全 文 ：27 8
药 物 生 物 技 术
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e e u ti e al B i o tce hn o lo群 20 2 , 9 ( 5 ) : 27 8 一 2 8 0
硫酸醋化螺旋藻酸性多糖的气相色谱中
不同衍生化方法的比较
张 芳` , 尹鸿萍“ ,王吴, ,郑 琦, , 汪水娟“
( 1
. 中国药科大学生物制药学院 ,南京 21 0以刃 ; 2 .南京大学生物系 ,南京 21 仪为3
摘 要 为测定硫酸醋化螺旋藻酸性多糖单糖组成及摩尔比 ,并 比较不同的衍生化方法的优劣 ,先后采用
糖睛乙酸醋衍生 、 糖醇乙酸醋衍生及气相色谱同时测定醛糖和糖醛酸 3 种衍生方法 ,分别进行气相色谱分析 。
结果 硫酸酷化螺旋藻酸性多糖由甲基化鼠李糖 、 鼠李糖 、核糖 、 葡萄糖及半乳糖醛酸组成 ,其摩尔比为 4 : 6 . 5 : :2
3
: 1
。 糖睛乙酸酷衍生方法简单 、操作简便 ,糖醇乙酸醋衍生及气相色谱同时测定醛糖和糖醛酸 2 种方法定量结
果十分接近 。
关键词 多塘 ;气相色谱 ; 衍生
中图分类号 : 05 39 . 十 ;7 伽57 . 7 文献标识码 : A 文章编号 : 1以 )5 一 89 15( 2X() 2 ) 一 05 - (理78 一 03
硫酸醋化螺旋藻酸性多糖是从螺旋藻中提取
得到的水溶性杂多糖 , 为一种白色粉末状物质 ,对
人体无毒 ,是螺旋藻中抗肿瘤和抗辐射的重要生物
活性物质 , 此外还具有抗衰老 、 抗病毒 、 修复 D N A
损伤等功能 , 在实践应用上具有诱人的前景 〔’ 一 ’ 」。
硫酸醋化螺旋藻酸性多糖结构复杂 、生物活性多
样 ,疗效确切 ,因此有必要对其结构进行深人和全
面的研究 ,其中首先要确定的就是单糖的组成和摩
尔比 。
分析糖类的单糖组成及摩尔比 , 目前常采用气
相色谱法 , 但遇到的主要 困难是糖类本身挥发性
低 ,必须在气相色谱分析之前预先转化为易挥发 、
热稳性好的衍生物 。 本实验通过不同的柱前衍生
方法 ,进行硫酸醋化螺旋藻酸性多糖的定量分析 ,
并对不同的衍生方法进行优劣考察 。
司 ) , 可控硅控温水浴锅 (江苏南通嘉程仪器有限公
司 ) , 真空干燥箱 (上海实验仪器总厂 ) 。
1
.
2 试剂与药品
硫酸醋化螺旋藻酸性多糖 (玲 P ) : 本实验室 自
制
标准单糖 : 鼠李糖 (上海化学试剂公司 ) , 核糖
( iS gn
l a 公司 ) , 葡萄糖 (上海化学试剂公司 ) , 肌醇
(上海伯奥生物公司 ) ,半乳糖醛酸 ( is gn u 公司 ) 。
三氟乙 酸 、 毗陡 、 盐酸轻胺 、 醋酸醉 、 甲醇 、 盐
酸 、硼氢化钠 、醋酸 、碳酸钠 、正丙胺 、 二氯甲烷均为
分析纯试剂 ;强酸型阳离子交换树脂为上海化学试
剂采购供应站产品 。
方法
实验材料
1
.
1 仪器及测定条件
惠普 68 90 气相色谱仪 (HP 一 5% 苯甲基硅烷毛
细管柱 ( 3Om x 0 . 2 5m x 0
.
