全 文 ：　 　JTCVM
2008年第 3期
　
调查研究培养基中党参粗提物加入量为 12.5%时 ,混合菌增殖最好 ,最大生长菌斑数可达 491个 /板;双歧杆菌和乳杆菌均在
15%党参培养基中增殖最好 , 双歧杆菌平均菌斑数可达
(826.57±0.02)个 /板 , 乳杆菌平均(566.57±0.03)个 /板。
该结果提示 , 加药浓度在 12.5% ～ 15.0%时 , 细菌增殖最好 ,
双歧杆菌对党参的适应能力最强。 发酵液多糖检测结果表
明 , 多糖的增加量与细菌增殖间没有明显相关作用 , 乳杆菌
发酵党参 72 h后培养液粗多糖增加量最高。粗多糖并不会
开始就呈升高现象 , 最初几代呈负增长或零增长 , 到驯化 3
代开始发酵的 2代才开始呈明显增长趋势 , 到传代 7次后
增长缓慢 , 10代时维持在高水平。实验中乳杆菌发酵处理
党参粗提物之后 ,多糖增长量最多。由此推测 , 乳杆菌发酵
党参转化多糖效果最优 , 可作为后期发酵实验的候选菌株
之一 。
参考文献:
[ 1] 曹　丽 , 罗崇念 ,卞庆亚 , 等.党参多糖对鸡 IL-2活性和
淋巴细胞增殖反应的促进作用 [ J] .中兽医医药杂志 ,
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[ 3] 杨海龙.中药提取液对灵芝深层发酵的影响 [ J] .微生物
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[ 4] 方凯泰 , 马长兴.正交与均匀试验设计 [ M] .北京:科学
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[ 5] 贵州农学院.生物统计附试验设计 [ M] .北京:中国农业
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[ 6] 武忠伟 ,郭爱莲 , 张海滨 , 等.数理统计法优化冬虫夏草
培养基的研究 [ J] .食品科学 , 2004, 25(12):108-111.
StudyonthefermentationofCodonopsispilosulaand
biotransformationofitspolysaccharidebychickenintestinalbacteria
ZHANGKai
(LifeSciencesandEngineeringCollegeofNorthwestUniversityforNationalities, LanzhouGansu730030, China)
Abstract:InordertoprovidedataformodeloffermentationofCodonopsispilosulaandbiotransformationofitspolysaccharideby
chickenintestinalbacteria(includingmixedbacteriaC8GF20, BacilusbifidusC4BF12orBacteriumlacticumC4M50F8), thegrowth
curveinculturemediummixedwithcrudeextractwasmodeledbyleastsquarestechniqueandevaluatedbyone-factorof14-level.
Theactivityoffermentationandbiotransformationwasevaluatedbyconcentrationofcrudepolysaccharideinfermentingliquor.There-
sultsshowedthattheproliferationofbacteriawasthebestwhencontentofcrudeextractinmediumwasfrom12.5% to15%, theRSD
offitingvaluewas5.45%, 4.17% and4.19%.Theincreaseofcrudepolysaccharidewashigherafter7passagenumbers, C4M50F8:
124.68%, C4BF12:114.29%, C8GF20:119.36%.Inconclusion, theoptimumconcentrationofcrudeextractinculturemediumwas
12.5%, theincreaseofcrudepolysaccharidewasabove100%, andbacteriumlacticumC4M50F8wasthebestcandidateforfermentation.
