源植物菘蓝 ITS2序列长度为 191bp，其种内平均 K2P遗传距离(0．
002)远小于其与混淆品的种间平均 K2P遗传距离(0．882);由所构建的系统聚类树图可以看出，各物
种均表现出了单系性，而同时又与其它物种明显区分开;比较 ITS2二级结构发现，各物种在 4个螺旋
区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论:ITS2 作为条形码可以方便快
捷的鉴别大青叶正品及其混淆品，对药典中其它药材的相关研究也具有重要的参考价值。
关键词:大青叶 DNA条形码 ITS2 分子鉴定
doi:10． 3969 / j. issn． 1674 － 3849. 2011. 02． 034
大青叶为我国传统常用中药，具有清热解毒，凉
血消斑的功效，用于治疗温病高热，神昏，发斑发疹，
痄腮，喉痹，丹毒，痈肿等症。2010 年药典记载其来
源为十字花科植物菘蓝 Isatis indigotica Fort．的干燥
叶［1］。近年来，随着非典、禽流感、甲型 HIN1 流感等
一系列疾病的爆发，清热解毒类中药一度成为人们
关注的热点，对于大青叶的各方面研究特别是有效
成分及药理活性的研究正在深入开展。但是由于历
史原因，大青叶的来源比较混乱，十字花科植物菘
蓝、爵床科植物马蓝 Baphicacanthus cusia (Nees)
Bremek．、蓼科植物蓼蓝 Polygonum tinctorium Ait．
(Persicaria tinctoria (Ait．)Spach)、马鞭草科植物大
青 Clerodendrum cyrtophyllum Turcz．、豆科植物木蓝 In-
digofera tinctoria L．等诸蓝之叶在中医临床中均被用做
大青叶［2］。药材来源的复杂与混乱，必然会影响其质量
的稳定可靠、临床用药的安全有效，以及其后续深入研
世界科学技术—中医药现代化★专题讨论:中药材 DNA条形码鉴定
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究的顺利进行和研究成果的真实可信，因此有必要对
大青叶基源植物及其混淆品种进行鉴别研究。
关于大青叶的分子鉴别研究，目前国内外尚未
见报道。DNA条形码是近年来发展起来的分子鉴
定的新技术，利用该技术有望实现对物种的快速自
动鉴定，从而克服传统分类学研究方法的诸多缺
陷［3～ 5］，在中药材的真伪鉴定中具有广阔的应用前
景［6］。近来，ITS2 已被提出作为药用植物鉴定的标
准条形码序列［7～ 14］。该序列片段一般较短，有利于
对发生降解的样品进行扩增［15］，同时 ITS2 片段在物
种水平的变异较快，有更多的突变位点以区分不同
的物种。此外，ITS2 序列能够与保守的 5． 8S 和
28S区段形成特定的颈环二级结构，从而具有鉴别
物种的分子形态特征。本研究利用 ITS2条形码对大
青叶基源植物及其混淆品进行了比较研究，旨为该药
材的质量控制及临床安全用药提供分子鉴定依据。
一、材料与方法
1．材料、试剂及仪器
(1)材料。
材料来源见表 1，包括实验样品及来自 GenBank
所下载序列，实验样品经中国医学科学院药用植物
研究所林余霖副研究员鉴定，凭证标本保存于中国
医学科学院药用植物研究所。
表 1 材料来源
材料 拉丁学名 采集地 标本号 GenBank号
菘蓝 Isatis indigotica 中国医学科学院药用植物研究所 PS1284MT01 JF421508
菘蓝 Isatis indigotica 中国医学科学院药用植物研究所广西分所 PS1284MT02 JF421507
菘蓝 Isatis indigotica 安徽阜阳 PS1284MT03 JF755937
菘蓝 Isatis indigotica 河北安国 PS1284MT04 JF755936
菘蓝 Isatis indigotica 台湾 ——— EF114671
菘蓝 Isatis indigotica 江苏 ——— AF384104
蓼蓝 Polygonum tinctorium (Persicaria tinctoria) 福建莆田县常太镇利车村 PS2901MT01 GQ434856
蓼蓝 Polygonum tinctorium (Persicaria tinctoria) ——— ——— EU196919
蓼蓝 Polygonum tinctorium (Persicaria tinctoria) ——— ——— FJ503014
马蓝 Baphicacanthus cusia 重庆荷花池药材市场 PS0742MT03 GQ434546
马蓝 Baphicacanthus cusia 中国医学科学院药用植物研究所广西分所 PS0742MT06 JF755938
木蓝 Indigofera tinctoria 中国医学科学院药用植物研究所广西分所 PS0251MT01 GQ434361
木蓝 Indigofera tinctoria ——— ——— AF521775
大青 Clerodendrum cyrtophyllum 中国医学科学院药用植物研究所广西分所 PS0856MT03 JF755940
大青 Clerodendrum cyrtophyllum 中国医学科学院药用植物研究所广西分所 PS0856MT04 JF755941
大青 Clerodendrum cyrtophyllum 中国医学科学院药用植物研究所广西分所 PS0856MT05 JF755939
(2)试剂。