2 5脚 ) N Z 流速 : 恒流模
式 1 . 3而 /而 ;n 程序升温 : 1 10 ℃至 1抖℃ , 0 . 2℃ /而 ;n
1抖℃ 至℃ 126 , 3℃ /而 ;n 126 ℃ 至 2 80 ℃ , 10 ℃ j
m in
.
)
,循环水式真空泵 (郑州长城科工贸有限公
2
.
1 多糖水解
精密称取多糖样品 巧gm ,溶于 1 . 5血 Zmo l几 三
氟乙酸 ,充氮气封口 , 1 10 ℃油浴 h2 , 60 ℃减压蒸干 。
.2 2 衍生物的制备川
2
.
2
.
1 糖睛 乙酸醋衍生 在蒸干的多糖水解样中
加人 l o mg 盐酸轻胺 , 0 . 5耐 毗吮 , 90 ℃水浴 30 m in
并振荡 ,取出后冷却至室温 ,加人 o . s d 醋酸配 , 封
管 , 90 ℃下继续水浴反应 30 面 n ,使转变成糖睛乙酸
酷衍生物 ,反应产物直接取样进行气相色谱分析 。
收稿日期 : 2(X) 2 一 05 一 24
作者简介 : 张芳 , 197 3年生 ,女 ,河北省泊头市人 , 中国药科大学 2 (Xx ) 级硕士研究生 , 主要研究方向为微生物与生化药学。
联系人 : 尹鸿萍 , 中国药科大学微生物教研室 。 teI : (胆 5 ) 327 1108
张芳等 :硫酸醋化螺旋藻酸性多糖的气相色谱中不同衍生化方法的比较 2 7 9
2
.
2
.
2 糖醇 乙酸醋衍生 在蒸干的多糖水解样中
加人 30mg 硼氢化钠 , 2而 水 ,振荡使完全溶解后室
温放置 1 . h5 , 使单糖还原成相应的糖醇 。 滴人醋
酸分解过量的硼氢化钠 , 至无气泡产生为止 。 溶液
在 60 ℃下减压浓缩至干 ,加人 0 . 1% ( V/ v) 盐酸甲
醇溶液 Zd , 振荡后减压蒸发至干 , 重复 4 次 (加盐
酸甲醇并蒸干 ) 以彻底除去硼酸根 。 剩余物在
105 ℃烘箱中加热 巧而 n 以除去水分 。 加人 0 . 5而
毗陡和 0 . 5时 醋酸醉 , 封管后沸水浴反应 hl 使转
变成糖醇乙酸醋衍生物 , 反应物减压浓缩至干 ,将
剩余物用适量二氯甲烷溶解 ,离心除去不溶物 ,取
样进行气相色谱分析 。
2
.
2
.
3 气相色谱同时测定醛糖和糖醛酸囚 在蒸
干的多糖水解样用 1时 水溶解后 , 加人 20 1 0 . 5
m ol/ L碳酸钠 。 溶液于 30 ℃ 保持 45 而 n , 然后加人
4 % 的硼氢化钠溶液 0 . s iln , 室温放置 1 . hs , 滴加
25 % 乙酸至不产生气泡为止 , 以除去多余的硼氢化
钠 。 溶液通过 2时 强酸型阳离子交换柱 , 以 6时 水
洗脱 , 收集洗脱液 , 45 ℃ 真空蒸干 。 加人甲醇 3 iln
并蒸干以除去硼酸盐 ,重复 1次 。 85 ℃真空加热 h2
将醛糖转为内醋 ,残 渣溶于 l耐 毗陡中 , 5 ℃氮气
吹干 。 残渣分别加人 0 . 5耐 毗陡和 0 . 5而 醋酸配 ,
95 ℃加热 hl 。 反应产物减压蒸干 ,用适量二氯甲
烷将剩余物溶解后 , 离心除去不溶物 , 取样进行气
相色谱分析 。
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3 结果
3种衍生化方法的气相色谱图分别如图 l , 2 , 3
所示 。
由以上气相色谱图对照单糖标准品色谱图可
知 : 硫酸醋化螺旋藻酸性多糖由甲基化鼠李糖 、 鼠
李糖 、 核糖 、葡萄糖及半乳糖醛酸组成 ,经引人相对
校正因子并采用面积归一化法计算其摩尔比为 :4
6
.