Keywords:chickenintestinalbacteria;Codonopsispilosula;fermentation;polysaccharide
大青叶中 4(3H)喹唑酮体外抗 H1N1型流感病毒的作用研究
许　涛 1 ,梁剑平2 ,余四九 1 ,蒲秀英 1 ,王学红2
(1.甘肃农业大学动物医学院 , 甘肃兰州　730070;2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所)
　　摘　要:　目的:探讨大青叶中 4(3H)喹唑酮体外抗 H1N1型流感病毒的作用。 方法:用 MTT染色法测定大
青叶中 4(3H)喹唑酮通过不同加药方式对 H1N1型流感病毒的体外抑制作用。 结果:大青叶中 4(3H)喹唑酮对
H1N1型流感病毒具有明显的阻断作用和对细胞内病毒有抑制作用。结论:大青叶中 4(3H)喹唑酮具有明显的
体外阻止 H1N1型流感病毒吸附到靶细胞和抑制 H1N1型流感病毒增殖的作用。
　　关键词:　大青叶;4(3H)喹唑酮;H1N1型流感病毒
　　中图分类号:S853.74　　　　 　文献标识码:A　　文章编号:1000-6354(2008)03-0007-03
　　流行性感冒(流感)是由流感病毒引起的一种发病率高 、
流行广泛 、传播迅速的急性病毒性呼吸道传染病 , 严重危害
着人类的身体健康 , 是人类至今尚未能有效控制的世界性
收稿日期:2008-01-28
基金项目:国家攻关项目(2004BA519A26)
作者简介:许　涛(1981-),男 , 在读硕士研究生 ,研究方向:临床兽
医学。通讯作者:梁剑平 , E-mail:liangjp100@sina.com
传染病之一 [ 1] 。 4(3H)喹唑酮是大青叶的抗病毒有效成分 ,
药理实验表明其具有抗病毒 [ 2] 、抗肿瘤 [ 3] 、抗炎 [ 4]作用 , 并
且在一定浓度范围内 ,可显著促进脾细胞增殖及刀豆蛋白诱
导的淋巴细胞增殖 [ 5] 。该研究主要探讨大青叶中 4(3H)喹
唑酮体外抗 H1N1型流感病毒的作用。
1　材料与方法
1.1　实验材料
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调查研究
1.1.1　药物　4(3H)喹唑酮 , 由中国农业科学院兰州畜牧
与兽药研究所农业部新兽药重点工程实验室提供 , 含量大于
85%。达菲(药物对照), 由中国农业大学提供 , 对 MDCK细
胞的最大无毒浓度为 100μmol。
1.1.2　病毒　H1N1型流感病毒(2337/A/甘肃城关 /1771/
2006),由甘肃省疾病预防控制中心提供。
1.1.3　细胞　犬肾细胞(MDCK), 由甘肃省疾病预防控制
中心提供。
1.1.4　细胞培养液 　细胞生长和维持液为 DMEM(Hy-
clone),加入胎牛血清 、双抗等。
1.2　仪器
CO2培养箱(SHELLAB)、倒置显微镜(奥林巴斯)、生物
安全柜(上海瑞仰净化装备有限公司)、酶标仪(热电上海仪
器有限公司)等。
1.3　实验方法
1.3.1　鸡胚中病毒的增殖　将 H1N1型流感病毒进行 10-4
稀释 , 0.2 mL/胚 , 接种到 9日龄鸡胚尿囊腔中 , 置孵箱中培
养 , 24 h检去死胚 ,活胚继续培养 , 72 h收毒 , 血凝滴度测定
为 1∶256。
1.3.2　4(3H)喹唑酮对 MDCK细胞的毒性试验　将 MDCK
接种于 96孔细胞培养板(每孔大约 104个细胞), 24 h长成
完整单层。将连续 2倍递次稀释的 4(3H)喹唑酮 10个浓度
(10-20 μg/mL)分别加入上述细胞培养板中 , 每浓度重复 8
孔 ,每孔 200 μL, 置 37 ℃孵育 72 h, 后观察细胞形态。细胞
出现融合 、圆缩 、脱落等现象者 ,为药物对该细胞有毒性。
1.3.3　H1N1流感病毒 TCID50的测定　用细胞维持液将
H1N1流感病毒连续 10倍递次稀释成浓度为 100 -10-10 , 分
别接种到已经长成完整单层 MDCK的 96孔细胞培养板中, 每
个浓度 8孔 ,每孔 100μL,置 37℃孵育 1 h后再加入 100 μL
的细胞维持液 , 置 37 ℃孵育 , 120 h后观察细胞形态 , 根据
Reed-Muench法计算病毒效价 TCID
50
。
1.3.4　4(3H)喹唑酮体外抗 H1N1型流感病毒试验　用
100TCID50的 H1N1流感病毒感染 MDCK细胞 , 设不同的实
验组 , 包括正常对照组 、阳性对照组 、药物对照组(达菲)和
4(3H)喹唑酮组(320、160、80、40、20μg/mL共 5个浓度组)。
实验采用 3种方式加药。 ①药物的直接作用(作用方式 Ⅰ ):
于 37 ℃先将病毒用药物预处理 2 h后再感染 MDCK细胞;