植物 DNA提取试剂盒购自北京天根生物技术
有限公司 (Tiangen Biotech Co．，China) ;MgCl2、
dNTP、PCR buffer(10 ×)、DNA 聚合酶均购自北京
博彩生物科技有限公司 (Biocolor BioScience ＆
Technology Co．，China) ;引物由上海生工(Sangon
Co．，China)合成。
(3)仪器。
DNA提取研磨仪 (Retsch MM400，Germany) ;
PCR仪(PTC0200，BIO-RAD 公司) ;凝胶成像系统
(BIO-RAD公司) ;BI 3730XL 测序仪 (Applied Bio-
systems Co．，USA)。
2．方 法
(1)DNA提取。
材料均为叶片，硅胶干燥后，取样约 10mg，用
DNA提取研磨仪研磨 1min(30 次 / s)后，利用植物
DNA提取试剂盒提取总 DNA。
(2)PCR扩增及测序。
扩增引物正向为 5-GCGATACTTGGTGTGAAT-
3，反 向 为 5-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3。
PCR 反应体积为 25μL，反应体系及扩增程序参照陈
士林等的文章［7］。PCR 扩增产物经纯化后，使用
ABI 3730XL 测序仪双向测序。
(3)数据处理。
测序 峰 图 利 用 CodonCode Aligner V 2． 06
(CodonCode Co．，USA)校对拼接，去除引物区。对
于网上所获得的 ITS 序列，使用基于隐马尔可夫模
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型的 HMMer 注释方法去除两端 5． 8S 和 28S区段获
得 ITS2 间隔区序列［16］。然后，将所有序列用软件
MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)4． 0
分析比对并进行遗传距离等分析，用 NJ(邻接)法构
建系统聚类树。利用 bootstrap (1000 次重复)检验
各分支的支持率。根据 Koetschan 等［17］建立的 ITS2
数据库及其网站预测 ITS2 二级结构。
二、结果与分析
1．大青叶正品及其混淆品 ITS2序列种内种间比较
实验共获得大青叶正品及其混淆品 ITS2 序列
11 条。大青叶正品来源菘蓝 ITS2 间隔区序列长度
为 191bp，GC含量为 56． 0%，具有一个 PolyC 结构，
种内不同来源样品 6 条序列比对后，仅样品
JF421507 在 70bp位点处与其余样品有 G-C 碱基变
异，根据 Kimura-2 参数遗传距离模型计算得到菘蓝
种内平均 K2P 距离为 0． 002，种内最大 K2P 距离为
0． 005。大青叶各混淆品原植物 ITS2 序列长度范围
为 216 ～ 245bp，其中序列最长的为蓼蓝。各混淆品
除木蓝两样品存在种内碱基差异外，其余混淆品种
内不同来源样品 ITS2 碱基序列均无差异。
图 1 基于 ITS2 序列构建的大青叶及其混伪品的邻接(NJ)树
注:Bootstrap 1000 次重复，枝上数值仅显示自展支持率≥50%。
大青叶正品与其各混淆品种间序列进行比对
后，长度为 265bp，ITS2 序列间存在较多的变异位
点，种间平均 K2P 距离为 0． 882，种间最小 K2P 距
离为 0． 357。其中菘蓝与马蓝、蓼蓝遗传距离较近，
分别为 0． 894 和 0． 895，而与木蓝距离较远，为
1． 166。
2．聚类分析
基于 ITS2 序列，利用 Mega4． 0 构建的 NJ 系统
聚类树中显示，大青叶基源植物菘蓝不同来源样品
聚在一支，表现出单系性，同时大青叶的混淆品大
青、马蓝、蓼蓝、木蓝，相同物种的不同样品也分别聚
成一支，而且自展支持率 (bootstrap)均很高，为
99%～100%，从树图中可以明显看出，大青叶正品
菘蓝能够很容易与其混淆品区分开。
3．大青叶正品及其混淆品 ITS2 序列二级结构
根据 Koetschan 等建立的 ITS2 数据库及其网站
预测菘蓝及其混淆品的 ITS2 二级结构(图 2) ，可以
看出，所有物种的二级结构均为一个中心环(主环)
及 4 个螺旋区(Helix)构成，每个螺旋上又有大大小
小、或多或少的茎环(Loop)结构。通过比较菘蓝及
其混淆品的 ITS2 二级结构发现，各物种在 4 个螺旋
区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均
有明显差异，因此，依据 ITS2 二级结构，可以直观地
将大青叶正品菘蓝及其混淆品区分。
三、讨 论
大青叶为我国传统的清热解毒要药，因历代本
草对该品的记述各异以及我国幅员辽阔，各地用药
习惯不一，导致了
其在市场流通及
中医临床用药中
的混 乱 现 象，马
蓝、蓼蓝、大青、木
蓝等在一些地区
被作为大青叶药
用［17］。本研究采
集了大青叶的正
品来源菘蓝以及
各地混用品种 10
余份 样 本，又 从
GenBank上下载了
这 些 物 种 的 相
关序列，利用目前
认可的 DNA 条形
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图 2 大青叶正品及其混淆品的 ITS2 二级结构比较
码 ITS2 序列片段，对大青叶正品和混淆品进行鉴
别，发现大青叶的基源植物菘蓝的 ITS2 条形码序列
长度很短，仅 191bp，易于扩增和测序，其种内平均
