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大青叶乙醇提取液含药血清体外抗肿瘤活性研究
简晓顺，尹一子，陈健清，舒文莹，胡义平
(广州医学院附属肿瘤医院药学部，广东 广州 510095 )
摘要 目的:研究大青叶乙醇提取液体外抗肿瘤的活性。方法:选用高效液相法测定大青叶乙醇提取液中靛
玉红含量，对提取物采用血清药理学方法处理培养的肿瘤细胞株 K562 和 S180，观察大青叶乙醇提取液对肿瘤抑制
作用及其给药剂量和给药时间的关系。结果:大青叶乙醇提取液 10 ～ 160 g /kg给药后的含药血清对 2 肿瘤株细胞
均有明显抑制作用，且与剂量呈正相关;含药血清在 1、2、4 h对 2 肿瘤株细胞均有明显抑制作用，且与药物作用时
间呈正相关。结论:大青叶乙醇提取液有体外抑制肿瘤细胞的作用。
关键词 大青叶;醇提液;含药血清;肿瘤;K562;S180
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)04-0633-03
收稿日期:2012-09-20
基金项目:广东省医学科研基金(B2012171)
大青叶为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica
Fort. )的干燥叶，具有清热解毒、凉血消斑的功效;
大青叶作为一种清热解毒药在临床应用十分广泛，
其制剂种类较多，目前制备提取其有效成分均以水
提醇沉法为主，且多以靛蓝含量作为质量控制标
准〔1〕。大青叶中含有的成分靛玉红是治疗慢性粒
细胞白血病的有效药物，近年来的研究表明靛玉红
及其衍生物能够促进肿瘤细胞凋亡〔2〕，对实体瘤也
有抑制作用〔3〕。然而大青叶的乙醇提取液对肿瘤
细胞生长的抑制作用笔者未见报道。本研究将
不同剂量的大青叶的乙醇提取液灌胃给药小鼠，
然后将采血获得的含药血清分别作用于人白血
病细胞 K562 和 S180肉瘤细胞，探讨大青叶的乙醇
提取液对这 2 种不同肿瘤细胞株体外抗肿瘤药
效作用。
1 材料与仪器
1. 1 实验动物 清洁级 ICＲ小鼠，雌雄各半，体质
量(20 ± 2)g，由中山大学实验动物中心提供，许可
证:SYXK(粤)2010-0121。
1. 2 细胞株 人白血病细胞株 K562 和 S180肉瘤
细胞株引自中山大学实验动物中心，用含 10%小牛
血清的 ＲPMI-1640 培养液，37 ℃、5% CO2 培养，
0. 25%胰蛋白酶消化传代。
1. 3 药物与试剂 大青叶购自广州市清平中药材
市场，经暨南大学药学院蔡宇教授鉴定本品为十字
花科植物菘蓝 Isatis indigotica Fort. 的干燥叶;噻唑
蓝(MTT)、ＲPMI-1640 培养基为 Sigma 公司产品;小
牛血清为 Gibco公司产品。
1. 4 主要仪器 旋转蒸发器为上海实验设备厂产
品;岛津 SPD-20A 高效液相色谱系统，LC-20AT 高
效液相色谱仪二元高压梯度泵，SIL-20A 自动进样
器，SPD-20A紫外-可见光检测器。
2 方法
2. 1 大青叶醇提液的制备 将定量生药大青叶粉
碎，过筛后，加入 75%乙醇，在 60 ℃水浴下周期震
荡 2 h，冷沉淀后用滤纸过滤，滤过液回收乙醇，蒸馏
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DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.04.023
水定容，制成相当生药 1 g /mL混悬液供实验用。
2. 2 大青叶醇提液中靛玉红含量测定
2. 2. 1 色谱条件:色谱柱为 Alltima-C18(250 × 4. 6
mm，5 μm)，流动相为:甲醇-水(22 ∶ 78);检测波长
为 289 nm，流速为 1. 0 mL /min，柱温 25 ℃，进样量
20 μL。
2. 2. 2 样品供试品溶液的制备:精密称取样品粉
末 0. 1 g，置于索氏提取器中，以氯仿加热回流提取
至提取液无色。将提取液置于旋转蒸发器中，40 ℃
回收氯仿，残渣用甲醇分次溶解并定容至 100 mL容
量瓶中，摇匀。滤液经微孔滤膜过滤，取滤液作为供
试品溶液。