②先加药物后接种病毒 , 考察药物的阻断作用(作用方式
Ⅱ):药物先加入 MDCK细胞 37 ℃ 2 h后 , 再接种病毒;③先
接种病毒后加药物 , 考察药物已进入细胞病毒的抑制作用
(作用方式Ⅲ):将病毒先感染 MDCK细胞 37℃ 2h后 , 再加
入各浓度的药物。此后各组细胞于 37 ℃下继续培养 3 d, 当
病毒对照孔的细胞病变达 3+-4+(CPE达 75%至 100%)
时 ,进行 MTT染色 , 用酶标仪检测细胞在 492 nm的吸光度
(OD值)。
1.4　分析处理
通过观察记录各浓度的 4(3H)喹唑酮抑制 H1N1流感
病毒对 MDCK细胞的致病作用 , 即 CPE的变化 ,分析及计算
TCID50;应用 SPSS13.0ForWindows统计软件对实验结果数
据(酶标 OD值)进行统计学分析。
2　实验结果
2.1　4(3H)喹唑酮对 MDCK细胞的毒性实验结果
4(3H)喹唑酮在 320 μg/mL时 , 对 MDCK细胞无不良影
响 ,与正常对照组 MDCK细胞无明显区别 , 表明 4(3H)喹唑
酮在上述浓度下对 MDCK细胞无毒性作用。
2.2　H1N1型流感病毒 TCID50的测定结果
抗病毒实验的接毒量为 100TCID50 , H1N1流感病毒对
MDCK细胞的 TCID
50
为 10-4.59 /0.1 mL。
2.3　4(3H)喹唑酮体外抗 H1N1型流感病毒的作用结果
4(3H)喹唑酮体外抗 H1N1型流感病毒的结果见表 1。
表 1　4(3H)喹唑酮抗 H1N1型流感病毒的酶标结果(n=8)
组别
4(3H)喹唑酮 /μg· mL-1
20 40 80 160 320
达菲 /μmol
25 50 100
正常细胞
对照组
病毒
对照组
Ⅰ 0.549±0.028☆ 0.632±0.015 0.716±0.056 0.765±0.012 0.749±0.037 0.911±0.050 0.963 ±0.043 1.060 ±0.049
Ⅱ 1.027±0.017 1.264±0.032 1.319±0.051 1.347±0.038★ 1.454±0.045★ 1.201±0.018 1.310 ±0.053 1.464 ±0.039★
Ⅲ 1.336±0.035 1.383±0.034★ 1.451±0.046★ 1.462±0.041★ 1.465±0.052★ 1.356±0.044★ 1.421 ±0.031★ 1.483 ±0.010★
1.503 ±0.091 0.525±0.068
　　注:★表示与正常细胞对照组比较 P>0.05;☆表示与病毒对照组比较 P>0.05。除☆以外 ,所有组别的 OD平均值与病毒对照组比较 P<0.0001。
　　表 1结果显示 , 作用方式Ⅰ 中 , 20 μg/mL4(3H)喹唑
酮 OD平均值与病毒对照组相比无统计学差异 , 与正常细
胞对照组比较差异显著 , 40、80μg/mL4(3H)喹唑酮 OD平
均值与正常细胞对照组和病毒对照组相比均有统计学差
异;作用方式Ⅱ中 , 160、320 μg/mL4(3H)喹唑酮 OD平均
值与正常细胞对照组和药物对照(达菲)组相比无统计学
差异 , 且 4(3H)喹唑酮该 2药物浓度组与药物对照(达菲)
组的 OD平均值随浓度增加而增加 , 2个药物组的 OD平均
值与病毒对照组比较差异极显著;作用方式 Ⅲ中 , 40 -320
μg/mL4(3H)喹唑酮平均 OD值与正常细胞对照组和药物
对照(达菲)组相比无统计学差异 ,并呈现药效与剂量依赖的
关系 , 2个药物组的平均 OD值与病毒对照组比较差异极显
著。从作用方式来看 , 作用方式Ⅰ 与作用方式 Ⅱ 、Ⅲ之间差
异显著 ,作用方式Ⅱ与Ⅲ之间无统计学差异。
3　结论
该实验结果表明 ,将 4(3H)喹唑酮采用不同加药方式 ,
其抗 H1N1型流感病毒的作用各不相同 , 4(3H)喹唑酮对
H1N1型流感病毒直接作用不明显;但对病毒有明显阻断作
用和对进入细胞内病毒有抑制作用 , 且抗病毒效果随着浓度
的增加而增强。
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调查研究
　　根据上述实验结果 , 可以推断 4(3H)喹唑酮体外抗
H1N1型流感病毒的作用主要发生在阻止病毒吸附到靶细胞
和对其复制增殖过程的抑制 , 至于其抗此病毒的具体作用靶
点还有待进一步深入研究 。
参考文献:
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[ 4] FarghalyAM, ChaabanI, KhalilMA, etal.Non-ster-
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究 [ J] .药学学报 , 1994, 29(2):128-131.