K2P距离(0． 002)远远小于其与混淆品的种间平均
K2P距离(0． 882) ，在基于邻接法构建的系统聚类
树中，各物种均表现出了单系性，而同时又与其它物
种明显区分开，ITS2 二级结构所提供的分子形态学
特征又进一步直观显示了菘蓝及其混淆品所具有的
明显差异，因此，基于 ITS2 条形码可以方便快捷的
鉴定中药材大青叶正品及其混淆品。目前，在中国
药典中，菘蓝叶为大青叶的正品来源，蓼蓝叶为蓼大
青叶的正品来源，而菘蓝、蓼蓝、马蓝叶或茎叶加工
制成的粉末或团块、颗粒为青黛的正品来源［1］，这 3
味药材虽然功效相似，但因植物来源不同必然会导
致所含化学成分有所差异，正确的鉴别各药材基源
植物，可以为它们的质量评价以及后续药理药化药
效方面研究的深入开展提供重要依据和前提，同时
本项研究亦可为中国药典中其它药材与混伪品的鉴
定研究提供参考。
致谢:感谢中国医学科学院北京协和医学院药用
植物研究所罗焜博士为本研究提供部分实验序列。
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Molecular Identification of Isatidis Folium and Its Adulterants by ITS2 Sequences
Sun Zhiying1，2，Luo Hongmei1，Chen Shilin1
(1． Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，
Beijing 100193，China;
2． College of Chinese Medicine，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)
Abstract:This study aimed to discriminate between Isatidis Folium and its adulterants in order to guarantee the
quality and clinical curative effect of this medical material． In this study，the second internal transcribed spacer
(ITS2)of ribosomal DNA were amplified and sequenced． Sequence assembly and consensus sequence generation
were performed by using the CodonCode Aligner． Phylogenetic study was performed by using software MEGA 4． 0
software in accordance with the Kimura 2-parameter (K2P)model． And the phylogenetic tree was constructed u-
sing the neighbor-joining methods． The ITS2 secondary structure was predicted by using the ITS2 database and
website which was built by Koetschan et al． The results showed that the length of ITS2 sequence of the origin plant
of Isatidis Folium was 191 bp． The mean intraspecific genetic distance (K2P distance，0． 002)was far lower than
its mean interspecific genetic distance (0． 882)． In the cluster dendrogram，all species showed monophyletic，and
distinguished from others． To compare the ITS2 secondary structure of the origin plant of Isatidis Folium and its a-
dulterants，we noticed that it was obviously distinguished from other species in the amount，size，position of loop
and the angle of helix exertion． It is concluded that ITS2 sequence can be used as DNA barcode to identify Isatidis
Folium and its adulterants effectively． This study may provide an important example for the authentication of other
medicinal herbs listed in the Chinese Pharmacopoeia．
Keywords:Isatidis Folium，DNA barcodes，ITS2，molecular identification
(责任编辑:李沙沙 张志华，责任译审:王 晶)