5 : 2 : 3 : l
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4 讨论
( l) 本实验室前期通过薄层层析法初步鉴定了
此多糖的单糖组成 ,但在分析相互间比例时遇到了
一定困难 ,经糖睛乙酸脂衍生后的气相色谱图谱会
出现复杂的异构峰 ,难以定量 。
气相色谱分析主要是利用试样中各组分在色
谱柱气相和液相 间的分配系数不同而进行的。 同
种单糖经不同的衍生化处理后得到不同的衍生产
物 , 出现极性差异 ,保留时间发生较大变化 。
( 2 )糖睛乙酸酷衍生法操作简便 、周期短 ,适用
于分析多糖的单糖组成 , 但此方法会产生异构峰 ,
2 8 0 药 物 生 物 技 术 第 9卷第 5 期
常规的试剂和仪器 ,就可同时对杂多糖中的醛糖和
糖醛酸进行精确分析 ,且操作过程可控性好 , 结果
与糖醇乙酸脂衍生法的结果十分接近 。
参 考 文 献
王仲孚 ,彭雪梅 , 黄琳娟 , 等 . 钝顶螺旋藻缀合物 S p p A 一 1 的
糖链化学结构研究【J〕. 药学学报 , 20 1 , 36 ( 5) : 356 .
左绍远 ,罗华君 ,朱振宇 . 螺旋藻酸性多糖对糖尿病小鼠抗氧
化能力的影响 〔J」. 药物生物技术 , 2 (x 〕1 , 8 ( 1 ) : 36 .
左绍远 ,朱振宇 , 马洞泉 . 螺旋藻多糖 (璐P )对免疫功能的影
响 [ J 〕. 药物生物技术 , 19火 i , 3 ( 3 ) : 15 8 .
张惟杰主编 .糖复合物生化研究技术〔M 」. 杭州 : 浙江大学出
版社 . 1卯4 .
玫肠毛三】d J . iS n l t山出 1么 川 s 脚 一 il qu id e 】l r仪咫 t o g 月如ic d e 妇” , n l n iat ,
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定量时不宜采纳 。 另外 , 目前大多文献在用此方法
衍生 时 , 多在 90 ℃进行 , 但笔者在多次实验后发
现 ,将衍生温度降至 85 ℃时 ,可成功避免试剂空白
峰的出现 。
( 3) 糖醇乙酸脂衍生法操作繁琐 ,周期长 ,但是
色谱分析时每种糖均可得到单峰 , 与糖醇乙酸脂衍
生法相 比 ,不产生衍生异构体 ,且操作可重复性强 ,
适用于单糖的定量 。
( 4 )糖醛酸在多种动物 、植物 、细菌体内普遍存
在 ,酸性多糖中一般均含有糖醛酸 , 多糖水解产物
的分析往往由于糖醛酸的存在而变得复杂 ,而且一
直没有一种可简便 、 精确地进行糖醛酸定量的方
法 ,从而使得糖醛酸的鉴别和定量成为多糖研究中
的难点。 目前常用的糖醛酸定量方法有 :硫酸 一 咔
哇法 、地衣酚 一 盐酸法及间经联苯 一 四硼酸钠法等
比色法 ,但仅能进行总量测定 ,无法对其中的糖醛
酸种类加以鉴别 , 而且对不同的糖醛酸成色率常有
较大差异 ,地衣酚 一 盐酸法还容易受样品中戊糖及
中性糖的干扰 。 L 犯ar d川等人采用碳化二亚胺试剂
和硼氢化钠将糖醛酸还原为糖醇 ,然后测定还原前
后糖醇种类和含量的变化 ,从而推算出糖醛酸的种
类和含量 。 作者借鉴 了 lhe 晚 dI 的方法 ,仅用相对
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