Efectsof4(3H)quinazolinonefromIsatisindigoticaleavesagainstInfluenzavirusAinvitro
XUTao, YUSi-jiu, PUXiu-ying
(CollegeofVeterinaryMedicine, GansuAgriculturalUniversity, LanzhouGansu730070, China)
Abstract:Objective:Todiscusstheanti-viralefectsof4(3H)quinazolinonefromIsatisindigoticaleavesagainstinfluenza
virusAinvitro.Methods:Theinhibitioneffectsof4(3H)quinazolinoneagainstinfluenzavirusAbydifferentdrug-addedwaysin
vitrowereassayedbyMTTstainingmethod.Results:4(3H)quinazolinonefromleavesofIsatisindigoticashowedanobviouspre-
ventionandtreatmentefectsoninfluenzavirusAinvitrobyinhibitingviralproliferationandadsorbingtotargetcels.
Keywords:leavesofIsatisindigotica;4(3H)quinazolinone;InfluenzavirusA
银杏叶对小鼠抗炎镇痛作用的研究
冯保明 ,戚南山 ,宁康健
(安徽科技学院 ,安徽凤阳　233100)
　　摘　要:　目的:观察不同剂量银杏叶水煎醇沉液对小鼠的抗炎 、镇痛作用。方法:采用二甲苯诱导小鼠耳壳肿
胀法 , 50只小鼠随机均分 5组 ,分别为银杏叶水煎醇沉液腹腔注射高(10.0g/kg)、中(5.0 g/kg)、低(2.5 g/kg)剂
量组 , 空白对照组腹腔注射等量生理盐水 ,阳性对照组腹腔注射地塞米松(10 mg/kg),连续给药 6 d,测定小鼠耳
廓的肿胀率和肿胀抑制率;采用热板法测定小鼠的镇痛作用 , 取合格小鼠 100只随机均分 10组 ,分别为银杏叶水
煎醇沉液腹腔注射和水煎液灌胃高(10.0g/kg)、中(5.0 g/kg)、低(2.5 g/kg)剂量组 , 空白对照组腹腔注射和灌
胃等量生理盐水 , 阳性对照组腹腔注射和灌胃安乃近(20 mg/kg), 给药后 30 min测定小鼠的痛阈值的变化。结
果:腹腔注射银杏叶水煎醇沉液各剂量组小鼠耳廓肿胀率均低于生理盐水组(P<0.01),其肿胀抑制率以高剂量
组最高;与生理盐水组比较 ,腹腔注射银杏叶水煎醇沉液各个剂量组痛阈值均明显提高(P<0.01);灌胃给药高
剂量组有镇痛作用(P<0.01)。结论:银杏叶水煎醇沉液腹腔注射对小鼠具有较强的抗炎和镇痛作用 , 灌胃给药
镇痛效果相对较差。
　　关键词:　银杏叶;水煎液;水煎醇沉液;抗炎;镇痛;小鼠
　　中图分类号:S853.74　　　　 　文献标识码:A　　文章编号:1000-6354(2008)03-0009-03
　　银杏(GinkgoBilobaL.)又名白果 , 属银杏科银杏属植
物 ,是我国特有的古老树种之一 , 素有 “活化石”之称。银杏
叶是一种重要的药用 、保健食品原料 ,能治疗胸闷心痛 、心悸
怔忡 、痰喘咳嗽等症 [ 1] 。银杏叶提取物(EGB)是从银杏绿叶
中提取的一种复杂的产物 , 主要成分是多酚 , 特别是黄酮类
收稿日期:2007-11-26
基金项目:安徽省科技厅年度重点项目(06023087C)
作者简介:冯保明(1958-),男 , 实验师 ,主要从事兽医药理 、动物病
理学研究。
包括槲皮素甙和山奈素甙 [ 2] 。 EGB具有强的抗氧化作用 , 能
清除生物体内过剩的自由基 ,阻止体内脂质过氧化 , 提高机
体的免疫力 ,延缓衰老等。银杏叶制剂具有活血养心功效 ,
是预防和治疗心脑血管疾病的天然有效药物之一 [ 3] 。有关
其抗炎 、镇痛方面的研究鲜有报道。笔者等就银杏叶的抗
炎 、镇痛作用进行研究 , 旨在扩大其应用范围 , 为银杏叶的临
床应用提供试验依据。
1　材料与方法
1.1　动物
9