2. 2. 3 对照品标准溶液的配制:精密称取靛玉红
1. 0 mg，用氯仿溶解，并用甲醇稀释、定容至 50 mL
容量瓶中，摇匀，微孔滤膜滤过。
2. 2. 4 线性:精密吸取“1. 3. 3”项下的对照品溶
液 1、2、4、6、8、10 mL，分别置于 10 mL量瓶中，以甲
醇稀释至刻度，摇匀，进样测定。
2. 2. 5 精密度试验:取“1. 3. 3”项下对照品溶液，
按照“1. 3. 1”项下色谱条件连续进样 5 次，计算靛
玉红峰面积的 ＲSD。
2. 2. 6 稳定性试验:取大叶青乙醇提取液制备供
试品溶液 1 份，密封保存于 25 ℃室温，于 0、2、4、8、
12、24 h 进样，记录峰面积，计算靛玉红含量以及
ＲSD。
2. 2. 7 加样回收率试验:取大叶青乙醇提取液制
备供试品溶液 5 g，共 5 份，精密称定，分别精密加
人靛玉红对照品 2. 85 μL，吸取 10 μL，注入液相
色谱仪，记录峰面积，代入回归方程计算靛玉红
的量。
2. 2. 8 靛玉红含量测定:精密吸取对照品溶液、供
试品溶液各 10 μL注入高效液相色谱仪，按上述色
谱条件测定，记录色谱图。
2. 3 含药血清制备 清洁级 NIH小鼠 108 只随机
分成 9 组，每组 12 只，禁食 8 h 后分别灌胃给药，剂
量组共设 5 个:10、20、40、80、160 g /kg;其中 80 g /kg
设 4 个时间组;正常对照组灌等量生理盐水，给药剂
量组给药 2 h后无菌采血，时间组给药后 1、2、4、8 h
无菌采血。血样 2 000 r /min 离心 15 min 取血清，
56 ℃ 30 min灭活，置 0 ～ 4 ℃冰箱备用。
2. 4 MTT法测定大青叶乙醇提取液细胞毒作用
将生长旺盛的人白血病细胞株 K562 和 S180肉瘤两
种细胞株用 ＲPMI-1640 培养液制成 2 × 105 /mL 的
细胞悬液，每种细胞分别接种于 96 孔培养板，200
μL /孔;不同浓度含药血清按 10 μL /孔加样，每个浓
度设 3 个平行孔，每板均设正常小鼠血清对照组，37
℃，5% CO2，饱和湿度培养 48 h 后，加入 5 mg /mL
的 MTT溶液(50 μL /孔)，继续培养 6 h 后弃上清，
每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200 μL 后，在酶标分
析仪波长 550 nm下测定光密度 D(λ)值〔4〕，计算抑
制率(Inhibition ratio，IＲ)。
抑制率 IＲ(%)=
D(λ)对照组 － D(λ)实验组
D(λ)对照组
× 100%
2. 5 统计学处理 所测得数据均采用 珋x ± s 表示，
应用 SPSS 15. 0 统计软件统计，P ＜ 0. 05 具有统计
学意义。
3 结果
3. 1 靛玉红含量测定
3. 1. 1 线性关系考察:分别以梯度稀释的对照品
的浓度(X)与其相应峰面积(Y)进行线性回归，计算
靛玉红的回归方程分别为:Y = 25. 32X － 5. 832，r2 =
0. 9994(n =6)，靛玉红在浓度为 2. 51 ～ 25. 51 μg /mL
的范围内线性关系良好。其中最低定量下限的信噪
比 S /N = 7. 30。精密称取对照品靛玉红适量，加入
甲醇溶解并逐步稀释，当信噪比 S /N = 3 时确定为
最低检测限为 5 ng。
3. 1. 2 精密度试验:连续进样 5 次，结果靛玉红峰
面积的 ＲSD为 0. 81%，表明本法的精密度良好。
3. 1. 3 稳定性:供试液于 0、2、4、8、12、24 h 进样，
计算靛玉红含量 ＲSD 为 0. 92%，提取液在 25 ℃室
温条件下放置 24 h稳定。
3. 1. 4 加样回收率:测定加入已知量靛玉红的大
叶青乙醇提取液，得平均回收率为 99. 8%，ＲSD 为
1. 5%。
3. 2 大青叶乙醇提取液中靛玉红含量 取受试品
大青叶乙醇提取液 3 批，按照上述试验方法制备对
照品溶液和供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液、
供试品溶液各 10 μL，注入 HPLC 高效液相色谱仪
内测定，结果如图 1、2 所示，用外标法计算靛玉红的
含量，结果平均值为 3. 2 mg /g。
图 1 靛玉红对照品 HPLC图谱
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图 2 大青叶乙醇提取液 HPLC图谱
3. 3 大青叶乙醇提取液不同剂量含药血清对 2 种
肿瘤细胞株增殖的影响 与对照组比较大青叶乙醇
提取液不同剂量含药血清对 K562 和 S180肿瘤细胞
株均有显著的抑制作用(P ＜ 0. 05)，与给药剂量呈
正相关。见表 1。
表 1 大青叶乙醇提取液含药血清对 K562
和 S180肿瘤细胞毒性作用
剂量 /
(g /kg)
K562
D(λ) IＲ /%
S180
D(λ) IＲ /%
对照组 2. 179 ± 0. 061 － 1. 811 ± 0. 035 －
10 2. 055 ± 0. 079* 5. 69 1. 553 ± 0. 042* 14. 25
20 1. 878 ± 0. 072* 8. 12 1. 221 ± 0. 053* 32. 58
40 1. 635 ± 0. 065* 24. 97 1. 052 ± 0. 042* 41. 91
80 1. 247 ± 0. 072* 42. 77 0. 877 ± 0. 031* 51. 57
160 0. 722 ± 0. 034* 66. 87 0. 695 ± 0. 042* 61. 62
注:与对照组比较，* P ＜ 0. 05
3. 4 大青叶乙醇提取液不同给药时间对 2 种肿瘤
细胞株的影响 与对照组比较，大青叶乙醇提取物
在不同时间呈均有显著的抑制(P ＜ 0. 05)，在 1、2、4
h三个时间点药物作用与给药时间呈正相关。见表
2。
表 2 大青叶乙醇提取液不同给药
时间对 K562 和 S180肿瘤细胞毒性作用
时间 /h
K562
D(λ) IＲ /%
S180
D(λ) IＲ /%
0 2. 215 ± 0. 056 － 1. 655 ± 0. 033 －
1 1. 823 ± 0. 022* 17. 70 1. 271 ± 0. 018* 23. 20
2 1. 625 ± 0. 019* 26. 64 1. 072 ± 0. 015* 35. 22
4 1. 533 ± 0. 024* 30. 79 0. 851 ± 0. 014* 48. 58
8 1. 788 ± 0. 022* 19. 28 1. 231 ± 0. 021* 25. 62
注:与 0 h比较，* P ＜ 0. 05
4 讨论
大青叶的现代药理研究很多基本都集中在清热
解毒和抗炎作用上，其抗肿瘤活性未见报道。而大
青叶中含有的成分靛玉红在国内外有不少研究表明
其具有抗肿瘤作用，而且其抗肿瘤作用的分子作用
机制研究都比较深入和透彻。靛玉红抑制肿瘤细胞
的 DNA合成和蛋白激酶 Src，阻断 Stat3 信号传导通
路，使癌细胞发生程序性细胞死亡。靛玉红及其衍
生物不仅可以通过竞争性拮抗 CDK 的 ATP 结合位
点来阻断细胞周期，而且还有可能抑制成纤维细胞
生长因子受体(FGFＲ)表达〔5〕，靛玉红通过以上多
种信号通路和作用来抑制肿瘤细胞的生长和增殖。
本实验采用大青叶的乙醇提取液给药小鼠后取
得的血清处理培养人白血病细胞 K562 和 S180肉瘤
细胞 2 种肿瘤细胞株，结果显示，当给药小鼠剂量从
10 g /kg倍增至 160 g /kg，含药血清对 K562 细胞生
长的抑制率从 5. 69%上升至 66. 87%，对 S180细胞生
长的抑制率从 14. 25%上升至 61. 62%，其抗肿瘤活
性呈量效关系。而通过观察其中一个剂量组 80 g /
kg发现随着作用时间的增加，其抑制率也随着上
升，表明其抗肿瘤活性与其剂量和作用时间成正相
关。因此本实验结果说明大青叶的乙醇提取小鼠含
药血清在体外具有抗白血病细胞 K562 和 S180肉瘤
细胞生长和增殖的作用，并具有剂量依赖性和时间
依赖性。进一步的研究可通过建立小鼠肿瘤模型，
然后直接观察大青叶的乙醇提取液的体内的抗肿瘤
活性，然后检测信号通路里的基因和蛋白质表达水
平来说明其分子作用机制。
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